CN101638645A - 一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法 - Google Patents

Abstract

一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法，它包括菌种培育、制备种子悬浮液、固态发酵、干燥和粉碎工艺，制得木聚糖酶。本发明解决了传统固态发酵易污染、传热和传质困难、发酵过程参数无法控制等技术难题。通过诱变育种，使固态发酵木聚糖酶活力达到8万单位/克以上，酶活力为国内同类产品4倍左右，优于国内外其它采用霉菌生产木聚糖酶的工艺。本发明用于30t发酵罐，可连续稳定生产，发酵酶活2500U/mL，固体酶活力≥100000U/g，发酵周期在18h，发酵成功率达到99％，酶活收率≥87％。采用价格低廉的农副产品作为发酵原料，原料成本降低50％，适合大批量工业化生产。

Description

一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法

技术领域

本发明涉及一种木聚糖酶的制备方法，特别是采用固态机械法生产的方法。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要成分，后者是植物性纤维材料的重要组成成分之一，每年地球上植物光合作用所产生的巨大资源，约有三分之一是半纤维素。木聚糖结构为4-木糖苷键连接的木糖聚合物，大多数木聚糖链都含有其它糖基作为侧链，根据侧链上连接的糖基可以决定这种多糖分子是酸性的还是中性的。中性木聚糖的侧链常常是单个L-阿拉伯呋喃糖或它的短链所组成，而含一个甲氧基的C-4上的D-葡萄糖醛酸则常常是酸性木聚糖的侧链。由于木聚糖酶在食品、酿酒、饲料添加剂及造纸工业上的广泛应用，目前国内外都非常关注这方面的研究，这主要是利用微生物的液体发酵或固体发酵来生产酶。国外研究所涉及的微生物主要有霉菌、放线菌和细菌等。如巴西的R.C.Simao等利用Aspergillus tamarii所得的木聚糖活力为120u/ml；奥地利的Alois Sachslehner等利用Sckrotium rolfsill生产木聚糖酶、产酶活力达104u/mi；加拿大的A.W.Khan利用细菌和真菌的培养物得到的酶活达104u/ml；印度的A.Archana和T.Satyanarayana利用Thermophilic Bacilluslicheniformis A99固体发酵，酶活力达19.13ug-1DBB(dry bacterial bran)；法国的P.L.pham等人利用Bacillu sp.产酶活力达2388nkat/ml(1nkat定义为特定条件下酶催化底物每秒钟产生的1nmol)。最近几年的资料表明国外的研究重点是细菌，并通过各种耐酸、耐碱、耐高温细菌来发展耐酸、耐碱、耐高温的木聚糖酶，拓宽木聚糖酶的应用范围。

近年来有关木聚糖酶的研究也有较多论文发表，有人利用黑曲霉(Aspetgillusniger)An-76菌株，所产木聚糖酶活力达353.61u/ml；也有人用黑曲霉A3菌株固体发酵，得到的固体酶粉活力达153951u/g；还有人利用芽孢杆菌L23，所得酶活力为301u/ml。

除此之外，另有人利用木聚糖酶基因克隆和表达，获得一些高产菌株，例如Whitehead应用大肠杆菌一类固体穿梭载体PVAL-1将栖瘤拟杆菌木聚糖酶基因转入脆弱拟杆菌或单形拟杆菌，转化子产生的酶活力比原菌株高出1400倍。Suominen等将木聚糖酶基因与具高产纤维素酶性能的瑞氏木霉突变株ALK0233基因重组，使其失去编码纤维素酶的作用，但仍然保留着高蛋白产生功能，从而得到了高产木聚糖酶的菌株。

酶制剂在医药、食品、皮草等行业有着广泛的应用，以饲料行业为例，酶制剂添加剂可以提高内源酶不能作用的多糖和蛋白质的利用率；打破饲料中不能被内源酶分解的特定化学链，得到更多的营养物质；可以克服幼年动物由于内源酶产生不足所引起的消化不良；还可以降解许多饲料中的抗营养因子，增加饲料的营养价值。而木聚糖酶制剂则是这类酶制剂中重要的一种。有研究表明，在猪的日粮中添加0.05％的木聚糖酶制剂，观察木聚糖酶制剂对40％次粉日粮20-57Kg生长育猪的饲养效果，结果发现，实验组比对照组日增重提高8.1％，饲料转化率提高4.3％，每公斤增重饲料成本降低3.2％。另有研究在小麦或燕麦为基础的饲料中添加木聚糖酶和β一葡聚糖酶，结果饲料转化率分别提高了6.2％和23％。还有的在鸡的饲料中添加0.5％的木聚糖酶和0.2％的β-葡聚糖酶，可以提高日增重达7％～10％，降低饲料消耗3％～14％。大麦、黑麦中的抗营养因子(ANF)主要是阿拉伯木聚糖，而木聚糖酶能水解其中的阿拉伯木聚糖，降低动物肠道食糜粘度，使养分利用率提高，所以现在木聚糖酶在饲料行业中的应用已经相当广泛，并面临着更广阔的前景。在欧洲以木聚糖酶为主的酶制剂占到了饲料行业酶制剂消耗量的40％。

但总起来说，目前研发的固态发酵木聚糖酶的活力不高，酶对热和环境因子的适应性不强，不稳定，容易在加工或使用中失活，另外，生产成本高，容易染菌，高污染，也是当前酶制剂生产中存在的一个比较普遍的问题。

发明内容

本发明的目的是克服上述已有技术之缺陷而提供一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法。

本发明的目的是以如下技术方案实现的：

一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法，它包括菌种培育、制备种子悬浮液、固态发酵、干燥和粉碎工艺，各工序按如下步骤进行：

a.菌种培育：出发菌株采用黑曲霉菌，采用平板透明圈及测酶活力的方法，从待测菌株中选出生产良好且产酶活力高的菌株；

b.配制培养基

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基/PDA培养基；

固体发酵培养基的配制，原料采用麸皮、玉米芯粉、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄.7H₂O、K₂HPO₄以及水，各原料按质量单位份计为：麸皮80；玉米芯20；(NH₄)₂SO₄1.5；MgSO₄.7H₂O 0.15；K₂HPO₄0.2；水100～200；pH为5.0。

C.灭菌器灭菌、物料输送至固体发酵器中

木聚糖酶的生产首先在灭菌器内进行灭菌，将清洗后空消(灭菌设备在未装物料之前空罐先杀菌消毒)的灭菌器内放底水50升，搅拌，投入培养基物料后锁紧罐盖，通入空气，将罐压升至1.3-1.6kg/cm²，温度120-125℃时保持40分钟，降温至80℃以下；

灭菌后的物料由无菌管道输送到固体发酵器中发酵，搅拌，使物料均匀摊铺于筛盘表面，风冷，降温，温度达到28～30℃；

d.接种

物料达到工艺要求温度后，停止通风，将种液喷洒到物料表面，经筛盘翻搅，物料全面均匀接触种液，停止翻搅；利用摊刮出料机构使物料平整摊铺在筛盘表面，使物料温度一致、发酵菌体生长一致；

e.静止培养、发酵

随时监测发酵品温，观察生长情况；控制发酵器内温度在28～30℃；喷洒补水保持物料含水量在60％左右；在生长旺盛期，生物热高时启动筛盘、翻搅工作，降低品温。

f.干燥、粉碎

达到工艺生长要求，发酵结束，打开出料门，转动筛盘，启动出料机构，使物料从出料门均匀排出；发酵后的物料进行干燥，使含水量低于8％；干燥后的物料进行粉碎，粉碎粒径在2毫米。

上述固态机械发酵生产木聚糖酶方法，在菌种培育工序，将选出的菌株进行诱变育种：

a.以筛选出来的高产菌株为出发菌株，在生长良好的纯种斜面中加入10ml无菌水，洗下孢子，移入装有玻璃珠和190m无菌水的三角瓶中，震荡，将孢子充分散开，用脱脂棉过滤至另一无菌三角瓶中，用血球计数板计数，依次稀释，调整孢子浓度为10⁶个/ml；

b.诱变处理：取10ml孢子悬液于φ90培养皿中，置于诱变箱的磁力搅拌器上，照射时间分别为0.05分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、6分钟、8分钟，各取1ml处理液经稀释后，以每平板10-12菌落为宜，置于平皿中；

C.倾注法分离：取各种稀释浓度的孢子悬液各0.5ml，(一般为5种左右浓度的孢子悬液进行分离)，分别置于平皿中，待培养基冷至45-50℃，迅速注入平皿，摇匀，以使菌落分散；

d.长出菌落以后，将单个菌落分别挑到斜面上；

e.将各斜面菌株利用摇瓶液体发酵后，测其酶活力，选出产酶活力高的菌株即为所需生产菌种。

上述固态机械发酵生产木聚糖酶方法，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，其接种量选择为10％。

上述固态机械发酵生产木聚糖酶方法，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，其发酵温度选择为28℃。

上述固态机械发酵生产木聚糖酶方法，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，物料层厚度选择为20-25cm。

本发明采用固态机械发酵法，该方法与液态法、及通常固态法不同，它采用固态原料进行固态发酵生产木聚糖酶，从配备物料开始全程采用机械自动化进行生产操作。物料从进入高温灭菌设备开始，就在全封闭、连续化、无菌状态下输送和发酵，所以生产过程染菌率极低，产品质量好、活性高、成本低。本发明解决了传统固态发酵易污染、传热和传质困难、发酵过程参数无法控制等技术难题。通过诱变育种，使固态发酵木聚糖酶活力达到8万单位/克以上，酶活力为国内同类产品4倍左右，优于国内外其它采用霉菌生产木聚糖酶的工艺。本发明采用细菌深层发酵生产食品级木聚糖酶，用于30t发酵罐，可连续稳定生产，发酵酶活2500U/mL，固体酶活力≥100000U/g，发酵周期在18h，发酵成功率达到99％，酶活收率≥87％。采用价格低廉的农副产品作为发酵原料，原料成本降低50％，适合大批量工业化生产。本发明所生产的木聚糖酶应用于草粉粗纤维降解，粗纤维的含量比对照普通木聚糖酶降低了3.24％；提高了饲料利用率，喂养奶牛试验表明，每天每头奶牛比对照组平均增加产奶0.57千克，乳脂率提高0.13％，每头奶牛全年可增加收益约356.85元；将其用于酒精浓醪发酵，发酵酒精浓度提高1.16度，出酒率提高3.06％。

具体实施方式

a.菌种培育：出发菌株：黑曲霉S13(Aspergillus niger S13(原始的菌株代号))。黑曲霉是半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科曲霉属真菌中的一个常见菌种。分生孢子梗自基质中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。常引起粮食和其他工业器材霉变。

筛选高产菌株：

采用平板透明圈及测酶活力的方法，从待测菌株中选出生产良好且产酶活力高的菌株。

诱变育种：

(1)以筛选出来的高产菌株为出发菌株，在生长良好的纯种斜面中加入10ml无菌水，洗下孢子，移入装有玻璃珠和190m无菌水的三角瓶中，震荡，将孢子充分散开，用脱脂棉过滤至另一无菌三角瓶中，用血球计数板计数，依次稀释，调整孢子浓度为10⁶个/ml。

(2)诱变处理：取10ml孢子悬液于φ90培养皿中(带磁棒)置于诱变箱的磁力搅拌器上，照射时间分别为0.05分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、6分钟、8分钟，各取1ml处理液经稀释后(每平板10-12菌落为宜)，置于平皿中。本工序主要采用的设备是离子注入机和诱变箱。

(3)倾注法分离：取5种稀释浓度的孢子悬液各0.5ml，分别置于平皿中，待培养基冷至45-50℃，迅速注入平皿，摇匀，以使菌落分散。

(4)长出菌落以后，将单个菌落分别挑到斜面上。

(5)将各斜面菌株利用摇瓶液体发酵后，测其酶活力，选出产酶活力高的菌株。

具体操作如下：

将生长良好的菌株，接入霉菌产酶培养基中。观察其中的DWC、Rutc两株纤维素酶高产菌株发酵期长，需五天，其他各菌均发酵两天，其中黑曲霉A7及黑曲霉S13长势最好，发酵两天后，菌丝已布满培养基表面并有少量孢子生成，其余各菌生长情况各异。用DNS法测酶活，列表如下：

表1霉菌固态发酵产木聚糖酶情况

-差  +一般  ++较好  +++旺盛  带*者  发酵五天

从表1可得出-高产菌株S 13，并以它为出发菌株，进行诱变育种。

诱变致死率的计算

紫外线的照射时间对细胞致死率的影响，见表2：

表2紫外线照射时间对细胞致死率的影响

诱变后高产菌株的筛选

根据菌落形成的透明圈大小，从不同的平皿中挑出30上体菌于斜面上，将它们分别接入产酶培养基固态发酵，发酵3天，测酶活，结果见表3：

表3紫外诱变后木聚糖高产菌株的筛选

+一般  ++较好  +++旺盛

结果发现，紫外照射0.5分钟诱变后的各菌株相对未诱变的菌株，酶活力的均有不同程度的提高，酶活力达到75126.3u/g，其中，编号s13-15呈产酶活力最高，因此，选为生产菌株。

生产木聚糖酶的主要接续工艺流程为：

灭菌器灭菌、无菌输料、通风降温、接种、静止发酵、静止培养、出料、干燥、粉碎；主要设备为灭菌器和固体发酵器。

b.配制培养基

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基/PDA培养基；

分离培养基(g/L)的配制：木聚糖20，NaNO₃ 3，K₂HPO₄ l，MgSO₄.7H₂O 0.5，KCI0.5，FeSO₄ 0.01，琼脂20，Ph为5.0。

固体发酵培养基的配制，原料采用麸皮、玉米芯粉、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄.7H₂O、K₂HPO₄以及水，各原料按质量单位份计为：麸皮80；玉米芯20；(NH₄)₂SO₄1.5；MgSO₄.7H₂O 0.15；K₂HPO₄0.2；以及水，100～200；pH为5.0。

C.灭菌器灭菌、物料输送至发酵器中

木聚糖酶的生产在灭菌器内进行，将清洗后空消(灭菌设备在未装物料之前空罐先杀菌消毒)的灭菌器内放底水50升，开搅拌，投入培养基物料后锁紧罐盖，开启罐顶排气节门少许后打开罐底进气节门，同时进气，待罐压升至1.3-1.6kg/cm²，温度120-125℃时保持40分钟，降温至80℃以下。

灭菌后的物料由无菌管道输送到发酵器中，搅拌，使物料均匀摊铺于筛盘表面，风冷使物料迅速降温，温度达到28～30℃。

d.接种

物料达到工艺要求温度，停止通风，将种液喷洒到物料表面，在筛盘翻搅作用下，物料全面均匀接触种液，达到要求停止喷洒种液，停止翻搅。利用摊刮出料机构使物料平整摊铺在筛盘表面，这样就可以达到物料温度一致，发酵菌体生长一致的效果，达到要求后停止筛盘和摊刮机构工作。

e.静止培养、发酵

按工艺要求随时监测发酵品温，观察生长情况。通过鼓引风通风降温启动换热器升温，达到控制发酵器内温度的目的；喷洒补水保持物料含水量；在生长旺盛期，生物热高时启动筛盘、翻搅工作，降低品温。

f.干燥、粉碎

达到工艺生长要求，发酵结束，打开出料门，转动筛盘，启动出料机构，使物料从出料门均匀排出。发酵后的物料需要进入干燥工序进行干燥，要求含水量低于8％。干燥在汽流干燥设备中进行，对于产能在150KG/H的设备，可选择其蒸发量在600KG/H.。干燥后的物料需要粉碎，可选择500型粉碎机，粉碎粒径在2毫米。

1.种子罐发酵时间的确定

微生物的生长可分为：延迟期、对数期、稳定期及衰老期四个阶段。当接入对数期的种子，菌体以几何级数增长，代谢旺盛，生长迅速，这样可以缩短延迟期，利于产酶。

种龄为12～24小时时，菌体处于延迟期或对数生长前期，接入固体发酵器后，菌体生长相对缓慢，所以发酵两天后表现出产酶活力低；种龄为36小时时菌体处于对数生长期，接入固体发酵器后生长迅速，表现出产酶活力高；种龄为48小时以上时，菌体过分生长，相对老化，在固体发酵器中则生长慢，产酶活力低，所以种子罐培养时间定为36小时。

2.接种量对S13-15产木聚糖酶的影响

接种量也对S13-15产酶有影响，为使菌体在固体发酵器中生长适量而产酶活力高，必须确定一个合适的接种量，接种量为5％时，菌体生长量偏少，产酶活力也相应较低；接种量为10％时，菌体生长旺盛，产酶活力最高；而当接种量为15％时，菌体生长过于旺盛，营养物质相对缺乏，导致产酶活力反而低，因此，选择接种量为10％。

3.温度对S13-15产酶的影响

控制固体发酵器温度偏低，菌体生长较慢，产酶活力较低：28℃时最为合适，菌体生长良好，产酶达到最高；而超过28℃，菌体生长过于迅速，同时发酶过程中的酶也因较高的温度而消耗较快，导致酶活力不高，所以选择在28℃温度时发酵较为合适。

4.通气量对S13-15产酶的影响。

黑曲霉S13-15是需氧生长，如果发酵过程物料中溶氧浓度太低，则会抑制菌体的生长繁殖，进而影响菌体产酶；而溶氧量过高，则会导致菌体过度生长，加剧菌体的老化，降低产酶量。因而合适的溶氧量将对菌体生长及木聚糖酶的分泌是十分有利的。控制固体发酵罐物料厚度可以达到控制通气量的目的，料层薄时，通氧量大，菌体老化，酶活力低；料层过厚时，由于装料量大，物料透气性差，固体发酵料表面和内部溶氧量相对较低，从而使得菌体生长受到一定的抑制，产酶也不高；而装料量为20-25cm厚时，产酶活力达到最高。所以选择装料量为20-25cm。

5固态发酵木聚糖酶发酵周期的确定

菌体的生长与它的木聚糖酶的分泌密切相关。菌体生长过少会则产酶少，但如果菌体过于旺盛地生长，以致老化，也会使酶活力降低，为确定一个最佳的发酵周期，固定其它发酵条件，在固态发酵12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时的时候分别取样测PH值及酶活力，其结果见表3-8：

表4发酵时间对酶活的影响

时间(h)	pH	酶活(U/g)
			0	5.82	0
12	5.78	1138.1
			24	5.14	4523.2
36	5.02	16675.3
			48	4.96	38599.6
60	2.89	63219.9
			72	2.89	81430.8
84	2.83	81317.9
			96	2.81	80295.3

从表4不同发酵时间酶活力测定结果中可以看到，在发酵72-84小时时酶活力达到最大，因此发酵周期可以控制在72-84小时。

6.固态机械发酵工艺参数的选择

黑曲霉S13-15固态发酵的产酶工艺条件为：碳源物料含量40％(其中麸皮25％)，NH₄NO₃添加量4％，起始pH为6，种龄36小时，接种量10％，装料量25cm厚度，发酵温度28℃，发酵时间72-84h。在此基础上连续五批次发酵生产，产品初步检测结果如表5，从表中可见固态发酵木聚糖酶活力基本稳定在82000-83000U/g。

表5连续五批次固态发酵生产木聚糖酶结果

Claims (5)

1.一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法，其特征在于，它包括菌种培育、制备种子悬浮液、固态发酵、干燥和粉碎工艺，各工序按如下步骤进行：

a.菌种培育：出发菌株采用黑曲霉菌，采用平板透明圈及测酶活力的方法，从待测菌株中选出生产良好且产酶活力高的菌株；

b.配制培养基

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基/PDA培养基；

固体发酵培养基的配制，原料采用麸皮、玉米芯粉、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄.7H₂O、K₂HPO₄以及水，各原料按质量单位份计为：麸皮80；玉米芯20；(NH₄)₂SO₄ 1.5；MgSO₄.7H₂O 0.15；K₂HPO₄ 0.2；水100～200；pH为5.0。

C.灭菌器灭菌、物料输送至固体发酵器中

木聚糖酶的生产首先在灭菌器内进行灭菌，将清洗后空消的灭菌器内放底水50升，搅拌，投入培养基物料后锁紧罐盖，通入空气，将罐压升至1.3-1.6kg/cm²，温度120-125℃时保持40分钟，降温至80℃以下；

灭菌后的物料由无菌管道输送到固体发酵器中，搅拌，使物料均匀摊铺于筛盘表面，风冷，降温，温度达到28～30℃；

d.接种

物料达到工艺要求温度后，停止通风，将种液喷洒到物料表面，经筛盘翻搅，物料全面均匀接触种液，停止翻搅；利用摊刮出料机构使物料平整摊铺在筛盘表面，使物料温度一致、发酵菌体生长一致；

e.静止培养、发酵

随时监测发酵品温，观察生长情况；控制发酵器内温度在28～30℃；喷洒补水保持物料含水量在60％左右；在生长旺盛期，生物热高时启动筛盘、翻搅工作，降低品温。

f.干燥、粉碎

达到工艺生长要求，发酵结束，打开出料门，转动筛盘，启动出料机构，使物料从出料门均匀排出；发酵后的物料进行干燥，使含水量低于8％；干燥后的物料进行粉碎，粉碎粒径在2毫米。

2.根据权利要求1所述的固态机械发酵生产木聚糖酶方法，其特征在于，在菌种培育工序，将选出的菌株进行诱变育种：

a.以筛选出来的高产菌株为出发菌株，在生长良好的纯种斜面中加入10ml无菌水，洗下孢子，移入装有玻璃珠和190m无菌水的三角瓶中，震荡，将孢子充分散开，用脱脂棉过滤至另一无菌三角瓶中，用血球计数板计数，依次稀释，调整孢子浓度为10⁶个/ml；

b.诱变处理：取10ml孢子悬液于φ90培养皿中，置于诱变箱的磁力搅拌器上，照射时间分别为0.05分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、6分钟、8分钟，各取1ml处理液经稀释后，以每平板10-12菌落为宜，置于平皿中；

C.倾注法分离：取5种浓度稀释度的孢子悬液各0.5ml进行分离，分别置于平皿中，待培养基冷至45-50℃，迅速注入平皿，摇匀，以使菌落分散；

d.长出菌落以后，将单个菌落分别挑到斜面上；

e.将各斜面菌株利用摇瓶液体发酵后，测其酶活力，选出产酶活力高的菌株即为所需生产菌种。

3.根据权利要求2所述的固态机械发酵生产木聚糖酶方法，其特征在于，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，其接种量选择为10％。

4.根据权利要求3所述的固态机械发酵生产木聚糖酶方法，其特征在于，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，其发酵温度选择为28℃。

5.根据权利要求4所述的固态机械发酵生产木聚糖酶方法，其特征在于，所述灭菌后的物料输送到固体发酵器中发酵时，物料层厚度选择为20-25cm。