CN106381273B

CN106381273B - 一株高产木聚糖酶的黑曲霉菌株

Info

Publication number: CN106381273B
Application number: CN201510453842.7A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 刘文瑶; 徐娟; 王华明
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang KDN Biotechnology Co., Ltd.; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2035-07-29
Also published as: CN106381273A

Abstract

本发明提供了一种黑曲霉突变株，其保藏编号为CCTCC NO:M2015475。本发明通过紫外诱变的方法筛选到一株高产木聚糖酶的黑曲霉突变菌株。该突变菌株的发酵上清液中木聚糖酶活力高达2014u/ml，比出发菌提高了55%，蛋白表达量为0.48g/L，比出发菌提高了45.5%，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的生产，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进木聚糖酶在饲料领域中的推广与应用。

Description

一株高产木聚糖酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产木聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其应用。

技术背景

木聚糖(xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物质重的15％-30％，在裸子植物中占干物质重的7％-12％。但木聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。

大多数木聚糖酶的最适作用pH值在6-7范围内。但酸性木聚糖酶(pH4.0以下时仍保持较高酶活性)已经引起人们的广泛关注。酸性木聚糖酶在饲料行业中的应用，可以有效地破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用。目前，虽然酸性木聚糖酶在饲料行业中的的应用已十分广泛，但由于其发酵酶活水平依然不高，限制着生产成本的降低。因此，如何大幅度提高酸性木聚糖酶生产菌种的发酵水平仍是研究的重点和难点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产木聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其应用。申请人将来源于绳状青霉(Penicillium funiculosum)的木聚糖酶基因转化入黑曲霉(Aspergillus niger)宿主细胞中，构建得到一株能重组表达木聚糖酶的黑曲霉工程菌；然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株高产木聚糖酶的突变菌株，能大幅度提高木聚糖酶的表达量。

本发明一方面涉及一种黑曲霉工程菌，其携带有能表达木聚糖酶的表达载体。

所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面涉及一种黑曲霉突变株，为黑曲霉Su-Y12(Aspergillus nigerSu-Y12)，已于2015年7月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015475。

本发明还涉及上述黑曲霉突变株在木聚糖酶生产中的应用。

本发明通过紫外诱变的方法筛选到一株高产木聚糖酶的黑曲霉突变菌株。该突变菌株的发酵上清液中木聚糖酶活力高达2014u/ml，比出发菌提高了55％，蛋白表达量为0.48g/L，比出发菌提高了45.5％，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的生产，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进木聚糖酶在饲料领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pGAU图谱；

图2为黑曲霉菌株发酵液SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为黑曲霉宿主细胞，泳道2为黑曲霉Su-X发酵上清液；箭头所指出的蛋白条带即为重组表达的木聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1木聚糖酶基因的获得

根据公共基因数据库中基因序列的记载，申请人优化了合成基因的密码子并人工合成木聚糖酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。申请人将该木聚糖酶基因命名为Xyl。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGAAGCTCTTCCTGGCTGCCA

引物2(R)：TTAGCTGACAGTGATGGTGCTG

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，Xyl基因大小为672bp。

实施例2重组载体的构建

PCR扩增上述木聚糖酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GCTCTAGAATGAAGCTCTTCCTGGCTGCCA

引物4(R)：GCTCTAGATTAGCTGACAGTGATGGTGCTG

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，Xyl基因为大小672bp的片段。

将上述获得的木聚糖酶Xyl基因片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有木聚糖酶Xyl的重组载体pGAU-Xyl。

实施例3木聚糖酶Xyl的重组表达

原生质体制备：接种黑曲霉(Aspergillus niger)宿主菌于PDA+U平板(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U培养基(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)中，30℃培养24h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

转化：将上述获得的黑曲霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中加入10ul准备好的重组载体pGAU-Xyl，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(麦芽糖12％；豆饼粉0.85％；玉米浆1％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果如图2所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的木聚糖酶。将获得的阳性转化子的发酵上清液分别进行木聚糖酶酶活力测定，最终筛选出一株木聚糖酶表达量最高的黑曲霉工程菌，命名为黑曲霉Su-X(Aspergillus niger Su-X)，其发酵上清液中木聚糖酶活力为1300u/ml，蛋白表达量为0.33g/L。

(1)木聚糖酶酶活单位的定义

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值A_E。

酶活计算公式：

式中：X_D为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；A_E为酶反应液的吸光度；A_B为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C₀为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。

实施例4木聚糖酶高产菌株的诱变筛选

确定致死率：将上述黑曲霉Su-X接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度约为1×10⁷个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体156个接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基(麦芽糖12％；豆饼粉0.85％；玉米浆1％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液。通过对获得的粗酶液进行蛋白电泳检测及木聚糖酶酶活力检测，申请人最终筛选出一株木聚糖酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉Su-Y12(Aspergillus niger Su-Y12)，该菌株发酵上清液木聚糖酶活力高达2014u/ml，蛋白表达量为0.48g/L，比出发菌分别提高了55％和45.5％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2015年7月29日将突变菌株黑曲霉Su-Y12(Aspergillus niger Su-Y12)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015475。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株高产木聚糖酶的黑曲霉菌株

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 绳状青霉（Penicillium funiculosum）

<400> 1

Met Lys Leu Phe Leu Ala Ala Ile Val Leu Cys Ala Thr Ala Ala Thr

1 5 10 15

Ala Phe Pro Ser Glu Leu Ala Gln Arg Ala Ala Gly Asp Leu Ser Lys

20 25 30

Arg Gln Ser Ile Thr Thr Ser Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr

35 40 45

Tyr Ser Phe Trp Thr Asn Gly Gly Gly Glu Val Thr Tyr Thr Asn Gly

50 55 60

Asp Asn Gly Glu Tyr Ser Val Thr Trp Val Asp Cys Gly Asp Phe Thr

65 70 75 80

Ser Gly Lys Gly Trp Asn Pro Ala Asn Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ser

85 90 95

Gly Glu Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp

100 105 110

Thr Thr Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Leu Glu Ser Tyr Gly Thr

115 120 125

Tyr Asn Pro Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Gly Gln Val Thr Ser Asp

130 135 140

Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Ser Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser

145 150 155 160

Ile Glu Gly Thr Ser Thr Phe Asn Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Glu

165 170 175

Lys Arg Val Gly Gly Thr Val Thr Thr Ala Asn His Phe Ala Ala Trp

180 185 190

Lys Ala Leu Gly Leu Glu Met Gly Thr Tyr Asn Tyr Met Ile Val Ser

195 200 205

Thr Glu Gly Tyr Glu Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser

210 215 220

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 绳状青霉（Penicillium funiculosum）

<400> 2

atgaagctct tcctggctgc catcgtcctc tgcgctaccg ccgctactgc cttcccctcc 60

gagctggccc aacgagctgc cggcgacctc agcaagcgcc agagcatcac caccagccaa 120

accggcacca ataacggcta ctactacagc ttttggacca atggcggtgg cgaggttact 180

tacactaacg gcgataatgg cgagtacagc gtcacctggg tcgactgtgg cgacttcacc 240

tccggcaaag gctggaaccc tgccaacgcc cagaccgtca cttacagcgg cgaattcaac 300

ccttccggta acgcctatct cgctgtctac ggctggacca ccgaccccct cgtcgagtac 360

tacatcctcg aaagctacgg tacttataac ccctccagcg gcctgacctc cctgggccaa 420

gtcactagcg acggtggcac ctacgacatt tactccaccc agcgcgtcaa ccagcccagc 480

atcgagggca ccagcacctt caaccaatac tggagcgtcc gcaccgagaa gcgcgttggt 540

ggcaccgtta ctaccgctaa ccacttcgct gcctggaagg ccctcggcct cgagatgggc 600

acctacaact acatgatcgt cagcactgag ggctacgaga gctccggtag cagcaccatc 660

actgtcagct aa 672

Claims

1.一种黑曲霉突变株，其特征在于，所述的黑曲霉突变株的保藏编号为CCTCC NO：M2015475。

2.权利要求1所述的黑曲霉突变株在木聚糖酶生产中的应用。