CN104560920B - 一种酸性木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

一种酸性木聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种酸性木聚糖酶突变体及其应用，即通过对绳状青霉的木聚糖酶进行大量突变的筛选，发现N104D、T128G、Y129Q这三个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高。本发明提供的野生型木聚糖酶XynH2的最适反应温度为50℃，而突变体XynH2‑1和XynH2‑2的最适反应温度为55℃，突变体XynH2‑3的最适反应温度高达60℃，而且，在高于53℃条件下，三个突变体的相对酶活水平均显著高于野生型；65℃处理5min后，野生型木聚糖酶XynH2的酶活残留率仅为5％；而木聚糖酶突变体XynH2‑1、XynH2‑2、XynH2‑3的酶活残留率分别为20％、35％、46％，从而说明本发明筛选到的木聚糖酶突变体的耐热性均得到显著提高。

Description

一种酸性木聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种酸性木聚糖酶突变体及其应用。
技术背景
木聚糖(xylan)是半纤维素的重要组分，广泛存在于自然界中，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖。在裸子植物中占干物质重的7％-12％，在被子植物中木聚糖占干物质重的15％-30％。但木聚糖在动物的消化道内不能被消化和吸收，具有很强的抗营养作用，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在造纸、饲料、食品、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。
迄今为止发现的大多数木聚糖酶最适作用pH值在6-7范围内，关于酸性木聚糖酶的报道比较少。近几年对酸性木聚糖酶(pH4.0以下时仍保持较高酶活性)的开发已经引起人们的广泛关注，对于酸性木聚糖酶的生产、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用等方面的研究正在不断深入。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸性木聚糖酶突变体及其应用，即通过对来源于绳状青霉(Penicillium funiculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了耐热性显著提高的突变体，有利于其在饲料领域的广泛应用。
申请人对绳状青霉的木聚糖酶进行突变，经过大量的筛选，发现N104D、T128G、Y129Q这三个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高，从而促成本发明。
本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶的第128位氨基酸由Thr变为Gly。
上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ IDNO：4。
本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：4的木聚糖酶突变体的质粒。
本发明一方面提供了另一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：3的木聚糖酶的第129位氨基酸由Tyr变为Gln.
上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ IDNO：6。
本发明还提供携带编码序列为SEQ ID NO：6的突变体基因的质粒。
本发明还提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：5的木聚糖酶的第104位氨基酸由Asn变为Asp。
所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ IDNO：8。
本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：8的突变体基因的质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含携带有木聚糖酶突变体基因的质粒。
所述宿主细胞优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明提供的野生型木聚糖酶XynH2的最适反应温度为50℃，而突变体XynH2-1和XynH2-2的最适反应温度为55℃，突变体XynH2-3的最适反应温度高达60℃，而且，在高于53℃条件下，三个突变体的相对酶活水平均显著高于野生型；65℃处理5min后，野生型木聚糖酶XynH2的酶活残留率仅为5％；而木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活残留率分别为20％、35％、46％，从而说明本发明筛选到的木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3的耐热性均得到显著提高，其中突变体XynH2-3的耐热性最强。此外，本发明提供的木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的最适反应pH值均为5.0，且对人工胃液和人工肠液均具有很高的耐受性，有利于其在饲料中的广泛应用。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳图；
其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为转空载体对照菌，泳道2-5分别为毕赤酵母XynH2、XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3发酵上清液；
图2为木聚糖酶突变体与野生型的最适反应pH比较图；
图3为木聚糖酶突变体与野生型的最适反应温度比较图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1木聚糖酶基因的扩增
根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成酸性木聚糖酶基因XynH2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
采用PCR反应克隆酸性木聚糖酶基因XynH2片段，引物和反应条件如下：
引物1(F)：GCGCGAATTCTTTCCTTCTGAGTTGGCTCAA
引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGA
反应条件为：94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，XynH2基因为大小621bp的片段。
实施例2木聚糖酶突变体的构建及筛选
申请人为了提高上述木聚糖酶XynH2的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
以XynH2基因为模板，以引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，将菌体用pH5.5的缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块于60℃处理10min后，稀释到pH5.5的缓冲液中，另一块不处理，稀释到pH 5.5的缓冲液中，分别加入相同pH值的30μl底物，于37℃反应30min后，DNS法测定生成的还原糖。
结果发现，不同的突变子经过高温处理后保持的酶活性不同，有些突变对木聚糖酶的活性没有影响，有些突变甚至使其活性降低了，对依然保持高活性的突变子进行DNA测序。最终，申请人获得了能显著提高木聚糖酶XynH2耐热性的突变位点及突变位点的组合：T128G单点突变；T128G和Y129Q两点突变；N104D、T128G和Y129Q三点突变。
将上述含T128G单点突变的木聚糖酶突变体命名为XynH2-1，其氨基酸序列为SEQID NO：3，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
将上述含T128G和Y129Q两点突变的木聚糖酶突变体命名为XynH2-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
将上述含N104D、T128G和Y129Q三点突变的木聚糖酶突变体命名为XynH2-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：8。
将上述木聚糖酶突变体基因分别用引物1、2进行PCR扩增，引物两端引入EcoR I、Not I位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述木聚糖酶突变体基因均为大小621bp的片段。
实施例3毕赤酵母工程菌株的构建
将野生型木聚糖酶基因XynH2和上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3片段，分别通过EcoR I和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建得到重组表达载体pPIC9K-XynH2、pPIC9K-XynH2-1、pPIC9K-XynH2-2、pPIC9K-XynH2-3。
将表达载体用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XynH2、GS115/pPIC9K-XynH2-1、GS115/pPIC9K-XynH2-2、GS115/pPIC9K-XynH2-3，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的阳性转化子。
将筛选到的阳性转化子分别命名为毕赤酵母XynH2(Pichia pastoris XynH2)、毕赤酵母XynH2-1(Pichia pastoris XynH2-1)、毕赤酵母XynH2-2(Pichia pastoris XynH2-2)和毕赤酵母XynH2-3(Pichia pastoris XynH2-3)。将上述阳性转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMM培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含重组木聚糖酶的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图1所示：发酵上清液中重组木聚糖酶突变体与野生型木聚糖酶的分子量大小均为20kDa(箭头所指处)，与预期一致。
(1)木聚糖酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
(3)酶活测定结果
按照上述方法测定毕赤酵母XynH2的发酵上清液酶活为234U/ml，说明本发明构建的毕赤酵母XynH2能高效表达野生型木聚糖酶XynH2；毕赤酵母XynH2-1、毕赤酵母XynH2-2和毕赤酵母XynH2-3的发酵上清液酶活分别为237U/ml、276U/ml、304U/mL，从而说明本发明构建的毕赤酵母XynH2-1、毕赤酵XynH2-2和毕赤酵XynH2-3能分别高效表达木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3。
实施例4酶学性质分析
1、最适反应pH分析
分别采用pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将上述四株毕赤酵母(XynH2、XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3)的发酵上清液进行稀释，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃条件下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图2所示，与野生型木聚糖酶XynH2相比，突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3的最适反应pH值未发生明显变化，均为5.0。
2、最适反应温度分析
分别在37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.5条件下，将上述四株毕赤酵母(XynH2、XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3)的发酵上清液进行稀释测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，野生型木聚糖酶XynH2的最适反应温度为50℃，而突变体XynH2-1和XynH2-2的最适反应温度为55℃，突变体XynH2-3的最适反应温度高达60℃；而且，在高于53℃条件下，三个突变体的相对酶活水平均显著高于野生型，从而说明本发明所述木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3的耐热性均得到显著提高，其中突变体XynH2-3的耐热性最强。
3、人工胃液、人工肠液耐受性
按中国药典(2005年版)配制人工胃液：取稀盐酸(9.5％-10.5％，取243ml盐酸加入到1000ml水中)16.4ml，加水800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释至1000ml即得。
将上述四株毕赤酵母(XynH2、XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3)的发酵上清液用人工胃液稀释到100U/ml左右，37℃处理2h后，立即取出，然后用pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液进行下一步的稀释，测定木聚糖酶酶活力，计算残留酶活，以未处理样品的原始酶活为100％，计算酶活残留率。结果显示：处理2h后，野生型木聚糖酶XynH2及突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活残留率均高于94％。
按中国药典(2005年版)配制人工肠液：pH6.8取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，取胰酶10g，加水适量使溶解，将二液混合后，加水稀释至1000mL即得pH6.8人工小肠液。
将上述四株毕赤酵母(XynH2、XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3)的发酵上清液用人工肠液稀释到100U/ml左右，37℃处理6h后，立即取出，然后用pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液进行下一步的稀释，测定木聚糖酶酶活力，计算残留酶活，以未处理样品的原始酶活为100％，计算酶活残留率。结果显示：处理6h后，野生型木聚糖酶XynH2及突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活残留率均高于90％。
综上，本发明所述木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3对人工胃液和人工肠液均具有很强的耐受性，但与野生型木聚糖酶XynH2相比，其耐受性未有明显提高。
4、耐热性分析
采用pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，分别将上述四株毕赤酵母(XynH2、XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3)的发酵上清液稀释到20u/ml，稀释后置于65℃的水浴条件下处理5min，测定残余的木聚糖酶活力，计算残留酶活，以未处理样品的原始酶活为100％，计算酶活残留率。结果显示：65℃处理5min后，野生型木聚糖酶XynH2的酶活残留率仅为5％；而木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活残留率分别为20％、35％、46％，从而说明本发明所述木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的耐热性均显著高于野生型，其中以突变体XynH2-3的耐热性最高。
综上所述，本发明以野生型木聚糖酶XynH2为基础，提供了包含T128G单点突变的木聚糖酶突变体XynH2-1，包含T128G和Y129Q两点突变的木聚糖酶突变体XynH2-2和包含N104D、T128G和Y129Q三点突变的木聚糖酶突变体XynH2-3。与野生型木聚糖酶XynH2相比，突变体XynH2-1、XynH2-2和XynH2-3的最适反应pH以及对人工胃液和人工肠液的耐受性均没有发生显著改变，但其耐热性得到显著提升，从而有利于该酸性木聚糖酶在饲料中的广泛应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
4.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4所述的木聚糖酶突变体。
6.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。
7.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求6所述的木聚糖酶突变体。
8.一种质粒，其特征在于，所述的质粒携带有权利要求2、5或7所述的基因。
9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为携带有权利要求8所述质粒的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。
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