CN104099311A - 一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用 - Google Patents

一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用 Download PDF

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徐晓东
付娟
王霁昀
刘安邦
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刘国栋
陈梅
曲音波
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Abstract

本发明涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，所述工程菌携带有能表达斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因的表达载体。利用本发明的毕赤酵母工程菌高效表达的木聚糖酶，在酸性条件下具有很高的活性，且对底物专一性高。所述木聚糖酶可被广泛用于低聚木糖的生产。

Description

一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用。
技术背景
低聚木糖亦称木寡糖（xylooligosaccharides），是由2～10个D-木糖以β-1,4-木糖苷键结合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一个重要成员。低聚木糖有明显的双歧杆菌增殖作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大多数肠道菌对低聚木糖的利用都比较差，能抑制肠道有害菌的生长发育；低聚木糖不被消化，与其他的低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，可满足患有诸如糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要；低聚木糖有抗龋齿，有利于口腔健康；低聚木糖促进人体对钙的吸收，防止老化和骨质疏松症。低聚木糖已经广泛应用于医药保健品、乳品饮料、食品和饲料等。
低聚木糖的生产通常是采用物理、化学及酶解等方法水解富含木聚糖的原料，然后对产物进行提取精制。制备低聚木糖的原料是木聚糖，它在玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木等农林产品中含量相对较高，平均可达30%左右。目前生产低聚木糖的主要方法是酶法水解木聚糖。利用内切木聚糖酶水解木聚糖底物得到的以木二糖、木三糖为主要成分的混合物。而酶解法的关键在于木聚糖酶对应底物的适应性，即选择合适的木聚糖酶。
很多微生物如细菌、霉菌和放线菌等均能产生木聚糖酶。木聚糖酶来源不同，结构和性质也不尽相同，其酶解木聚糖后释放出的寡糖链长也不相同。而木二糖、木三糖和木四糖是低聚木糖中功效较好的组分，因此这几种组分在酶解产物中含量越高越好。目前人们研究和应用最多的是细菌和霉菌来源的木聚糖酶，其酶解木聚糖的产物中木二糖～木四糖的含量比较低，而木糖及其他链长度组分含量较高。因此，现在急需开发出性能更好、专一性更强的木聚糖酶，更广泛的应用于低聚木糖的生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程技术手段，将斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有较高的活性。该酶对底物的专一性强，利用其酶解作用生产的低聚木糖中二糖、三糖和四糖的含量高，适用于高效生产低聚木糖。
申请人经过大量的筛选后，发现将克隆自斜卧青霉的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，毕赤酵母表达的木聚糖酶对底物的专一性很强，从而促成本发明。
一方面，本发明提供了一种克隆自斜卧青霉的木聚糖酶，该木聚糖酶的最适pH值为5.0，在pH4.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为60℃，在温度40-70℃的范围内，能保持50%以上的活性。
本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶，其具有
1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或者
2）在SEQ ID NO:1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚糖酶活性的氨基酸序列。
本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因为
1）核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
2）在严格条件下与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的DNA分子。
在本发明的一个优选实施方案中，上述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因具有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
本发明所述木聚糖酶能针对性的酶解木聚糖。酶解产物中低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。
因此，本发明另一方面提供了上述木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。
另一方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该工程菌携带有能表达所述斜卧青霉木聚糖酶基因的表达载体。
在本发明的一个实施方案中，所述的表达载体为pPIC9K，筛选标记为遗传霉素。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。
另一方面，本发明提供了上述毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的用途。
另一方面，本发明还提供了用于克隆木聚糖酶编码基因的引物对，其核苷酸序列为
引物F：5’-GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3’（SEQ ID NO:3）
引物R：5’-TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3’（SEQ ID NO:4）
另一方面，本发明提供了一种生产低聚木糖的方法，该方法包括：
（1）发酵培养本发明所述的毕赤酵母工程菌，获得本发明所述的木聚糖酶；
（2）用所述木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。
本发明所述的含木聚糖的原料包括但不限于玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木等。
在本发明的低聚木糖产物中，低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。
发明优点
本发明构建了高效表达斜卧青霉木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，其生产的木聚糖酶在酸性范围内具有较高的酶活性，最适pH值为5.0，在pH4.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为60℃，在温度40-70℃的范围内，能保持50%以上的活性。该木聚糖酶具有很强的底物专一性，能针对性的酶解木聚糖。本发明的木聚糖酶可应用于低聚木糖的生产，产物中低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%，应用前景广泛。
附图说明
图1、木聚糖酶基因XynQ1的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。
图2、构建的重组表达载体pPIC9K-XynQ1示意图。
图3、毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳图，箭头所示为重组木聚糖酶XYNQ1。
图4、重组木聚糖酶XYNQ1的发酵曲线。
图5、重组木聚糖酶XYNQ1的pH特性分析。
图6、重组木聚糖酶XYNQ1的反应温度分析。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例
实施例1 斜卧青霉木聚糖酶基因的克隆
查阅GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶10家族中的一个木聚糖酶基因，该基因来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens），GenBank号为HQ286638.1。通过上海捷瑞生物工程有限公司合成该木聚糖酶基因，命名为XynQ1，并对合成基因进行了密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
采用PCR反应克隆木聚糖酶基因XynQ1片段，引物和反应条件如下：
引物1(F)：5’-GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3’
引物2(R)：5’-TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3’
反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图1所示，XynQ1基因为大小1167bp的片段。
实施例2 重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建
2.1、表达载体的构建
将克隆得到的木聚糖酶基因XynQ1片段，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100μl酶切体系如下：木聚糖酶基因XynQ1PCR产物40μl、10×H buffer10μl、10×BSA10μl、EcoR I5μl、Not I5μl、ddH2O30μl。37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K20μl、10×H buffer10μl、EcoR I5μl、ddH2O65μl。37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段20μl、10×H buffer10μl、10×BSA10μl、10×Triton10μl、Not I5μl、ddH2O45μl。37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将经EcoR I和Not I双酶切的XynQ1片段与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynQ1，如图2所示。连接体系如下：表达载体pPIC9K5μl、XynQ1片段3μl、10×T4ligase buffer1μl、T4ligase1μl。22℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-XynQ1。
2.2、转化与筛选
将重组酵母表达质粒pPIC9K-XynQ1用Sal I进行线性化，线性化片段用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
2.3、发酵验证
挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养1d后，再转入BMM培养基中，30℃，250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行SDS-PAGE电泳检测（图3）。如图3所示，箭头所指处即为本发明的重组表达木聚糖酶XYNQ1，分子量为40kDa左右。上清液中木聚糖酶活力测定结果显示，摇瓶水平下木聚糖酶XYNQ1的表达量达到160U/ml。将上述阳性转化子命名为巴斯德毕赤酵母XYN-Q1（Pichia pastoris XYN-Q1）。
木聚糖酶酶活力检测方法如下：
取2ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活单位定义：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
酶活计算公式：
X D = [ ( A E - A B ) × K + C 0 ] M × t × N × 1000
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol=1000μmol。
实施例3 毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的应用
在10升发酵罐上进行上述毕赤酵母工程菌的发酵。
发酵培养基配方：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05%。
发酵生产工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上，表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，将发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。通过测定不同时间段发酵液中的菌体量和木聚糖酶XYNQ1的酶活，制得发酵进程曲线。结果如图4所示，毕赤酵母工程菌最终的发酵酶活能达到1500U/ml。
实施例4 木聚糖酶的酶学性质测定
4.1、最适反应pH的测定
采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将发酵的上清液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下分别进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图5所示，本发明生产的木聚糖酶XYNQ1最适反应pH值为5.0，为酸性木聚糖酶，在pH4.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性。
4.2、最适反应温度的测定
在pH5.5条件下，分别测定30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃温度时发酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图6所示，本发明生产的木聚糖酶XYNQ1最适反应温度为60℃，在温度40-70℃的范围内，能保持50%以上的活性。
实施例5 木聚糖酶在生产低聚木糖中的应用
将玉米芯进行清洗、粉碎，在高温、高压、弱酸性条件下蒸煮处理；蒸煮液降温至40-50℃后，按3000-5000U/L添加量加入本发明生产的木聚糖酶，搅拌均匀后，维持在40-50℃约7小时，进行充分酶解。酶解结束后，将蒸煮液升温煮沸10min，滤纸过滤取上清液。将得到的上清液进行活性炭脱色处理，按照国标《QBT2984-2008低聚木糖》所述方法测定各糖组分的含量，测定结果如下表所示。
从下表可以看出，利用本发明生产的木聚糖酶XYNQ1水解玉米芯后得到的产物中，低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。实验结果表明，本发明的木聚糖酶可广泛用于低聚木糖的生产，能有效提高低聚木糖的产量。
序号 糖组分 含量(%)
1 木七糖 5.5379
2 木六糖 7.5898
3 木五糖 6.5309
4 木四糖 11.4362
5 木三糖 14.9051
6 木二糖 24.0733
7 葡萄糖 10.3399
8 木糖 12.7247
9 阿拉伯糖 6.862
                         序列表
 
<110>  青岛蔚蓝生物集团有限公司
 
<120>  一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.4
 
<210>  1
<211>  410
<212>  PRT
<213>  斜卧青霉（Penicillium decumbens）
 
 
<220>
<221>  木聚糖酶蛋白
<222>  (1)..(410)
 
<400>  1
 
Met Val His Leu Ser Ala Thr Ser Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ile Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Pro Asn Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asn Asp Ala Ala Lys Ala Ile
            20                  25                  30          
 
 
Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ser Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp
        35                  40                  45             
 
 
Ser Ala Tyr Val Lys Gln Leu Ser Asn Thr Ala Asp Phe Gly Gln Ile
    50                  55                  60                 
 
 
Thr Pro Gly Asn Ser Gln Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Arg Asn
65                  70                  75                  80 
 
 
Val Phe Thr Phe Ser Gly Gly Asp Thr Val Ala Lys Leu Ala Gln Ser
                85                  90                  95     
 
 
Asn Gly Gln Lys Leu Arg Cys His Asn Leu Val Trp His Ser Gln Leu
            100                 105                 110        
 
 
Pro Ser Trp Val Thr Asn Gly Asn Phe Asn Asn Ala Thr Leu Ile Ser
        115                 120                 125            
 
 
Ile Met Lys Asn His Ile Thr Asn Leu Val Gln His Tyr Lys Gly Gln
    130                 135                 140                
 
 
Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Ser
145                 150                 155                 160
 
 
Tyr Arg Gln Ser Val Trp Tyr Asn Thr Ile Gly Pro Ala Tyr Leu Pro
                165                 170                 175    
 
 
Ile Ala Phe Ala Thr Ala Ala Ser Val Asp Pro Thr Val Lys Leu Tyr
            180                 185                 190        
 
 
Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Tyr Ser Gly Ala Lys Ala Ala Gly Ala
        195                 200                 205            
 
 
Arg Arg Ile Val Glu Leu Val Gln Ser Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly
    210                 215                 220                
 
 
Val Gly Leu Gln Ala His Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Lys Asp
225                 230                 235                 240
 
 
Asp Gln Lys Lys Val Met Ala Gly Tyr Thr Ala Tyr Gly Val Glu Val
                245                 250                 255    
 
 
Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Asn Leu Pro Ser Thr Asn Ala
            260                 265                 270        
 
 
Gln Leu Thr Gln Gln Ala Thr Asp Tyr Ser Asn Thr Val Ser Ala Cys
        275                 280                 285            
 
 
Val Glu Thr Lys Asn Cys Val Gly Ile Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp
    290                 295                 300                
 
 
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly Gln Gly Ala Ala Cys
305                 310                 315                 320
 
 
Pro Trp Asp Ser Asn Phe Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Asn Ala Ile Leu
                325                 330                 335    
 
 
Asn Ala Leu Asn Ala Gly Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ser Pro Thr Thr
            340                 345                 350        
 
 
Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Pro Gly Gly
        355                 360                 365            
 
 
Ser Gly Ser Thr Gly Gly Met Ala Gln His Trp Gly Gln Cys Gly Gly
    370                 375                 380                
 
 
Asn Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln
385                 390                 395                 400
 
 
Ala Ser Asn Pro Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
                405                 410
 
 
<210>  2
<211>  1233
<212>  DNA
<213>  斜卧青霉（Penicillium decumbens）
 
 
<220>
<221>  木聚糖酶基因
<222>  (1)..(1233)
 
<400>  2
atggtccact tgtctgccac ctctttgttg ttggcagctg gtattttgcc aaacttggct     60
 
ttgggagcag gtttgaacga cgcagctaag gcaatcggtc aagtctactt tggatctgca    120
 
accgacaacc cagaattgtc tgactctgca tatgtcaagc agttgtctaa caccgctgat    180
 
ttcggtcaga tcacaccagg aaactctcaa aaatgggacg ccaccgaacc atctagaaat    240
 
gtcttcactt tctctggagg agacacagtc gcaaagttgg ctcagtctaa cggtcaaaag    300
 
ttgagatgtc acaacttggt ctggcattct cagttgcctt cttgggtcac aaacggtaac    360
 
ttcaataatg ccactttgat ctctatcatg aaaaaccaca tcactaattt ggtccagcac    420
 
tataaaggac agtgctatgc ctgggatgtt gttaatgagg ccttgaatga ggacggatct    480
 
tatagacagt ctgtttggta caacactatc ggaccagctt atttgcctat cgcctttgca    540
 
acagccgcat ctgtcgatcc tactgtcaaa ttgtattaca acgattacaa tatcgaatac    600
 
tctggtgcca aggccgcagg agctagaaga atcgtcgagt tggttcagtc ttacggagca    660
 
aaaatcgatg gagttggatt gcaagcccac tttattgtcg gatctacccc atctaaagat    720
 
gaccaaaaga aggtcatggc tggatacact gcctatggtg tcgaagttgc aattaccgaa    780
 
ttggacatta gaatgaactt gccatctaca aacgcccaat tgactcaaca ggctaccgat    840
 
tactctaata ctgtttctgc ctgcgttgag actaagaatt gcgttggaat taccatctgg    900
 
gattggaccg ataagtactc ttgggttcct tctacatttt ctggacaggg agctgcatgt    960
 
ccttgggact ctaactttca gaagaagcct gcctacaacg ccatcttgaa cgctttgaat   1020
 
gcaggatctt ctactggtgg tggatctcca actactacca ctacaactac cgctgctgcc   1080
 
acaacaacca ccgctccagg aggttctggt tctacaggag gaatggccca acattggggt   1140
 
cagtgtggtg gtaacggttg gactggacct accacatgcg cttctccata cacatgccaa   1200
 
gcctctaatc cttggtattc tcaatgcttg taa                                1233
 
 
<210>  3
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
 
<220>
<221>  引物
<222>  (1)..(34)
 
<400>  3
gcgcgaattc gcaggtttga acgacgcagc taag                                 34
 
 
<210>  4
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
 
<220>
<221>  引物
<222>  (1)..(33)
 
<400>  4
taaagcggcc gcttacaagc attgagaata cca                                  33
 
 

Claims (10)

1.一种木聚糖酶，其具有： 
1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或者 
2）在SEQ ID NO:1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚糖酶活性的氨基酸序列。 
2.权利要求1所述的木聚糖酶，其编码基因为 
1）核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的DNA分子；或者 
2）在严格条件下与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的DNA分子。 
3.一种木聚糖酶，其在pH4.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性，在温度40-70℃的范围内，能保持50%以上的活性，最适pH值为5.0，最适反应温度为60℃。 
4.权利要求1至3中任一项所述的木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。 
5.一种重组毕赤酵母工程菌，其携带有含权利要求1至3中任一项所述木聚糖酶的编码基因的表达载体。 
6.权利要求5所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的表达载体为pPIC9K。 
7.权利要求5或6所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。 
8.权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌在在生产低聚木糖中的用途。 
9.一种生产低聚木糖的方法，该方法包括： 
（1）发酵培养权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌，获得木聚糖酶； 
（2）用获得的木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。 
10.权利要求9所述的生产低聚木糖的方法，其中所述的低聚木糖产物中低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。 
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