CN102127556A - 一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。生物信息学分析表明该木聚糖酶属于糖苷水解酶第10家族，命名为Aus Xyn10A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，相应的基因命名为Aus xyn10A。本发明还公开了木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。作为一种新型酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。

Description

一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化

技术领域

本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因完整mRNA和DNA序列的克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着人口的不断增长和资源的进一步消耗，可再生资源的开发利用已经成为全世界共同关注的问题。木质纤维如秸秆、碎木等作为一种丰富而又尚未开发的重要资源越来越受到重视。木质纤维的主要成分是纤维素和半纤维素，两者之和占木质纤维成分的50％以上。木聚糖是半纤维素的重要组分，在植物细胞壁的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。自然界中的木聚糖多为异聚多糖，侧链上连着多种不同大小的短取代基，而根据菌株来源的的不同，木聚糖的侧链可以被阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙酰基等残基取代，木聚糖的这种复杂性导致其需要多种酶的参与才能被完全分解。

β-1，4-内切木聚糖酶是木聚糖降解过程中最重要的酶之一，该酶主要从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成木寡糖。木聚糖酶在自然界分布很广，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和反当动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在木聚糖酶。研究较多的是微生物产生的木聚糖酶，已报道能合成木聚糖酶的微生物有细菌、放线菌、真菌和酵母菌等。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。目前木聚糖酶已在造纸、食品、能源、饲料以及环境等领域体现出了重要的应用价值，随着基因工程技术的发展，通过基因工程这一手段实现木聚糖酶的高效表达，加速了木聚糖酶在各种领域中的应用过程。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。根据Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分类法，绝大多数木聚糖酶属于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息学分析表明该基因所编码的木聚糖酶属于A.usamii E001中发现的第一种10家族的木聚糖酶，所以命名为Aus Xyn10A，其相应的基因命名为Ausxyn10A。Aus Xyn10A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

本发明的技术方案：一种来源于A.usamii E001的新型木聚糖酶基因(Aus xyn10A)，其完整的mRNA和DNA序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。

A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，No.4，Pg.50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。

所述的由完整mRNA推导的Aus Xyn10A氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

所述的重组木聚糖酶的活性测定方法：

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

所述的Ausxyn10A完整mRNA和DNA序列的克降和表达方法：

(1)Ausxyn10A 3′端mRNA序列的克隆：对10家族的Aspergillus niger DMS(GenBankACJ26381)、Aspergillus kawachii IFO(GenBank P33559)和Aspergillus niger IME(GenBankACR83565)木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出一段约10个氨基酸的保守序列；对该段氨基酸序列的mRNA序列进行同源比对，设计一条简并引物Xyn10A-F1。

Xyn10A-F1：5′-ATGGTTCAGATCAAGG(C/T)AGC-3′

提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-xyn10A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xyn10A3′端mRNA序列。

(2)Aus xyn10A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn10A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Xyn10A-R1和Xyn10A-R2。

Xyn10A-R1：5′-GTTCAGTAGCATCCCACTTC-3′

Xyn10A-R2：5′-CGGAGTCTTCGAGTTCTTGG-3′

按照TaKaRa的5′-Fu1l RACE Kit说明书进行5′-RACE。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A5′)，转化JM109，纤酶切鉴定后送上海生工测序，得到Aus xyn10A 5′端mRNA序列。

(3)Aus xyn10A 5′端启动子序列的克隆：利用我们前期报道的《一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法》(专利申请号：201010550905.8)，以处理后的A.usamii E001基因组DNA为模板，HSOF和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR，HSOF和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xyn10A 5′端启动子序列。

(4)Aus xyn10A 3′端转录终止区序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn10A 3′端mRNA序列，设计两条正向引物Xyn10A-F2和Xyn10A-F3。

Xyn10A-F2：5′-CCGTTTGGGGAGTTGCTGAC-3′

Xyn10A-F3：5′-TCCACTCCTCTGCTGTTCG-3′

利用我们前期报道的《一种发卡结构介导的测定3′端侧翼未知序列的方法》(专利申请号：201010550886.9)，以处理后的A.usamii E001基因组DNA为模板，HSOF和Xyn10A-F2为引物进行第一轮PCR，HSOF和Xyn10A-F3为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A3T)，转化JM109，经酶切鉴定后送上海生工测序，得到Aus xyn10A3′端转录终止区序列。

(5)Aus xyn10A基因的生物信息学分析：将Aus xyn10A的5′和3′端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(OpenReading Frame)进行分析，进而推导出Aus Xyn10A的氨基酸序列并进行信号肽预测。将Ausxyn10A的编码区DNA序列与其两侧序列进行拼接，获得完整DNA序列，并对其5′端启动子区域和3′端转录终止区的功能进行预测。

(6)含编码Aus Xyn10A成熟肽基因的表达质粒的构建：基于上述得到的Aus xyn10A完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一对引物Xyn10A-F和Xyn10A-R，扩增去除信号肽基因序列的成熟肽基因：

Xyn10A-F：5′GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′，含EcoR I酶切位点

Xyn10A-R：5′GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′，含Not I酶切位点

按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10A-F为引物进行第一轮PCR；以Xyn10A-F和Xyn10A-R为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

将测序结果正确的pUCm-T-xyn10A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn10A(图2)，并对重组表达质粒进行序列测定。

(7)GS115/xyn10A重组子的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-xyn10A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组木聚糖酶。

本发明的有益效果：本发明提供了一种新型木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，木聚糖酶工程菌GS115/xyn10A的构建，以其重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。经生物信息学分析表明来源于宇佐美曲霉E001的该木聚糖酶属于糖苷水解酶第10家族，命名为Aus Xyn10A，其相应的基因命名为Aus xyn10A。Aus Xyn10A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

附图说明

图1：获取A.usamii E001 Xyn10A基因完整mRNA和DNA序列的流程图

图2：重组质粒pPIC9K-xyn10A的构建示意图

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1Aus xyn10A 3′端mRNA序列的克隆

以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10A-F1为引物进行PCR扩增(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃10min)。将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

实施例2Aus xyn10A 5′端mRNA序列的克隆

以5′RACE Outer Primer和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)；以5′RACE Inner Primer和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

实施例3Aus xyn10A 5′端启动子序列的克隆

以HSOF和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以HSOF和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

实施例4Aus xyn10A 3′端转录终止区序列的克隆

以HSOF和Xyn10A-F2为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以HSOF和Xyn10A-F3为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

实施例5含编码木聚糖酶成熟肽基因的表达质粒的构建

以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10A-F为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10A-F和Xyn10A-R为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃90s；72℃10min)。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序正确的pUCm-T-xyn10A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn10A，并对重组表达质粒进行序列测定。

实施例6GS115/xyn10A的构建、表达、产物纯化及活性测定

用Sal I对pPIC9K-xyn10A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10A。该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达113IU/mL。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为40kDa。该重组木聚糖酶最适作用温度50℃，最适作用pH 5.0，该酶在pH 3.0～9.0、45℃以下稳定。

序列表

序列表

<110>江南大学

<120>一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化

<140>201010581342.9

<141>2010-12-10

<210>SEQ ID NO：1

<211>1235

<212>mRNA

<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001

<220>

<221>CDS

<222>(81)...(1064)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(81)...(155)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(156)...(1061)

<400>1

taaaaatcta tcgtgattct tttagtccac catcatcctc tttcgactct tccaagaagg  60

tatatcgttt cttgcccaac atggttcaga tcaaggtagc tgcactggcg atgcttttcg  120

ctagccaggt actttctgag cccattgaac cccgtcaggc ttcagtgagt attgatacca  180

aattcaaggc tcacgggaag aaatatcttg gaaacattgg tgatcagtac accttgacca  240

agaactcgaa gactccggcc attatcaagg ccgattttgg cgcgttgact ccagagaaca  300

gcatgaagtg ggatgctact gaacccagcc gtggacagtt ctctttctca ggatcggact    360

acctggtcaa ctttgcccag tctaacaaca agctgatccg cggacatact ctcgtgtggc    420

actcgcagct cccctcctgg gtccaatcca tcacggacaa gaatacactg atcgaagtca    480

tgaagaatca catcaccaca gtgatgcaac actataaggg caagatttat gcctgggatg    540

ttgtcaatga aatcttcaac gaagacggct ccctacgcga cagcgtcttt tacaaggtca    600

tcggcgagga ctacgtgcgg atcgccttcg agactgctcg ggctgcagat cccaatgcaa    660

agctctacat caatgattac aacctggatt ccgcctccta ccctaaattg accggcatgg    720

ttagccatgt caagaagtgg atcgcagctg gcatccctat cgatggaatc ggttcccaaa    780

cccacttgag cgctggtgga ggtgctggaa tttctggagc tctcaatgct ctcgcaggtg    840

ccggcaccaa ggagattgct gtcaccgagc ttgacatcgc tggcgccagc tcgaccgact    900

acgtggaggt cgtcgaagcc tgcctgaacc agcccaagtg tatcggtatc accgtttggg    960

gagttgctga cccggattcc tggcgctcca gctccactcc tctgctgttc gacagcaact    1020

acaacccgaa gcctgcatac actgctatcg caaatgctct ctagatccgg caaccactcc    1080

gatcggattt ccgggaaggc atagccttat gaggtagggg acgctctgtt gcctgctgca    1140

actttgactc tgccatatct gcccatagca aagggttgta tttttttttc ctgtacttct    1200

tccacttttg gccattacaa tcgtttcatt tctaa                               1235

<110>江南大学

<120>一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化

<140>201010581342.9

<141>2010-12-10

<210>SEQ ID NO：2

<211>2685

<212>DNA

<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001

<220>

<221>CDS

<222>(591)...(834)，(891)...(931)，(991)...(1039)，(1101)...(1222)，(1275)...(1420)，

     (1474)...(1562)，(1618)...(1663)，(1716)...(1806)，(1869)...(1934)，(1995)...(2084)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(591)...(665)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(666)...(834)，(891)...(931)，(991)...(1039)，(1101)...(1222)，(1275)...(1420)，

     (1474)...(1562)，(1618)...(1663)，(1716)...(1806)，(1869)...(1934)，(1995)...(2081)

<220>

<221>Promoter

<222>(471)...(520)

<220>

<221>TATA_signal

<222>(481)...(486)

<400>2

gaattcctgc agaatcccat cagatcatcc gcaggctccc tgcagcatcg attaaggaac    60

gaatcatcgg ctgtacccga ctgctattct tacagggcta agtatttgtg gaaccgaggc    120

aggccctgga ccctgatgga cgaacattgg caggtcattt ggacgaccgt gcaacaagtg    180

ctccactcct gaaattaaca tacgattgct tctcggcgtg tcggctgaga atatagccta    240

ctctaaccga acatgtcaag agcgccggat agcctgccta aacgcccttg atcatccgtt    300

caggctaatc agggtccatg tatcatcctc ccattctggg aaattcggta gagagctaga    360

tgaggcagat ggagtcaatc ctatcctatc gacgcattct ggagcgggat gtttggttcc    420

gcggcttgga gtgttccagt ttcacatcct ctttgcctag aaatgttgag tctcatggta    480

tataaatact tcaatccctc tctctctttg taaaaatcta tcgtgattct tttagtccac    540

catcatcctc tttcgactct tccaagaagg tatatcgttt cttgcccaac atggttcaga    600

tcaaggtagc tgcactggcg atgcttttcg ctagccaggt actttctgag cccattgaac    660

cccgtcaggc ttcagtgagt attgatacca aattcaaggc tcacgggaag aaatatcttg    720

gaaacattgg tgatcagtac accttgacca agaactcgaa gactccggcc attatcaagg    780

ccgattttgg cgcgttgact ccagagaaca gcatgaagtg ggatgctact gaacgtaagt    840

acaatcccct catcattatc attgcgactc agactaaatc agaagtatag ccagccgtgg    900

acagttctct ttctcaggat cggactacct ggtacgtaca gcacttctca acccttcact    960

atagtcgtgc tcgaggctta cataacttag gtcaactttg cccagtctaa caacaagctg    1020

atccgcggac atactctcgg tgagtttttg acgtactagc gtgggaagca taccaagaca    1080

gtgaagctaa actcaaccag tgtggcactc gcagctcccc tcctgggtcc aatccatcac    1140

ggacaagaat acactgatcg aagtcatgaa gaatcacatc accacagtga tgcaacacta    1200

taagggcaag atttatgcct gggtaggctg tcacccatca acttctcaaa agtgttatta    1260

ttaatcgtct taaggatgtt gtcaatgaaa tcttcaacga agacggctcc ctacgcgaca    1320

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ctgcagatcc caatgcaaag ctctacatca atgattacaa gtaagtcata tttgcctctc    1440

tcctgttacc aattggatac taaatttgaa aagcctggat tccgcctcct accctaaatt    1500

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actttgactc tgccatatct gcccatagca aagggttgta tttttttttc ctgtacttct    2220

tccacttttg gccattacaa tcgtttcatt tctaagtgtg cgcacattca gtaaaactga    2280

agcatccacc tctagtgtag ctctacttgt ccttaatccc agtggagtac tctatgccat    2340

tgcaccccac aggtggggcc gtagcattag tactttactt tgttagtcta gaccctgatg    2400

cgccgatgtg aagcacaagc actcttgaaa tgaagtacat gtctcagata ccccgcccca    2460

taattataat agccatttaa ggtccttgcg gcacgcggtt ggagaaatag agcgggctgg    2520

ctagtctgtt tggctttatt aataaccaac ttggcattgg ctgaacatcg gactagtggt    2580

tcattaaggt cctcgcttag catcctgcaa catttagtgc atgtaaccac ggcaattcaa    2640

ggtgcgaaca actaccgaga aaagtacaat gggtccccac tgcag                    2685

<110>江南大学

<120>一种新型木聚糖酶(Xyn10A)基因的克隆、表达和纯化

<140>201010581342.9

<141>2010-12-10

<210>SEQ ID NO：3

<211>327

<212>PRT

<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)...(25)

<400>3

Met Val Gln Ile Lys    Val Ala Ala Leu Ala    Met Leu Phe Ala Ser

                  5                     10                     15

Gln Val Leu Ser Glu    Pro Ile Glu Pro Arg    Gln Ala Ser Val Ser

                 20                     25                     30

Ile Asp Thr Lys Phe    Lys Ala His Gly Lys    Lys Tyr Leu Gly Asn

                 35                     40                     45

Ile Gly Asp Gln Tyr    Thr Leu Thr Lys Asn    Ser Lys Thr Pro Ala

                 50                     55                     60

Ile Ile Lys Ala Asp    Phe Gly Ala Leu Thr    Pro Glu Asn Ser Met

                 65                     70                     75

Lys Trp Asp Ala Thr    Glu Pro Ser Arg Gly    Gln Phe Ser Phe Ser

                 80                     85                     90

Gly Ser Asp Tyr Leu    Val Asn Phe Ala Gln    Ser Asn Asn Lys Leu

                 95                    100                    105

Ile Arg Gly His Thr    Leu Val Trp His Ser    Gln Leu Pro Ser Trp

                110                    115                    120

Val Gln Ser Ile Thr    Asp Lys Asn Thr Leu    Ile Glu Val Met Lys

                125                    130                    135

Asn His Ile Thr Thr    Val Met Gln His Tyr    Lys Gly Lys Ile Tyr

                140                    145                    150

Ala Trp Asp Val Val    Asn Glu Ile Phe Asn    Glu Asp Gly Ser Leu

                155                    160                    165

Arg Asp Ser Val Phe    Tyr Lys Val Ile Gly    Glu Asp Tyr Val Arg

                170                    175                    180

Ile Ala Phe Glu Thr    Ala Arg Ala Ala Asp    Pro Asn Ala Lys Leu

                185                    190                    195

Tyr Ile Asn Asp Tyr    Asn Leu Asp Ser Ala    Ser Tyr Pro Lys Leu

                200                    205                    210

Thr Gly Met Val Ser    His Val Lys Lys Trp    Ile Ala Ala Gly Ile

                215                    220                    225

Pro Ile Asp Gly Ile    Gly Ser Gln Thr His    Leu Ser Ala Gly Gly

                230                    235                    240

Gly Ala Gly Ile Ser    Gly Ala Leu Asn Ala    Leu Ala Gly Ala Gly

                245                    250                    255

Thr Lys Glu Ile Ala    Val Thr Glu Leu Asp    Ile Ala Gly Ala Ser

                260                    265                    270

Ser Thr Asp Tyr Val    Glu Val Val Glu Ala    Cys Leu Asn Gln Pro

                275                    280                    285

Lys Cys Ile Gly Ile    Thr Val Trp Gly Val    Ala Asp Pro Asp Ser

                290                    295                    300

Trp Arg Ser Ser Ser    Thr Pro Leu Leu Phe    Asp Ser Asn Tyr Asn

                305                    310                    315

Pro Lys Pro Ala Tyr    Thr Ala Ile Ala Asn    Ala Leu

                320                    325        327

 

Claims (4)

1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、归属于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的新型木聚糖酶(Aus Xyn10A)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.A.usamii E001Aus xyn10A完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)A.usamii E001 Aus xyn10A 3′端mRNA序列的克隆：对10家族的Aspergillus nigerDMS、Aspergillus kawachii IFO和Aspergillus niger IME木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，设计一条简并引物Xyn10A-F1；

Xyn10A-F1：5′-ATGGTTCAGATCAAGG(C/T)AGC-3′

以A.usamii E001总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10A-F1为引物进行PCR扩增(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn10A 3′端mRNA序列；

(2)A.usamii E001 Aus xyn10A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn10A 3′端mRNA序列，，设计两条反向引物Xyn10A-R1和Xyn10A-R2；

Xyn10A-R1：5′-GTTCAGTAGCATCCCACTTC-3′

Xyn10A-R2：5′-CGGAGTCTTCGAGTTCTTGG-3′

以反转录合成的cDNA第一条链为模板、5′RACE Outer Primer和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)；以5′RACE Inner Primer和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃3min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn10A 5′端mRNA序列；

(3)A.usamii E001Aus xyn10A 5′端启动子序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，以HSOF和Xyn10A-R1为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以HSOF和Xyn10A-R2为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn10A 5′端启动子序列；

(4)A.usamii E001 Ausxyn10A 3′端转录终止区序列的克隆：基于上述得到的Aus xyn10A3′端mRNA序列，设计两条正向引物Xyn10A-F2和Xyn10A-F3；

Xyn10A-F2：5′-CCGTTTGGGGAGTTGCTGAC-3′

Xyn10A-F3：5′-TCCACTCCTCTGCTGTTCG-3′

以HSOF和Xyn10A-F2为引物进行第一轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；以HSOF和Xyn10A-F3为引物进行第二轮PCR(94℃4min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xyn10A 3′端转录终止区序列。

4.A.usamii E001木聚糖酶工程菌的构建和表达方法：

(1)构建含编码Aus Xyn10A成熟肽基因的表达质粒：基于上述得到的木聚糖酶基因完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一对引物Xyn10A-F和Xyn10A-R，获得已去除信号肽基因序列的成熟肽基因：

Xyn10A-F：5′-GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′，含EcoR I酶切位点

Xyn10A-R：5′GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′，含Not I酶切位点

以合成的cDNA第一条链为模板，M13 Primer M4和Xyn10A-F为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10A-F和Xyn10A-R为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃90s；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-xyn10A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn10A，并对重组质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/xyn10A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-xyn10A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10A。该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达113IU/mL；离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为40kDa；该重组木聚糖酶最适作用温度50℃，最适作用pH 5.0，该酶在pH 3.0～9.0、45℃以下稳定。

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