CN103789283B - 一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用。本发明提供了一种来源于腐质霉Humicola？insolensY1的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，且本发明提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因Abf43。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的具有以下性质：最适pH5.0，最适温度50℃，具有良好的金属离子抗性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、能源、造纸、医药工业等。

Description

一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用。

背景技术

自然界中，半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是仅次于纤维素的第二大丰富的多聚糖，提高其生物降解性能具有深远的生物学意义。木聚糖聚糖是半纤维素中的代表性主要组成组分，其结构非常复杂，主链是D-吡喃木糖通过β-1,4糖苷键连接形成，侧链上还连接有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸酯基、乙酰基等不同的取代基，因此，木聚糖的完全降解需要多个酶的共同作用才能完成。其中，木聚糖酶作为主酶以内切的方式作用于木聚糖的主链，阿拉伯呋喃糖苷酶则是侧链降解酶，并对主链的降解起到重要的促进作用。

其中，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-l-arabinofuranosidase,EC3.2.1.55)能从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个阿拉伯糖分子。自然界中，产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶有细菌、真菌以及一些植物。作为半纤维素降解酶系之一，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶参与低价的农产品残渣的再利用，产生可用于发酵生成燃料乙醇的单糖及其他副产品，因此它在农业-工业产业中具有很好的应用前景。在饲料行业中，纤维素和半纤维素是反刍类动物的主要能量来源，但是由于其降解率低，真正被动物所利用的只有40-60%。阿拉伯糖呋喃糖苷酶作为一种饲料添加剂，去除了木聚糖上阿拉伯糖侧链，促进木聚糖的降解，易于被动物消化吸收。阿拉伯呋喃糖苷酶还被广泛应用于食品行业中。l-阿拉伯糖做为一种低摄入量的甜味剂能代替传统的蔗糖，适于老年人和高血糖患者食用。同时，它还能阻断人体对蔗糖的吸收，在减肥和控制糖尿病方面有很好的应用前景。阿拉伯呋喃糖苷酶还能增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，提高酒的香味；并由于其去除了阿拉伯糖侧链，并能将阿拉伯聚糖水解成短链的可溶性物质，增加果汁的澄清度，而被应用于果汁生产工业。

本发明从高温真菌腐质霉HumicolainsolensY1中分离得到一种典型的中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43，其最适pH5.0，最适温度50℃，具有良好的金属离子抗性，并且底物特异性非常专一。这些特性能够利于其在食品工业进行温和的酶解反应，利于其在食品工业上的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中性阿拉伯呋喃糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述中性阿拉伯呋喃糖苷酶的应用。

本发明从腐质霉HumicolainsolensY1中分离得到一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43。

本发明提供了一种阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

SEQIDNO.1：

MRFSVFTAAIAAAFSACCATASPAVNYVNSLILQRADPHIVKHTDGWYYFTATVPEYDRIVLRRAQTIQGLQSAPETVIWRRKAFGVGSGQVWAPELHYIDGRWYIYVALGVSGQWRIRAFVLEGVGANPLTASWTEKGIIQTNWDTFSLDATTFVANGTRYLVWAQQDPSRNGENSSLFIAPLQNPWTIRGPAVAISHPDLSWERIGYKVNEGPAVIQRNGRIFLTYSASATDHNYCMGLLTARADANLMNPASWVKSQQPIFVSNAATNQWGPGHNQFTVSEDGLSDILVYHDRGYRDINGDPLNDPNRRTRVQKLYWRDDGTPDFGIPVPDGPTPVRLRVAANGASSNGAYVRFYTTTGSGNLTGTAALPDTQFKLVSPGLSGGDSVSLESTSNPGTYVRRVSGSTAVQFERGTALNTAALRASASFRRVPGLSDSGGAVSFESVESPGQYLRLDPNGRLSVASVAEGTQGRSTFYLE

其中，该酶包括481个氨基酸，N端19个氨基酸为信号肽序列。

本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43在常温中性的范围内均具有较好的活性。本发明筛选到腐质霉HumicolainsolensY1所产生的阿拉伯呋喃糖苷酶，其最适pH值为5.0，最适温度为50℃，在45℃热处理30min具有50％以上的酶活力。

本发明提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的基因Abf43。具体地，该基因的基因组序列如SEQIDNO.2所示：

atgcgcttctcggttttcacagcggccatcgccgcggccttctcagcatgctgcgctacagcctcaccggccgtgaactatgtcaactcactcattctgcaacgggccgatcctcacatcgtcaagcacactgatgggtggtactacttcacggcaacagtccccgaatatgaccgcattgtcctgcggagggcacaaaccatccaaggcctgcaatcggcgcccgagacggtaatctggcggcgcaaggccttcggcgtcgggagcgggcaggtgtgggccccggagctgcactacatcgacggccgttggtacatctacgtcgcgctgggagtgtccgggcagtggcgcatccgcgcgttcgtgctggaaggcgttggcgcgaacccgctgacggcctcgtggaccgagaagggcatcatccaaactaactgggacaccttttcactggacgcaacaaccttcgtggccaacggtacgcggtatctcgtctgggcgcagcaggatccttcgcgcaacggtgagaactccagcctgttcatcgcgccgttgcaaaacccctggacgattcgtggaccagccgtcgccatctctcatccggacttgtcctgggagcgaattggctacaaagtcaacgagggacccgccgtcatccagcgcaacggccgcatcttcctgacctattcggccagcgccacggaccacaactattgcatgggcttgctgacggcccgggccgatgccaatctgatgaaccctgcctcgtgggtgaagtcgcaacagcccatcttcgtgagcaacgcggcaaccaaccagtggggtccgggacataaccagttcacggtctcggaggacggcctcagtgacattctggtctaccacgaccgcggataccgtgacatcaacggcgacccgctcaacgacccgaaccggcggacgcgggtacagaagctgtactggcgcgacgacggcaccccggactttgggattcccgtgcccgacggcccaacgccggtcaggctccgggttgctgcaaatggcgcgtcgagtaatggtgcatatgtccgtttttacacgacgacgggatcggggaacttgaccggaactgcggcacttcccgatacgcaattcaagctcgtgagcccgggtctttcgggcggggacagcgtgagtctggagtcaacgagcaaccccggtacgtatgtgcggcgggtgagcggaagcaccgcggtgcagtttgagcgagggacggcactgaacaccgctgcgctgcgggcatcggcgagcttccggagagtgccgggattgtccgactccgggggagcggtgtcgtttgagtcggtcgagtctccggggcaatatctcaggttggatccgaatgggcgtttgtccgtggcgtcagtggctgaggggactcaggggaggtcaaccttttatttggagtag

本发明通过PCR的方法分离克隆了阿拉伯呋喃糖苷酶abf43，DNA全序列分析结果表明，阿拉伯呋喃糖苷酶abf43全长1446bp。

去除N端19个氨基酸为信号肽序列后的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示：

TASPAVNYVNSLILQRADPHIVKHTDGWYYFTATVPEYDRIVLRRAQTIQGLQSAPETVIWRRKAFGVGSGQVWAPELHYIDGRWYIYVALGVSGQWRIRAFVLEGVGANPLTASWTEKGIIQTNWDTFSLDATTFVANGTRYLVWAQQDPSRNGENSSLFIAPLQNPWTIRGPAVAISHPDLSWERIGYKVNEGPAVIQRNGRIFLTYSASATDHNYCMGLLTARADANLMNPASWVKSQQPIFVSNAATNQWGPGHNQFTVSEDGLSDILVYHDRGYRDINGDPLNDPNRRTRVQKLYWRDDGTPDFGIPVPDGPTPVRLRVAANGASSNGAYVRFYTTTGSGNLTGTAALPDTQFKLVSPGLSGGDSVSLESTSNPGTYVRRVSGSTAVQFERGTALNTAALRASASFRRVPGLSDSGGAVSFESVESPGQYLRLDPNGRLSVASVAEGTQGRSTFYLE

成熟蛋白理论分子量为51kDa，将阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，表明Abf43是一种新的阿拉伯呋喃糖苷酶。

去除编码信号肽序列后的阿拉伯呋喃糖苷酶的基因Abf4如SEQIDNO.4所示：

acagcctcaccggccgtgaactatgtcaactcactcattctgcaacgggccgatcctcacatcgtcaagcacactgatgggtggtactacttcacggcaacagtccccgaatatgaccgcattgtcctgcggagggcacaaaccatccaaggcctgcaatcggcgcccgagacggtaatctggcggcgcaaggccttcggcgtcgggagcgggcaggtgtgggccccggagctgcactacatcgacggccgttggtacatctacgtcgcgctgggagtgtccgggcagtggcgcatccgcgcgttcgtgctggaaggcgttggcgcgaacccgctgacggcctcgtggaccgagaagggcatcatccaaactaactgggacaccttttcactggacgcaacaaccttcgtggccaacggtacgcggtatctcgtctgggcgcagcaggatccttcgcgcaacggtgagaactccagcctgttcatcgcgccgttgcaaaacccctggacgattcgtggaccagccgtcgccatctctcatccggacttgtcctgggagcgaattggctacaaagtcaacgagggacccgccgtcatccagcgcaacggccgcatcttcctgacctattcggccagcgccacggaccacaactattgcatgggcttgctgacggcccgggccgatgccaatctgatgaaccctgcctcgtgggtgaagtcgcaacagcccatcttcgtgagcaacgcggcaaccaaccagtggggtccgggacataaccagttcacggtctcggaggacggcctcagtgacattctggtctaccacgaccgcggataccgtgacatcaacggcgacccgctcaacgacccgaaccggcggacgcgggtacagaagctgtactggcgcgacgacggcaccccggactttgggattcccgtgcccgacggcccaacgccggtcaggctccgggttgctgcaaatggcgcgtcgagtaatggtgcatatgtccgtttttacacgacgacgggatcggggaacttgaccggaactgcggcacttcccgatacgcaattcaagctcgtgagcccgggtctttcgggcggggacagcgtgagtctggagtcaacgagcaaccccggtacgtatgtgcggcgggtgagcggaagcaccgcggtgcagtttgagcgagggacggcactgaacaccgctgcgctgcgggcatcggcgagcttccggagagtgccgggattgtccgactccgggggagcggtgtcgtttgagtcggtcgagtctccggggcaatatctcaggttggatccgaatgggcgtttgtccgtggcgtcagtggctgaggggactcaggggaggtcaaccttttatttggagtag

本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的重组载体，优选为pPIC9-abf43。将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9-abf43。

本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/Abf43。

本发明还提供了一种制备中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组原核表达质粒转化毕赤酵母GS115，得到重组菌株GS115/Abf43。

本发明还提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品工业中应用新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶最适pH为5.0，最适温度50℃。在pH4.5～6.5有较高的酶活性；pH5.0-7.0下稳定性好。本阿拉伯呋喃糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本阿拉伯呋喃糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1：在毕赤酵母中表达的重组阿拉伯呋喃糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；2:通过镍柱纯化的达到电泳纯的Abf43蛋白;3:EndoH脱糖基化后的Abf43蛋白。

图2重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适pH。

图3重组阿拉伯呋喃糖苷酶的pH稳定性。

图4重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度。

图5重组阿拉伯呋喃糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从腐质霉HumicolainsolensY1中分离得到一种新的中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43。酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside(pNPA)，桦木木聚糖，榉木木聚糖及小麦阿拉伯木糖购自Sigma公司，其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）腐质霉HumicolainsolensY1培养基为：麸皮，15.0g/l；阿拉伯糖10.0g/l；(NH₄)₂SO₄，5.0g/l;KH₂PO₄，1.0g/l；KCl，0.5g/l；MgSO₄·7H₂O，0.5g/l；CaCl₂，0.1g/l；FeSO₄·7H₂O，0.01g/l。通过1:1(w/w)的NaOH调整pH值为7.5。

（2）毕赤酵母BMGY，BMMY培养基。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1腐质霉HumicolainsolensY1阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因Abf43的克隆

提取腐质霉HumicolainsolensY1基因组DNA：

将液体培养3天的菌体离心后放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

设计43家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因的表达引物P1，P2

P1:5'-GGGGAATTCACAGCCTCACCGGCCGTG-3'；

P2:5'-GGGGCGGCCGCCTACTCCAAATAAAAGGTTGACCTCCC-3'。

以HumicolainsolensY1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。得到一约1.4kb片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博远志生物技术有限公司测序。

测序显示阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43基因全长1617bp，编码481个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明该基因1-19为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为51kDa，实际成熟蛋白为52kDa左右（图1）。

实施例2重组阿拉伯呋喃糖苷酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoliI+NotI)，同时将编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因Abf43双酶切((EcoliI+NotI)，切出编码成熟阿拉伯呋喃糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43的重组质粒pPIC9-Abf43并转化毕赤酵母GS115，获得重组大肠杆菌菌株GS115/Abf43。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mLBMGY培养液中，30℃200rpm振荡培养48h后，5000rpm离心去上清，使用BMMY培养液诱导（甲醇为诱导物）培养48h。重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达量为0.54U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母细胞中得到了表达并发生糖基化。所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶经过镍柱纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。从的比活为40.7U/mg。

以同样的方法表达基因Abf43的全序列，并在重组大肠杆菌菌株中表达获得阿拉伯呋喃糖苷酶。

实施例3重组阿拉伯呋喃糖苷酶的活性分析

阿拉伯呋喃糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPA生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL2mMpNPA底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于50℃反应10min，加入1.5mL1MNa₂CO₃终止反应，于405nm处测定OD值。

实施例4重组阿拉伯呋喃糖苷酶的性质测定

1、重组阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将纯化的重组阿拉伯呋喃糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行活力测定。结果(图2)表明，重组酶Abf43的最适pH为5.0，在Ph4.0～6.5有60%以上的相对酶活性。阿拉伯呋喃糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明酶在pH4.5-7.0之间均很稳定。

2、阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为阿拉伯呋喃糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，Abf43在45℃下能够稳定。

3、阿拉伯呋喃糖苷酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的pNPA为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的K_m值。经测定，K_m值为1.30mM，最大反应速度V_max为92.0μmol/min/mg。

4、不同金属离子化学试剂对阿拉伯呋喃糖苷酶酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在50℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂EDTA在浓度为5mmol时重组阿拉伯呋喃糖苷酶的活力没有明显变化。但是Fe³⁺，Ag⁺，SDS和β-巯基乙醇强烈抑制其活力（表1）。

表1.各种化学试剂对木糖苷糖酶Abf43活力的影响

表2.木糖苷糖酶Abf43与木聚糖酶Xyn11A的协同作用

Claims (9)

1.一种阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。

2.阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43，其特征在于，编码权利要求1所述的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43。

3.根据权利要求2所述的阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。

4.包含权利要求2所述阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43的重组载体。

5.包含权利要求2所述阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43的重组载体pPIC9-abf43，其中，将序列如SEQIDNO.4所示的阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9-abf43。

6.包含权利要求2所述阿拉伯呋喃糖苷酶基因Abf43的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43。

9.权利要求1所述的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43用于从含有阿拉伯糖残基的多聚物的非还原末端水解生成一个阿拉伯糖分子的应用。