CN105176950A - 一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.5，最适温度80℃，比活为1416U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解榉木木聚糖，燕麦木聚糖和桦木木聚糖以及易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料。

Description

一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～45％，是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子。木质素约占细胞干重的15～25％，是一种复杂酚类聚合物。半纤维素约占细胞干重的30～35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物资源。半纤维素包括木聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖等等，完全降解半纤维素举要多种酶的协同作用，其中木聚糖酶是一种切割β-1,4-糖苷键的主要酶类(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews.2005,29:3-23.)。在食品，饲料和纸浆工业等方面有广阔的应用前景。

在啤酒酿造过程中，麦芽中的木聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性木聚糖酶和木聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。在饲料制粒时，热稳定性优良的木聚糖酶可以较少的损失酶活，并在进食过程中辅助消化提高营养(FlintandBayer.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.2008,1125:280–288.)。而在纸浆漂白时，木聚糖酶可以替代部分有机氯化物，从而减少环境污染(Gangwar,etal.Bioresources.2014,9(2):3733-3754.)。

由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。本次克隆和分离的酸性嗜热木聚糖酶热稳定性非常好，可以适应工业生产中的高温环境，可以更好的应用于饲料、酿酒和造纸工业。本发明中的木聚糖酶在pH3.5-5.5下均具有较高酶活力，具有优良的pH稳定性，在pH2～9之间保持稳定，并且具有胃蛋白酶以及胰蛋白酶抗性，表现出较高的木聚糖酶活性，其热稳定性优良显示出，在饲料，啤酒，造纸等工业中，具有一定的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸性嗜热木聚糖酶。

本发明的另一目的是提供编码上述酸性嗜热木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性嗜热木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述酸性木聚糖酶的应用。

本发明从蓝状菌(Talaromycesleycettanus)中分离得到一种新的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

SEQIDNO.1：

MRFSLATAALLAGPALAAPPAPRHDDKDVGLNALAQRAGKLWFGTAADIPGTDETTDAAYLKILENPANFGEITPANAMKFMYTEPEQNVFNYTGGDYVLNLAERHGQRVRCHNLVWASQLSDFVNNGNWTKESLTAVMRNHIFHVVQHFGRRCYSWDVVNEALNGDGTFSSSIWYDTIGEDYFYLAFQYAQEALAEIHANDVKLYYNDYGIENPGTKADAVHNLVKELRKRDIRIDGIGLESHFEVGFTPSLQDQLSTKQGYIALGLDVAITELDVRFTQAPYYDAAGEKQQAQDYYTSVSSCIEAGPKCIGITVWDFDDKYSWVPYTFAGQGGADIYNATLQAKPAYYAIADALQGKACSVC

其中，该酶基因编码364个氨基酸，N端17个氨基酸为其信号肽序列“MRFSLATAALLAGPALA”(SEQIDNO.3)。

因此，成熟的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A的理论分子量为38.7kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：

APPAPRHDDKDVGLNALAQRAGKLWFGTAADIPGTDETTDAAYLKILENPANFGEITPANAMKFMYTEPEQNVFNYTGGDYVLNLAERHGQRVRCHNLVWASQLSDFVNNGNWTKESLTAVMRNHIFHVVQHFGRRCYSWDVVNEALNGDGTFSSSIWYDTIGEDYFYLAFQYAQEALAEIHANDVKLYYNDYGIENPGTKADAVHNLVKELRKRDIRIDGIGLESHFEVGFTPSLQDQLSTKQGYIALGLDVAITELDVRFTQAPYYDAAGEKQQAQDYYTSVSSCIEAGPKCIGITVWDFDDKYSWVPYTFAGQGGADIYNATLQAKPAYYAIADALQGKACSVC

本发明的木聚糖酶TLXyn10A同时具有好的pH稳定性，并且具有较强的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶降解特性。本发明筛选到Talaromycesleycettanus产生的木聚糖酶，其最适pH值为4.5，在pH2.0～10.0的范围内维持60％以上的酶活性；最适温度为70℃-80℃；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理30分钟,酶活无损失。

本发明提供了编码上述酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A。具体地，该基因的基因组序列如SEQIDNO.4所示：

ATGCGTTTCTCCTTGGCCACTGCAGCTCTTCTCGCTGGCCCTGCCCTGGCAGCGCCACCAGCTCCTCGTCACGATGACAAGGATGTTGGGCTCAACGCCCTGGCCCAGAGAGCAGGCAAGCTCTGGTTCGGCACTGCTGCTGATATCCCCGGCACCGACGAGACGACCGATGCTGCGTACCTAAAAATCTTGGAAAATCCCGCCAACTTCGGCGAGATCACCCCTGCCAACGCCATGAAGTTCATGTACACCGAGCCAGAGCAGAACGTGTTCAACTACACCGGCGGTGACTACGTCCTGAACCTCGCCGAGCGCCACGGCCAGCGTGTCCGCTGCCACAACCTCGTCTGGGCCAGCCAGCTGTCCGACTTCGTCAACAACGGCAACTGGACCAAGGAGTCCCTCACGGCCGTGATGCGGAACCACATCTTCCACGTCGTCCAGCACTTCGGCCGGCGCTGCTACTCGTGGGATGTCGTCAACGAGGCCCTCAACGGCGACGGCACCTTCTCCTCCAGCATCTGGTACGACACCATCGGCGAGGACTACTTCTACCTCGCCTTCCAGTACGCCCAGGAGGCCCTCGCGGAGATCCACGCCAACGACGTCAAGCTCTACTACAACGACTACGGCATCGAGAACCCCGGCACCAAGGCCGATGCCGTGCACAACCTCGTCAAGGAGCTGCGCAAGCGCGACATCCGCATCGACGGCATCGGTCTCGAGTCCCACTTCGAGGTCGGTTTCACCCCCTCCCTACAGGACCAGCTCAGCACCAAGCAGGGCTACATCGCGCTCGGTCTCGACGTCGCCATCACCGAGCTGGACGTGCGCTTCACCCAGGCCCCTTACTACGATGCCGCGGGCGAGAAGCAGCAGGCCCAGGACTACTATACCAGCGTTTCTAGCTGCATCGAGGCCGGCCCCAAGTGCATCGGTATCACCGTCTGGGACTTCGATGACAAGTACTCGTGGGTTCCTTACACTTTCGCCGGCCAGGGTGGTGCAGATATCTACAATGCTACCTTGCAGGCCAAGCCTGCCTACTATGCCATTGCCGATGCTCTTCAGGGCAAGGCCTGCAGCGTCTGCTAG

本发明通过PCR的方法分离克隆了酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶TLXyn10A基因TLXyn10A全长1095bp，编码基因序列全长1044bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGCGTTTCTCCTTGGCCACTGCAGCTCTTCTCGCTGGCCCTGCCCTGGCA

(SEQIDNO.6)。

成熟的酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的cDNA(去信号肽)序列如SEQIDNO.5所示。

SEQIDNO.5

GCGCCACCAGCTCCTCGTCACGATGACAAGGATGTTGGGCTCAACGCCCTGGCCCAGAGAGCAGGCAAGCTCTGGTTCGGCACTGCTGCTGATATCCCCGGCACCGACGAGACGACCGATGCTGCGTACCTAAAAATCTTGGAAAATCCCGCCAACTTCGGCGAGATCACCCCTGCCAACGCCATGAAGTTCATGTACACCGAGCCAGAGCAGAACGTGTTCAACTACACCGGCGGTGACTACGTCCTGAACCTCGCCGAGCGCCACGGCCAGCGTGTCCGCTGCCACAACCTCGTCTGGGCCAGCCAGCTGTCCGACTTCGTCAACAACGGCAACTGGACCAAGGAGTCCCTCACGGCCGTGATGCGGAACCACATCTTCCACGTCGTCCAGCACTTCGGCCGGCGCTGCTACTCGTGGGATGTCGTCAACGAGGCCCTCAACGGCGACGGCACCTTCTCCTCCAGCATCTGGTACGACACCATCGGCGAGGACTACTTCTACCTCGCCTTCCAGTACGCCCAGGAGGCCCTCGCGGAGATCCACGCCAACGACGTCAAGCTCTACTACAACGACTACGGCATCGAGAACCCCGGCACCAAGGCCGATGCCGTGCACAACCTCGTCAAGGAGCTGCGCAAGCGCGACATCCGCATCGACGGCATCGGTCTCGAGTCCCACTTCGAGGTCGGTTTCACCCCCTCCCTACAGGACCAGCTCAGCACCAAGCAGGGCTACATCGCGCTCGGTCTCGACGTCGCCATCACCGAGCTGGACGTGCGCTTCACCCAGGCCCCTTACTACGATGCCGCGGGCGAGAAGCAGCAGGCCCAGGACTACTATACCAGCGTTTCTAGCTGCATCGAGGCCGGCCCCAAGTGCATCGGTATCACCGTCTGGGACTTCGATGACAAGTACTCGTGGGTTCCTTACACTTTCGCCGGCCAGGGTGGTGCAGATATCTACAATGCTACCTTGCAGGCCAAGCCTGCCTACTATGCCATTGCCGATGCTCTTCAGGGCAAGGCCTGCAGCGTCTGCTAG

成熟蛋白理论分子量为38.7kDa，TLXyn10A是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的重组载体，优选为pPIC-TLXyn10A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-TLXyn10A。

本发明还提供了包含上述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的重组菌株，优选所述菌株为酵母菌，优选为重组菌株GS115/TLXyn10A。

本发明还提供了一种制备酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶TLXyn10A。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichiapastoris)GS115，得到重组菌株GS115/TLXyn10A。

本发明还提供了上述酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、果汁、面包、造纸工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为4.5，在pH3.0～5.5都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力；并且具有良好的热稳定性。该木聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在食品工业中，可用于降低啤酒酿造的麦芽汁粘度，降解果汁中残留的半纤维素使之澄清，或者释放戊聚糖包裹的水分使发面更加蓬松。在造纸工业中，可以在高温环境中替代有机氯化物进行纸浆漂白。由于其能降解木聚糖，因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的最适pH。

图2重组木聚糖酶的pH稳定性。

图3重组木聚糖酶的最适温度。

图4重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从(Talaromycesleycettanus)中分离得到一种新的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)TalaromycesleycettanusJCM12802培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1蓝状菌TalaromycesleycettanusJCM12802木聚糖酶编码基因TLXyn10A的克隆

提取蓝状菌12802TalaromycesleycettanusJCM12802基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

根据第10家族木聚糖酶基因的保守序列STFNQY和WDVVNEA序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；

P2:5'-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3'。

以TalaromycesleycettanusJCM12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约500bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德生物技术有限公司测序。拼接后木聚糖酶基因TLXyn10A全长1095bp，编码364个氨基酸和一个终止密码子，N端17个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为38.7kDa。

实施例2重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因TLXyn10A双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有TalaromycesleycettanusJCM12802木聚糖酶基因TLXyn10A的重组质粒pPIC-TLXyn10A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/TLXyn10A。

以同样方法构建含有信号肽序列的木聚糖酶基因TLXyn10A的重组表达质粒，并获得重组重组毕赤酵母菌株。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为1326U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为1416U/mg。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.5，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL1％榉木木聚糖，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。

实施例5重组木聚糖酶TLXyn10A的性质测定

1、重组木聚糖酶TLXyn10A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中80℃下进行榉木木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶TLXyn10A的最适pH为4.5，在pH3.5～5.0有60％以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中80℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明木聚糖酶在pH2.0-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％左右，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在80℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为80℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，TLXyn10A有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，80℃下测定酶活性，计算出其K_m值。经测定，以榉木木聚糖为底物时的K_m值为2.4mg/mL，最大反应速度V_max为1829U/mg。

4、不同金属离子化学试剂对TLXyn10A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在80、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大部分部分离子和化学试剂在浓度为5mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。仅Ag⁺可以抑制其将近15％的活力。

5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH2.0Gly-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/木聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温30min和60min取样，在pH4.5及80℃条件下测定酶活性。实验结果表明木聚糖酶TLXyn10A用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，蛋白酶处理后的TLXyn10A仍具有85％以上的酶活。

6、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶可作用于各种木聚糖，如燕麦木聚糖，榉木木聚糖，桦木木聚糖以及小麦阿拉伯木聚糖，主要切割β-1,4糖苷键，可将木聚糖分解为木糖或木二糖。几乎不降解纤维素。

7、高温处理下的木聚糖酶

该酶具有较强的热稳定性，用pH4.50.2mM柠檬酸磷酸氢二钠进行稀释，调整浓度为50μg/mL，进行沸水浴处理，10min后仍能保持80％以上活性。

Claims (10)

1.一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。

2.如权利要求1所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其特征在于，序列SEQIDNO.1在N端包含信号肽，所述信号肽的序列如SEQIDNO.3所示。

3.一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A。

4.如权利要求3所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。

5.如权利要求3所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A，其特征在于，所述酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A包括信号肽序列，所述序列如SEQIDNO.6所示。

6.包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的重组载体。

7.包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A的重组载体pPIC-TLXyn10A。

8.包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的重组菌株。

9.一种制备酸性嗜热木聚糖酶基因TLXyn10A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A。

10.权利要求1所述酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A的应用。