CN102586206B

CN102586206B - 一种高温酸性木聚糖酶xyn10c1及其基因和应用

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Publication number: CN102586206B
Application number: CN201110009257.XA
Authority: CN
Inventors: 詹志春; 张菁; 陈小燕
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: Sunhy Technology Hubei Co ltd; Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2011-01-17
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2031-01-17
Also published as: CN102586206A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1及其基因和应用。本发明提供了一种来源于青霉的木聚糖酶XYN10C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的编码基因xyn10C1。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.0～5.5，最适温度75℃，比活为137.36U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解小麦阿拉伯木聚糖以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，酿酒、食品、能源工业等。

Description

一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1及其基因和应用。

背景技术

半纤维素是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-乳糖以直链或支链聚合而成的多糖，分子主链可由一种或几种糖基组成，链短且存在侧链，并且具有多样的侧链取代基，如乙酰基、半乳糖、阿拉伯糖或葡萄糖醛酸残基。木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用；而在造纸制浆过程中富含木聚糖的工业废料往往直接排入水体，导致水质富营养化从而严重破坏生态环境，这些现象在我国尤为突出。而另一方面，作为木聚糖水解产物主要成分的低聚木糖是一种附加值高，市场前景看好的功能性食品添加剂，目前已成为国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。因此对木聚糖的有效利用和深层开发已成为目前国内外的研究热点。

对木聚糖酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于饲料工业、食品工业、制浆造纸工业、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶，并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。其中，大多数木聚糖酶的最适作用pH值在6.0～7.0。酸性木聚糖酶已经引起研究人员的广泛关注，酸性木聚糖酶在饲料行业中的应用，可以有效破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用(刘强和冯学琴，动物营养学报.1999，11：6-11.)在啤酒酿造行业具有潜在的应用前景，在啤酒酿造过程中，不被降解的阿拉伯木聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性木聚糖酶与葡聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。因此，酸性木聚糖酶的产生、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。

由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有高温酸性的木聚糖酶可以更好的应用于饲料、酿酒，食品工业。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的高温酸性木聚糖酶木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高温酸性木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高温酸性木聚糖酶的应用。

本发明从青霉(Penicillium sp)中分离得到一种新的高温酸性木聚糖酶XYN10C1。

本发明提供了一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MHLSSTLVAAAVLPLASAQLNELAQKAGKLYFGTATDNDELNNTEYYSIVTDTREF

GQLTPANGMKWQFVEPEYNVFNFSDGAVVADLAAKDRQYLRCHNLVWESELAP

WVTEMTWDKANFTAMLRQHVIGEVSHWKGRCYAWDVVNEGLNDNGTYRSDIF

YDTLGEDYFKVVYQAASEADPGAKLYYNDYNIEYPGPKADAARGIVKMLQDAGI

KIDGIGLESHFIVGETPTIDQQISNMEAFTAMGVEVAVTELDIRLELPATAENLAQQS

DDYRTTVGACMQVKGCVGMTVWDFYDPF SWVPSTFPGYGDADLYFANFTKHPA

YYGVVDALTNNTSKCKSGQHKPKRSKPLDV

其中，该酶基因编码356个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“mhlsstlvaaavlplasa”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的高温酸性木聚糖酶XYN10C1的理论分子量为38.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

QLNELAQKAGKLYFGTATDNDELNNTEYYSIVTDTREFGQLTPANGMKWQFVEPE

YNVFNFSDGAVVADLAAKDRQYLRCHNLVWESELAPWVTEMTWDKANFTAML

RQHVIGEVSHWKGRCYAWDVVNEGLNDNGTYRSDIFYDTLGEDYFKVVYQAAS

EADPGAKLYYNDYNIEYPGPKADAARGIVKMLQDAGIKIDGIGLESHFIVGETPTI

DQQISNMEAFTAMGVEVAVTELDIRLELPATAENLAQQSDDYRTTVGACMQVKGC

VGMTVWDFYDPFSWVPSTFPGYGDADLYFANFTKHPAYYGVVDALTNNTSKCKS

GQHKPKRSKPLDV

本发明的木聚糖酶XYN10C1同时具有好的热稳定性而在常温下在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性，其最适pH值为5.0，在pH2.0～6.5的范围内维持50％以上的酶活性；最适温度为75℃，在50℃仍具有50％左右的酶活力；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120分钟，酶活性提高了13％以上。

本发明提供了编码上述高温酸性木聚糖酶xyn10C1。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atgcatctgtcttccactctcgtcgccgccgcggtcctgccgctggcctcggcccagctcaacgagctggcccagaaggccggg

aagctgtacttcggcacggctactgacaacgacgagctgaacaacaccgagtactacagcatagtgactgacacgagggagttc

gggcagctcacgccggccaacggtatgaagtggcaattcgtcgagcccgaatacaacgtgttcaacttcagcgacggcgccgtc

gtcgcagacctcgccgccaaggacaggcagtacctgcgctgccacaacctggtctgggagagcgagctcgcgccgtgggtca

ccgagatgacgtgggacaaggccaactttacggccatgctgcgccagcacgtcatcggggaggtgagccactggaagggccg

gtgctacgcctgggacgtggtgaacgagggcctcaacgacaacggcacgtaccggtccgacatcttttacgacaccctgggcg

aggactacttcaaggtggtctaccaggcggccagcgaggccgacccgggcgcgaagctgtactacaacgactacaacatcga

gtacccgggccccaaggccgacgccgccagggggatcgtcaagatgctccaggacgccggcatcaagatcgacggcatcgg

gctggagagccacttcatcgtcggcgagacgcccaccatcgaccagcagatcagcaacatggaggccttcaccgccatgggcg

tcgaggtggccgtgaccgagctcgacatccggctcgagctgccggccaccgccgagaacctggcccagcagagcgacgact

accgcaccacggtcggcgcgtgcatgcaggtcaagggctgtgtcggcatgaccgtctgggacttctacgatcctttttcatgggtg

ccgagtacatttcccggatacggggacgcggatctttacttcgccaacttcaccaagcacccggcctactacggcgtcgtcgacg

cgctgaccaacaacaccagcaagtgcaagtctggccagcacaagcccaagaggagcaagccgctggacgtgtaa

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn10C1，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN10C1结构基因xyn10C1全长1071bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGCATCTGTCTTCCACTCTCGTCGCCGCCGCGGTCCTGCCGCTGGCCTCGGCC

(SEQ ID NO.6)。

成熟的木聚糖酶XYN10C1的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

cagctcaacgagctggcccagaaggccgggaagctgtacttcggcacggctactgacaacgacgagctgaacaacaccgagt

actacagcatagtgactgacacgagggagttcgggcagctcacgccggccaacggtatgaagtggcaattcgtcgagcccgaa

tacaacgtgttcaacttcagcgacggcgccgtcgtcgcagacctcgccgccaaggacaggcagtacctgcgctgccacaacctg

gtctgggagagcgagctcgcgccgtgggtcaccgagatgacgtgggacaaggccaactttacggccatgctgcgccagcacgt

catcggggaggtgagccactggaagggccggtgctacgcctgggacgtggtgaacgagggcctcaacgacaacggcacgta

ccggtccgacatcttttacgacaccctgggcgaggactacttcaaggtggtctaccaggcggccagcgaggccgacccgggcg

cgaagctgtactacaacgactacaacatcgagtacccgggccccaaggccgacgccgccagggggatcgtcaagatgctcca

ggacgccggcatcaagatcgacggcatcgggctggagagccacttcatcgtcggcgagacgcccaccatcgaccagcagatc

agcaacatggaggccttcaccgccatgggcgtcgaggtggccgtgaccgagctcgacatccggctcgagctgccggccaccg

ccgagaacctggcccagcagagcgacgactaccgcaccacggtcggcgcgtgcatgcaggtcaagggctgtgtcggcatgac

cgtctgggacttctacgatcctttttcatgggtgccgagtacatttcccggatacggggacgcggatctttacttcgccaacttcacca

agcacccggcctactacggcgtcgtcgacgcgctgaccaacaacaccagcaagtgcaagtctggccagcacaagcccaagag

gagcaagccgctggacgtgtaa

成熟蛋白理论分子量为38.0kDa，将木聚糖酶基因xyn10C1序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Glomerella graminicola M1.001的木聚糖酶氨基酸序列一致性为53％。说明XYN10C1是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1的重组载体，优选为pPIC-xyn10C1。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn10C1。

本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/xyn10C1。

本发明还提供了一种制备高温酸性木聚糖酶XYN10C1的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10C1。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn10C1。

本发明还提供了上述高温酸性木聚糖酶XYN10C1的应用。

目前，青霉来源的木聚糖酶在pH 4.0～5.0条件下具有较高酶活，但在pH 3.0下几乎没有活性，而且热稳定较差。本发明介绍的木聚糖酶XYN10C1最适pH值为5.0，在pH2.0～6.5的范围内维持50％以上的酶活性；最适温度为75℃，在50℃仍具有50％左右的酶活力，在65℃具有良好的热稳定性。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为5.0，在pH2.0～6.5都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本木聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性何不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于提高发酵效率，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体，而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的最适pH。

图2重组木聚糖酶的pH稳定性。

图3重组木聚糖酶的最适温度。

图4重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Penicillium sp.培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％ Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 青霉Penicillium sp.木聚糖酶编码基因xyn10C1的克隆

提取青霉Penicillium sp.基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3′；

P2：5′-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3′。

以Penicillium sp.C1 CGMCC 4432总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约158bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYN10C1 TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后XYN10C1木聚糖酶基因全长1071bp，编码356个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端18个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为38.0kDa。

实施例2 重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码木聚糖酶的基因xyn10C1双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Penicillium sp.C1 CGMCC 4432木聚糖酶基因xyn10C1的重组质粒pPIC-xyn10C1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10C1。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃ 250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃ 250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为41.68U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为100.68U/mg。

实施例3 重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.0，75℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4 重组木聚糖酶XYN10C1的性质测定

1、重组木聚糖酶XYN10C1的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶XYN10C1的最适pH为5.0，在pH2.0～6.5有50％以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.0缓冲液体系中75℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明木聚糖酶在pH 2.0-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％以上，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在75℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为75℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，XYN10C1有良好的热稳定性，在65℃下温育1h，能保持95％以上的酶活。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其在75℃下的K_m值。经测定，以可溶性小麦阿拉伯木聚糖和桦木木聚糖为底物时的K_m值分别为6.923和4.313mg/mL，最大反应速度V_max分别为209.3和195.4μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYN10C1酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在75℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化，只有SDS微弱抑制其活力。当Cu²⁺，Ag⁺，和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制XYN10C1酶活力，5mmol SDS使其活力全部丧失。

5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH2.0 KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0 Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0 KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0 Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/木聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温60和120min取样，在pH5.0及75℃条件下测定酶活性。实验结果表明木聚糖酶XYN10C1用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120min后，胰蛋白酶处理后的XYN10C1的酶活比处理前提高了26％，胃蛋白酶处理后的XYN10C1的木聚糖酶活性比处理前提高了18％。

6、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于木聚糖外，对于大麦葡聚糖、soluble wheat arabinoxylan也有一定的降解作用(表2)。其对可溶性的小麦阿拉伯木聚糖的降解能力相对于桦木木聚糖可以达到148.9％以上。

表2.木聚糖酶XYN10C1底物特异性分析

不同底物	相对酶活力(％)
		birch xylan	100.00

beech xylan	101.69
		wheat-可溶	148.90
Barleyβ-glucan	8.21
		CMC	0
wheat-不可溶	0

Claims

1.一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1，其特征在于，编码权利要求1所述的高温酸性木聚糖酶XYN10C1。

3.如权利要求2所述的高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1的重组载体。

5.包含权利要求2所述高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1的重组载体pPIC-xyn10C1。

6.包含权利要求2所述高温酸性木聚糖酶基因xyn10C1的重组菌株。

7.一种制备高温酸性木聚糖酶XYN10C1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10C1。

8.权利要求1所述高温酸性木聚糖酶XYN10C1用于降解木聚糖的应用。