CN101012457A - 制备耐热木聚糖酶、耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备耐热木聚糖酶、耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶的方法。该方法，是以农业废弃物为碳源，将嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18，在40－60℃，发酵得到含耐热木聚糖酶、耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶的发酵液，经纯化得到电泳级的耐热木聚糖酶，耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶。本发明的方法，简单易行，容易实现工业化生产。本发明方法制备的耐热木聚糖酶能改善馒头和面包的品质，耐热β－木糖苷酶与木聚糖酶协同作用能够将木聚糖彻底水解。耐热β－葡萄糖苷酶应用于苦杏苷、大豆苷、染料木苷、纤维寡糖等的水解中，具有显著的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的方法。
背景技术
木聚糖酶(Xylanase，EC 3.2.1.8)是一类重要的水解酶，主要以内切方式作用于木聚糖主链上的β-1，4-糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的低聚糖和木糖。目前，国外对嗜热真菌木聚糖酶的研究相对较多，Haltrich et.al.(Enzyme Microb.Technol.15：854-860)用Schizophylum commune BT2115以微晶纤维素为碳源发酵，木聚糖酶活力达到4839U/mL发酵液，是目前液体发酵产木聚糖酶报道的最高水平。国内已有一些真菌产木聚糖酶的研究报道，但对真菌产耐热木聚糖酶及其嗜热真菌菌株的研究报道还很少。李秀婷(食品与发酵工业，2006，32(1)：23-27)等报道了一株嗜热真菌嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)CBS288.54-M18产耐热木聚糖酶，液体发酵酶活力为1834U/ml。
双水相系统(Aqueous Two-Phase System，ATPS)是20世纪60年代被提出用于分离生化物质的一种“液-液”提取技术。现已广泛用于分离细胞、生物膜、病毒、蛋白质、核酸和其它的生物分子。双水相系统具有操作简易、高载量、相系统一步生成、相物质可再循环、易规模化等优点，成为最有工业化潜力的一门技术。再者，双水相分离体系具有条件温和、生物兼容性好、没有毒性等优点使其在酶、蛋白等活性物质分离上具有重要的应用价值。近年来国外已有一些应用双水相系统(ATPS)纯化木聚糖酶的研究报道，如应用聚乙二醇/磷酸钾盐体系对嗜热真菌Melanocarpusalbomyces IIS-68产胞外木聚糖酶进行了分离萃取；利用聚乙二醇(PEG)/磷酸钾盐系统纯化来自Bacillus pumilus的木聚糖酶，研究了12种包含不同的PEG分子量、PEG浓度、磷酸盐浓度、氯化钠浓度的ATP系统，结果在最优条件下木聚糖酶活力回收率达90％以上，达到了相当高的纯度。目前国内应用双水相法纯化生物活性物质的研究报道较多，但没有见到用来纯化木聚糖酶的专利和研究报道。
馒头和面包是传统的主食品，但是在馒头和面包的工业化生产中面临着几个相似的问题，即如何延缓在贮存过程中的老化、延长馒头和面包的货架期以及替代或减少化学添加剂用量。因此，研制出改善馒头和面包品质的的生物酶改良制剂就显得非常重要。目前国内外已有许多馒头改良剂的专利和研究报道，袁建国等发明了一种用生物酶改良馒头品质的方法(申请号：200410024487.3)，发明将葡萄糖氧化酶、脂肪酶和淀粉酶混合制成复合酶制剂，添加到在面团中后提高了馒头的白度，增大了馒头的体积，延缓了老化，同时还缩短了馒头的生产周期。贾英民等发明了一种专用粉复合酶制剂(申请号为200510112661.4)，添加到馒头中后起到了与上述相近的效果。王金水(粮油食品科技，2004，12(1)：4-7)等在面团中添加了商用淀粉酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶等复合酶，结果发现在馒头贮存过程中能起到一定的延缓老化的作用。苏东民(Eur Food Res Technol，2005，220：540-545)等在面团中添加了两种商用内切木聚糖酶，使馒头的比容得到了明显的增加，组织结构也有明显改善。
目前国内还没有关于木聚糖酶在面包中应用的专利，相关的文献报道也很少。李秀婷(食品与发酵工业，2006，32(1)：23-27)等研究了嗜热棉毛菌产耐热木聚糖酶对面包品质及老化的影响作用，探讨了耐热木聚糖酶影响面包老化的动力学，发现适量添加耐热木聚糖酶的面包品质得到了明显改善，并且老化速度变缓。邓伟(中国粮油学报，2005，20(1)：1-5)等研究了橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivaceovirdis)E-86木聚糖酶组对面包品质的影响，试验结果表明，添加20ppm木聚糖酶组的面包比容增加了38.8％，新鲜面包芯硬度降低了1/3，面包老化速率也明显减小。张勤良(食品与发酵工业，2004，30(7)：21-25)等探讨了商用中性木聚糖酶对面粉粉质、面包焙烤品质以及面包贮存过程中老化程度的影响，结果表明，中性木聚糖酶能显著地改善面粉的粉质，当添加量为0.3ml/kg(面粉)时，面团的形成时间可减少50％左右，能有效地改善面包焙烤品质，明显地增加面包的体积和比容，同时可以改善面包心的弹性和硬度，减小面包皮的硬度，酶添加范围为0.05～0.48ml/kg(面粉)，能增加面包的抗老化作用，贮藏7天后，面包的硬度和弹性没有明显变化，延长了货架期。
β-木糖苷酶(β-1，4-Xylosidase，EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的一种，主要催化水解β-木糖苷键，从而将木寡糖彻底分解为木糖。木聚糖降解酶系在能源、造纸和医药等行业有广泛的应用前景。在能源产业中，农业废弃物中的木聚糖经木聚糖酶降解后生成寡糖，再由木糖苷酶完全降解，产生的木糖可以被细菌及真菌转换成酒精等燃料，因此在生物质能源生产中发挥重要的作用。目前，国内关木聚糖降解酶系的研究主要集中于β-1，4-木聚糖酶，而对β-木糖苷酶的研究相对较少，相关专利也很少。仅一项由一丹麦公司申请的关于木糖苷酶的专利(中国专利号：CN96194959.7)，相关研究报道也仅有曲霉(Aspergillus)β-木糖苷酶的纯化、β-木糖苷酶基因的克隆表达及一种草菇中木糖苷酶的分离纯化。微生物β-木糖苷酶大部分为胞内酶，少数真菌能产胞外β-木糖苷酶。
葡萄糖苷酶(Glucosidase，EC 3.2.1.21)是一类异型水解酶，属于纤维素复合酶系中的一种。葡萄糖苷酶具有非常重要的水解作用，能够应用于很多行业。葡萄糖苷酶能够在纤维素酶降解纤维素生产酒精的过程中发挥重要的作用：通过水解降解过程中生成的纤维二糖和低聚糖，降低二糖对纤维素酶的水解抑制作用，达到促进纤维素酶的水解、提高水解效率的效果；葡萄糖苷酶能够合成一些重要的药物及其前体物质，在医药行业具有潜在的应用前景；葡萄糖苷酶还能够水解大豆苷，将苷元型大豆异黄酮水解成游离甙元型，而游离型具有更为广泛的生理活性作用；同时葡萄糖苷酶还能够水解苦杏苷，在某些食品中起到脱涩脱苦的作用。正是由于葡萄糖苷酶具有诸多应用价值，越来越受到研究人员的重视。目前国内外已有许多葡萄糖苷酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中一般对中温菌的产酶研究较多，而对嗜热微真菌产耐热β-葡萄糖苷酶的研究相对较少。
嗜热微生物是一类能够在较高温度下正常生长代谢的微生物，嗜热微生物及其所产耐热酶与一般普通微生物产酶相比具有许多明显的优势，如较高温度下发酵培养一般不容易感染杂菌；嗜热微生物所产的酶一般都具有较高的温度稳定性和较高的反应温度，而较高的反应温度能够提高酶的反应速率和水解效率；另外，热稳定的酶更有利于运输、储藏和使用，更适合于工业化应用等。目前国内关于嗜热微生物及其产酶研究的相关报道还很少，因此，获得优良的嗜热微生物菌株以及对其产酶和性质进行深入研究越来越受到研究和生产人员的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的方法。
本发明所提供的制备耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的方法是以农业废弃物为碳源，将嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18，在40-60℃，发酵得到耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶。
所述发酵的方法为固体发酵或液体发酵，所述固体发酵是将所述嗜热拟青霉J18接种到固体发酵培养基上发酵，用柠檬酸缓冲液冲洗，过滤得到含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液；所述液体发酵是将所述嗜热拟青霉J18接种到液体发酵培养基上发酵后，过滤发酵液得到含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液；所述柠檬酸缓冲液为含有柠檬酸和柠檬酸三钠的缓冲液，所述柠檬酸缓冲液优选为含有0.05mol/L(50mM)柠檬酸和0.05mol/L(50mM)柠檬酸三钠的缓冲液。
所述固体发酵培养基是由重量份数比为1∶0.01-0.1∶2-6的农业废弃物粉、酵母提取物和水组成；所述固体发酵培养基优选为由重量份数比为1∶0.04∶5的农业废弃物粉、酵母提取物和水组成。
所述液体发酵培养基为含有农业废弃物粉10-60g/L，尿素或酵母提取物或胰蛋白胨5-20g/L，CaCl2 0.1-1g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4 0.1-1g/L，初始pH值为5-9的培养基。优选为含有农业废弃物粉40g/L，尿素或酵母提取物或胰蛋白胨10g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4 0.3g/L，初始pH值为7的培养基。
所述农业废弃物为小麦秸杆、麸皮或玉米芯。
所述发酵的时间为2-10天。
所述发酵所用的种子是从保存斜面上划线接种于新配制的PDA斜面或平板上，然后将斜面或平板放置于40-60℃培养箱中静止培养2-8天得到的；将斜面上的孢子用质量百分含量为20％甘油溶液洗下作为固体发酵种子，平板培养的菌体则直接用于液体发酵种子。
按照上述固体发酵方式制备的含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液，木聚糖酶的活力为5,000-20,000U/g农业废弃物(干基碳源)，木糖苷酶的活力为20-100U/g农业废弃物(干基碳源)，葡萄糖苷酶的活力为20-100U/g农业废弃物(干基碳源)。
按照液体发酵方式制备的含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液，木聚糖酶的活力为200-2,000U/ml发酵液，木糖苷酶的活力为2-4U/ml发酵液，葡萄糖苷酶的活力在1.5-4U/ml发酵液。
所述方法还包括将所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液进行纯化后，得到耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶。
所述固体发酵的耐热木聚糖酶的纯化方法为双水相法；所述双水相法为在所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中，加入是所述粗酶液质量25％的聚乙二醇、是所述粗酶液质量50％的硫酸铵、以及是所述粗酶液质量35％的蒸馏水，混匀后，静置2小时或离心待其完全分层，上层即纯化的木聚糖酶。
所述液体发酵的耐热木聚糖酶的纯化方法包括下述步骤：
1)向固体发酵得到的含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到20％饱和度，冰水浴中搅拌30分钟，然后10,000×g冷冻离心10分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到50％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，10,000×g冷冻离心10分钟，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐热木聚糖酶酶液。
2)将初步纯化的耐热木聚糖酶酶液，过Sephacry S-200HR凝胶过滤柱层析，用pH7.3 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集目标峰。
3)将步骤2)得到的洗脱液收集得到的目标峰过DEAE52弱阴离子层析柱，用0.4-0.7mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标蛋白峰即为纯化的耐热木聚糖酶。
按照上述方法纯化木聚糖酶纯化过程中酶活力回收率为90％以上，比酶活力为1,000U/mg以上，与粗酶液相比，比酶活力提高2-5倍。
所述纯化得到耐热β-木糖苷酶的步骤为：
1)向所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到30-50％饱和度，冰水浴中搅拌0.5-2小时，然后8,000-14,000×g离心10-30分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到55-65％饱和度，冰水浴中搅拌0.5-2小时，8,000-14,000×g离心10-30分钟，将沉淀用少量的磷酸-柠檬酸缓冲液溶解得到初步纯化的木糖苷酶液；所述磷酸-柠檬酸缓冲液为含有0.025mol/L柠檬酸和0.025mol/L柠檬酸三钠。
2)将上述经初步纯化的酶液用5-50mM pH5.0-8.0磷酸缓冲液透析，然后过DEAE52弱阴离子层析柱，用20-200mM NaCl溶液洗脱；
3)步骤2)得到的洗脱液用5-50mM pH5.0-8.0的磷酸缓冲液透析，然后过QSepharose Fast Flow(QSFF)强阴离子层析柱，最后用30-300mM NaCl溶液洗脱，洗脱液即为木糖苷酶。
上述方法纯化后的木糖苷酶的比酶活力为37.65U/mg，与粗酶液相比，比酶活力提高了35.64倍。
所述纯化耐热β-葡萄糖苷酶的步骤为：
1)透析，将上述条件下制备的耐热β-葡萄糖苷酶粗酶液用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液透析；
2)将步骤1)过DEAE52弱阴离子层析柱，用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液以0.2-2ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质，然后用50-500mM的NaCl溶液洗脱，收集目标蛋白；
3)将步骤2)得到的收集液过Sephacryl-S200凝胶层析柱，用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液洗脱，流速为0.2-2ml/min，收集目标蛋白即为纯化的葡萄糖苷酶。
按照上述方法纯化葡萄糖苷酶，纯化过程中葡萄糖苷酶的酶活力回收率为20％以上，比酶活力由0.38U/mg提高到了80U/mg，与粗酶液相比纯化200倍。
本发明的方法，采用嗜热拟青霉J18菌株，以小麦秸杆、玉米芯等农业废弃物为碳源，采用固体或液体发酵方式生产三种酶，极大的降低了生产成本。本发明分别采用双水相法和色谱层析法对所产三种酶分别进行纯化并得到了电泳级纯酶。本发明的方法简单易行，且制备的酶的纯度及回收率均较高，容易实现工业化生产。
本发明的方法制备的耐热木聚糖酶具有热稳定性好、水解性能突出等优点；该木聚糖酶能够应用于制浆造纸、能源、饲料、酿造等很多行业中；将木聚糖酶应用于馒头和面包的加工过程中，起到了很好的改善馒头和面包品质的效果，使用该木聚糖酶加工馒头使馒头的比容增大了10-20％；白度有明显的提高；馒头的组织结构有明显的改善；老化在一定程度上得到了延缓，初始硬度降低了10-30％；使用该木聚糖酶加工面包使面包的比容增大20-45％；面包的组织结构有明显的改善；面包的老化在一定程度上得到了延，缓储存7天后，面包芯的硬度为对照的40-80％。
本发明的方法制备的耐热β-木糖苷酶，具有水解底物专一、热稳定性好、pH稳定范围广等优点，该酶能够与木聚糖酶协同作用彻底水解木聚糖生成木单糖，这在生物质能源开发过程中具有重要的作用，此外，该酶还在食品、饲料、造纸等行业具有应用前景。
本发明的方法制备的耐热β-葡萄糖苷酶，采用本发明所提供的方法纯化得到了电泳级纯酶，该酶具有水解大豆苷、苦杏苷、染料木苷、水杨苷、纤维寡糖等重要特性，具有比较大的应用潜力，在水解大豆苷大豆异黄酮时，将苷元型大豆异黄酮水解成游离甙元型，而游离型具有更为广泛的生理活性作用；水解苦杏苷的特性使其能够在某些食品中起到脱涩脱苦的作用；该酶还能在一些新的功能性糖及去污剂的生物合成过程中起到重要的作用。
附图说明
图1为耐热木聚糖酶纯化电泳图
图2为耐热β-木糖苷酶纯化电泳图
图3为耐热β-葡萄糖苷酶纯化电泳图
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、耐热木聚糖酶的制备
1、固体发酵生产耐热木聚糖酶
1)接种用嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18的培养：
嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)种子从保存PDA斜面上划线接种于新配制的PDA斜面或平板上，然后将斜面或平板放置于40-60℃培养箱中静止培养2-8天。用质量百分含量为20％甘油溶液将斜面上的孢子洗下，洗下的孢子液用于固体发酵产酶，生长的平板则直接用于液体发酵用。
2)固体发酵方式生产木聚糖酶液
以嗜热拟青霉J18为发酵菌株、天然农业废弃物小麦秸杆为碳源采用固体发酵方式生产木聚糖酶。
固体发酵的培养基为：小麦秸杆5g/瓶(250ml三角瓶)，酵母提取物0.04g/g小麦秸杆粉，加入是小麦秸杆粉与酵母提取物总质量的5倍的水，121℃灭菌20分钟。冷却后即可接种。
将步骤1)用质量百分含量为20％的甘油溶液洗下的嗜热拟青霉J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)孢子(孢子浓度为106cfu/ml)接种在装有固体发酵培养基的250ml三角瓶中(每瓶中含5g小麦秸杆，0.2g酵母提取物)，每瓶接种106cfu，将孢子在培养基中混匀，50℃静置培养，培养后，每天取一瓶，提取粗酶液检测木聚糖酶活性。
粗酶液提取方法为：在固体发酵的培养基中加入是培养基10倍质量的含0.05mol/L(50mM)磷酸和0.05mol/L(50mM)柠檬酸三钠的柠檬酸缓冲液，200rpm室温振荡浸提2小时，将缓冲液倒进离心管，10,000×g冷冻离心10分钟，得到的上清液即为含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
木聚糖酶活力的测定方法：采用DNS法，即取0.1ml稀释的上述制备的粗酶液，加入到0.9ml用0.05mol/L、pH6.20的柠檬酸缓冲液配制的1％桦木木聚糖底物溶液中，50℃反应10分钟；用DNS(3，5，二硝基水杨酸法)显色法测定所释放的还原糖量。木聚糖酶活力单位定义为：在50℃条件下，每分钟生成1μmol木糖所需要的酶量为一个单位(U)。
结果表明，固体发酵产木聚糖酶的产量在第4天时开始显著增加，到第8天时达到最高，为18,580U/g干基碳源。第9天酶活力开始缓慢下降。干基碳源的量是指配置培养基所用碳源农业废弃物(此处指玉米芯粉)的干重。
3)耐热木聚糖酶的纯化
采用双水相法(ATPS)纯化木聚糖酶，选取聚乙二醇(PEG-4000)/硫酸铵作为成相体系，纯化方法为：在步骤2)所述固体发酵8天后制备含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中，加入所述粗酶液质量25％的聚乙二醇、所述粗酶液质量50％的硫酸铵、以及所述粗酶液质量35％的蒸馏水，混匀后，静置2小时待其完全分层，上层即纯化的木聚糖酶，经电泳鉴定纯化的酶液，结果如图1所示，结果表明，双水相法纯化后的耐热木聚糖酶已达到电泳纯，该木聚糖酶的分子量为26kDa。图1中泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为固体发酵产粗酶液，泳道3为纯化的木聚糖酶。
按照步骤1中步骤2)所述木聚糖酶活力的测定方法，检测纯化后的耐热木聚糖酶的活性，结果如表1所示。在此条件下纯化的粗酶液酶活力回收率为94.1％，木聚糖酶的比活力为1,335.7U/mg，粗酶液为266.3U/mg，与粗酶液相比，木聚糖酶的比活力提高了5倍。
表1纯化后木聚糖酶的活力测定
| 步骤 | 总酶活力(U) | 总蛋白(mg) | 酶比活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 |
| 粗酶液 | 865.5 | 3.25 | 266.3 | 100 | 1 |
| 纯酶液(上相) | 814.8 | 0.61 | 1335.7 | 94.1 | 5.0 |
2、液体发酵方式生产木聚糖酶
1)粗酶液的制备
液体发酵培养基：玉米芯粉碳源40g/L，胰蛋白胨10g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4 0.3g/L；121℃灭菌20分钟，培养基的pH值为7。
液体发酵：在步骤1中的步骤1)制备的接种用嗜热拟青霉J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)平板上刮下1cm2大小的嗜热拟青霉菌丝体，接种在装有60ml液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，50℃、200rpm振荡培养，培养5天后将发酵液10,000×g冷冻离心10分钟，上清液即为含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
按照步骤1中步骤2)所述木聚糖酶活力的测定方法，检测液体发酵产木聚糖酶的产量，结果表明在第5天时木聚糖酶的产量达到最高值1,380U/ml发酵液。
2)液体发酵方式生产木聚糖酶的纯化
①硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到20％饱和度，冰水浴中搅拌30分钟，然后10,000×g冷冻离心10分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到50％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，10,000×g冷冻离心10分钟，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐热木聚糖酶酶液。
②凝胶过滤层析：经硫酸铵沉淀纯化后的酶液，经凝胶过滤柱层析进一步纯化。选用Pharmacia公司的Sephacry S-200HR为凝胶柱填料，层析柱长40cm，直径1.0cm。平衡缓冲液及洗脱缓冲液：pH7.3 20mM Tris-HCl，流速0.3ml/min，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)。
③离子交换层析：上述所得酶液经离子交换层析纯化，采用Whatman公司生产的DE52弱阴离子性离子交换剂作为柱料，用20mM pH7.3 Tris-HCl缓冲液平衡，上样后用0.4-0.7M的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)，最后通过电泳(SDS-PAGE)检验其纯度。
经过上述三步纯化得到了电泳纯木聚糖酶，纯化过程中，按照步骤1中步骤2)所述木聚糖酶活力的测定方法，比酶活达到1229.4U/mg，与粗酶液相比纯化了2.38倍，回收率为38.3％，具体结果如下表2。
表2液体发酵产木聚糖酶纯化表
| 步骤 | 总酶活力U | 总蛋白量mg | 比酶活力U/mg | 酶活力回收率％ | 纯化倍数 |
| 粗酶液 | 5938.9 | 11.48 | 517.3 | 100 | 1 |
| 硫酸铵沉淀 | 4684.2 | 7.26 | 645.2 | 78.9 | 1.25 |
| S-200凝胶过滤层析 | 3231.2 | 4.89 | 660.8 | 54.4 | 1.28 |
| DEAE-52离子交换层析 | 2274.3 | 1.85 | 1229.4 | 38.3 | 2.38 |
实施例2、耐热β-木糖苷酶的制备
1、固体发酵生产耐热β-木糖苷酶
1)接种用嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18的培养：
嗜热拟青霉J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)种子从保存斜面上划线接种于新配制的PDA斜面或平板上，然后将斜面或平板放置于40-60℃培养箱中静止培养2-8天。用质量百分含量为20％甘油溶液将斜面上的孢子洗下，洗下的孢子液用于固体发酵产酶，生长的平板则直接用于液体发酵用。
2)固体发酵方式生产耐热β-木糖苷酶
以嗜热拟青霉J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)为发酵菌株、天然农业废弃物小麦秸杆为碳源采用固体发酵方式生产耐热木糖苷酶。
固体发酵的培养基为：小麦秸杆粉5g/瓶(250ml三角瓶)，酵母提取物0.04g/g小麦秸杆粉，加入是小麦秸杆粉与酵母提取物总质量的4.5倍的水，121℃灭菌20分钟。冷却后即可接种。
将步骤1)用甘油溶液洗下的嗜热拟青霉J18孢子(孢子浓度为106cfu/ml)接种在装有固体发酵培养基的250ml三角瓶中(每瓶中含5g小麦秸杆，0.2g酵母提取物)每瓶接种106cfu，将孢子在培养基中混匀，50℃静置培养，培养后，每天取一瓶，提取粗酶液检测耐热木糖苷酶活性。
粗酶液提取方法为：在固体发酵的三角瓶的发酵培养基上加入是培养基10倍质量的含0.05mol/L(50mM)磷酸和0.05mol/L(50mM)柠檬酸三钠的柠檬酸缓冲液，200rpm室温振荡浸提2小时，将缓冲液倒进离心管，10,000×g冷冻离心10分钟，得到的上清液即为含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
检测提取后的耐热β-木糖苷酶的活性，耐热β-木糖苷酶酶活力的测定按照Lacke(Methods Enzymol，1988，160：679-684)方法进行：50μl稀释的酶液加入到200μl 5mM pNP-Xylocopyranoside底物(50mM pH6.5磷酸缓冲溶液配制)溶液中，50℃下反应10分钟后，加入Na2CO3溶液终止反应，在410nm处测定吸光值。耐热β-木糖苷酶活力单位定义为50℃条件下，每分钟生成1μmol pNP所需要的酶量为一个单位(U)。结果表明，耐热β-木糖苷酶的活力在40U/g小麦秸杆粉。
3)固体发酵方式生产耐热β-木糖苷酶的纯化
①硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到45％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，然后10,000×g冷冻离心10分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到60％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，10,000×g冷冻离心10分钟，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐热β-木糖苷酶液。
②将步骤①中经初步纯化的木糖苷酶液用25mM pH5.2磷酸缓冲液透析，然后过DEAE52弱阴离子交换柱(Whatman公司4057200)，将离子柱用25mM pH5.2磷酸缓冲液平衡后上样，接着用相同缓冲液冲洗，待基线平稳后用0-150mM NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液即为耐热β-木糖苷酶。
③最后将上述收集的木糖苷酶组分用25mM pH5.2的磷酸缓冲液透析，然后过QSFF强阴离子柱(介质为Q-Sepharose Fast Flow，Amersham Bioscience公司，17-0510-01)，用25mM pH6.5的磷酸缓冲液平衡后上样，接着用相同缓冲液冲洗，最后待基线平稳后用0-150mM NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液即为耐热β-木糖苷酶液。
按照步骤2)的方法，检测纯化后的耐热β-木糖苷酶的比活力，结果如表3所示，结果表明纯化后的耐热β-木糖苷酶的比酶活力为31.68U/mg(粗酶液为0.97U/mg)，与粗酶液相比，比酶活力提高了32.66倍，酶活力回收率为7.5％。
表3固体发酵方式生产耐热β-木糖苷酶的纯化表
| 步骤 | 总酶活力(U) | 总蛋白(mg) | 比酶活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 |
| 粗酶液 | 427 | 438 | 0.97 | 100 | 1 |
| 硫酸铵沉淀 | 220 | 48 | 4.58 | 51.5 | 4.72 |
| DEAE52 | 88 | 6 | 14.7 | 20.6 | 15.15 |
| QSFF | 32 | 1.01 | 31.68 | 7.5 | 32.66 |
2、液体发酵生产耐热β-木糖苷酶
1)液体发酵粗酶液的制备
液体发酵培养基：玉米芯粉碳源50g/L，尿素10g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4 0.3g/L；121℃灭菌20分钟，培养基的pH值为6.5。
液体发酵：在实施例1步骤1中的步骤1)制备的接种用嗜热拟青霉J18平板上刮下1cm2大小的嗜热拟青霉菌丝体，接种在装有50ml液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，45℃、170rpm振荡培养，培养5天后，将发酵液10,000×g冷冻离心10分钟，上清液即为含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
上述液体发酵过程中，每天测定木糖苷酶的产量，耐热β-木糖苷酶酶活力的测定按照步骤1中2)所述方法进行测定。
结果表明，在第3天时开始显著增加，到第5天时达到最高，酶活力为3.15U/ml发酵液，比酶活力为2.43U/mg蛋白，第6天酶活力开始缓慢下降。
2)耐热β-木糖苷酶的纯化
将上述液体发酵5天后，得到的含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液进行纯化，得到耐热β-木糖苷酶，具体方法如下所述：
①硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到45％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，然后10,000×g冷冻离心10分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到60％饱和度，冰水浴中搅拌1小时，10,000×g冷冻离心10分钟，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐热β-木糖苷酶液，留待进一步纯化。
②将步骤①中经初步纯化的木糖苷酶液用25mM pH5.2磷酸缓冲液透析，然后过DEAE52弱阴离子交换柱(Whatman公司4057200)，将离子柱用25mM pH5.2磷酸缓冲液平衡后上样，接着用相同缓冲液冲洗，待基线平稳后用50mM NaCl溶液洗脱，洗脱液即为耐热β-木糖苷酶组分。
③将上述过弱阴离子交换柱收集的木糖苷酶组分用25mM pH5.2的磷酸缓冲液透析，然后过QSFF强阴离子柱(介质为Q-Sepharose Fast Flow，Amersham Bioscience公司，17-0510-01)，将离子柱用25mM pH6.5的磷酸缓冲液平衡后上样，接着用相同缓冲液冲洗，待基线平稳后后用30-120mM NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液即为耐热β-木糖苷酶液。
取该纯化的木糖苷酶液进行凝胶电泳，结果表明纯化后的木糖苷酶达到电泳纯，该木糖苷酶蛋白的分子量大小为53.5kDa。其电泳图谱如图2所示，图2中泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为纯化的耐热β-木糖苷酶。
按照步骤1中2)所述方法检测纯化后的耐热β-木糖苷酶的比活力，结果如表4所示，结果表明纯化后的耐热β-木糖苷酶的比酶活力为37.65U/mg(粗酶液为1.06U/mg)，与粗酶液相比，比酶活力提高了35.64倍，酶活力回收率为3.03％。
表4液体发酵产耐热β-木糖苷酶的纯化表
| 步骤 | 总酶活力(U) | 总蛋白(mg) | 比酶活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 |
| 粗酶液 | 2205.32 | 2087.43 | 1.06 | 100 | 1 |
| 硫酸铵沉淀 | 1054.48 | 137.15 | 7.49 | 47.82 | 7.28 |
| DEAE52 | 154.22 | 4.59 | 33.68 | 6.99 | 31.82 |
| QSFF | 67.92 | 1.78 | 37.65 | 3.03 | 35.64 |
3)耐热β-木糖苷酶性质检测
分别在不同温度(0-100℃，5℃的梯度)下按照步骤1中步骤2)所述方法测定耐热β-木糖苷酶的活力，以酶活力最高点时的温度作为耐热β-木糖苷酶的最适温度；将酶液在最适温度下处理30分钟，冰水浴冷却，然后测定残余酶活力，以未经处理的酶液作为对照来测定耐热β-木糖苷酶的温度稳定性。结果显示耐热β-木糖苷酶的最适温度为55℃，具有一定的耐热性，在最适温度下将该酶保温30分钟后，残余酶活力为对照值的71.2％。
分别在不同pH条件(分别用柠檬酸缓冲液pH2-6，磷酸缓冲液pH5-7，Tris-HCl缓冲液pH7-9，苷氨酸缓冲液pH9-11调节耐热β-木糖苷酶液的pH值)下，按照步骤1中步骤2)所述的方法测定不同pH条件下，嗜热拟青霉所产耐热β-木糖苷酶的酶活力。结果表明该酶在pH6.5时酶活力最高。当pH低于5.0时，酶活几乎完全被抑制，在pH9.0时，仍有35.3％的残余酶活。
将耐热β-木糖苷酶与不同pH的缓冲溶液(柠檬酸缓冲液pH2-6，磷酸缓冲液pH5-7，Tris-HCl缓冲液pH7-9，苷氨酸缓冲液pH9-11)混合后，50℃下保温30分钟，然后按照步骤1所述的方法测定酶活力，即残余酶活力，以不经处理的酶液作为对照(活力为100％)，结果显示该酶在pH6.5-9.0范围内均具有较好的稳定性，酶活力损失20％左右，说明该酶在中性偏碱的条件下较为稳定。
将不同的人工合成底物(pNP-β-Xylocopyranoside，pNP-β-Arabinocopyranoside，木二糖、木三糖、木四糖、木五糖)分别配置成5mM浓度的溶液，然后按照步骤1所述的方法测定耐热β-木糖苷酶的酶活力；将低聚木糖分别配置成5mM浓度的溶液，然后加酶水解，用HPLC和TLC分析水解结果。结果表明该酶主要作用于pNP-β-Xylocopyranoside，能够水解pNP-β-Arabinocopyranoside(只相当于前者的10.9％)，对其它的人工合成底物几乎没有水解作用，说明该酶具有较强的底物专一性；同时，该酶能够水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等低聚木糖。
实施例3、耐热β-葡萄糖苷酶液的制备
1、固体发酵生产耐热β-葡萄糖苷酶
1)接种用嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18的培养：
嗜热拟青霉J18种子从保存斜面上划线接种于新配制的PDA斜面或平板上，然后将斜面或平板放置于40-60℃培养箱中静止培养2-8天。用质量百分含量为20％甘油溶液将斜面上的孢子洗下，洗下的孢子液用于固体发酵产酶，生长的平板则直接用于液体发酵用。
2)固体发酵方式生产耐热β-葡萄糖苷酶
以嗜热拟青霉J18为发酵菌株、天然农业废弃物小麦秸杆为碳源采用固体发酵方式生产耐热葡萄糖苷酶。
固体发酵的培养基为：小麦秸杆粉5g/瓶(250ml三角瓶)，酵母提取物0.04g/g小麦秸杆粉，加入是小麦秸杆粉与酵母提取物总质量的4.5倍的水，121℃灭菌20分钟。冷却后即可接种。
将步骤1)用质量百分含量为20％的甘油溶液洗下的嗜热拟青霉J18孢子(孢子浓度为106cfu/ml)接种在装有固体发酵培养基的250ml三角瓶中(每瓶中含5g小麦秸杆，0.2g酵母提取物)，每瓶接种106cfu，将孢子在培养基中混匀，50℃静置培养，培养后，每天取一瓶，提取粗酶液检测葡萄糖苷酶活性。
粗酶液提取方法为：在固体发酵的三角瓶的发酵培养基上加入是培养液10倍质量的含0.05mol/L(50mM)磷酸和0.05mol/L(50mM)柠檬酸三钠的柠檬酸缓冲液，200rpm室温振荡浸提2小时，将缓冲液倒进离心管，10,000×g冷冻离心10分钟，得到的上清液即为含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
葡萄糖苷酶活力的测定参照Rosane et al.(FEMS Microbiology Letters，1977，146：291-295.)的测定方法并稍加变动，具体为：将25μl稀释的上述制备的含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液加入到225μl(50mM pH6.5磷酸缓冲溶液配制)5mM pNP-Glucopyranoside底物溶液中，50℃下反应10分钟后加入750μl饱和四硼酸钠溶液终止反应，在405nm处测定吸光值。葡萄糖苷酶活力单位定义为在50℃条件下，每分钟生成1μmol pNP所需要的酶量为一个单位(U)。
检测提取后的耐热β-葡萄糖苷酶的活性表明，耐热β-葡萄糖苷酶的活力为50U/g小麦秸杆粉。
3)固体发酵方式生产耐热β-葡萄糖苷糖酶的纯化
①将步骤1)制备的含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液用20mM，pH7.2的磷酸缓冲液透析，使酶液的最终pH为7.2。
②然后将透析好的酶液过用磷酸缓冲液(20mM，pH7.2)平衡好的DEAE52弱阴离子柱，用相同的缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质，然后用100-200mM的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)。
③最后将上一步收集到的葡萄糖苷酶部分超滤浓缩后过S-200凝胶柱，洗脱流速为0.3ml/min，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)，经过上述三步纯化后得到葡萄糖苷酶纯酶。
通过凝胶检测表明该葡萄糖苷酶的亚基分子量为116kDa；按照步骤2)所述的方法测定上述纯化的葡萄糖苷酶的活力，结果表明，纯化的葡萄糖苷酶的回收率为29.1％，纯化后的葡萄糖苷酶比酶活力为84.2U/mg(粗酶液为1.3U/mg)，与粗酶液相比，比酶活力提高了64.8倍。
表5固体发酵方式生产耐热β-葡萄糖苷糖酶的纯化表
| 纯化步骤 | 总酶活力(U) | 总蛋白(mg) | 比酶活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 |
| 透析后酶液 | 550 | 424 | 1.30 | 100 | 1 |
| DEAE-52 | 360 | 8 | 45 | 65.5 | 34.6 |
| S-200 | 160 | 1.9 | 84.2 | 29.1 | 64.8 |
2、液体发酵生产耐热β-葡萄糖苷酶
液体发酵培养基：玉米芯粉碳源50g/L，酵母提取物10g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4 0.3g/L；121℃灭菌20分钟，培养基的pH值为7.0。
液体发酵：在实施例1的步骤1中的步骤1)制备的接种用嗜热拟青霉J18平板上刮下1cm2大小的嗜热拟青霉菌丝体，接种在装有80ml液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，50℃、200rpm振荡培养，培养5天后，将发酵液10,000×g冷冻离心10分钟，上清液即为含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
上述液体发酵过程中，每天测定葡萄糖苷酶活力，葡萄糖苷酶活力的测定参照步骤1中的步骤2)。
结果表明，液体发酵产葡萄糖苷酶的最高产酶水平在第5天达到，为2.75U/ml，蛋白量为1.9mg/ml，比酶活力为1.44U/mg蛋白，第6天酶活力开始缓慢下降。
2)耐热β-葡萄糖苷酶的纯化
首先将步骤1)制备的含有木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液用20mM，pH7.2的磷酸缓冲液透析，使酶液的最终pH为7.2。然后将透析好的酶液过用磷酸缓冲液(20mM，pH7.2)平衡好的DEAE52弱阴离子柱，用相同的缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质，然后用100-200mM的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)。
最后将上一步收集到的葡萄糖苷酶部分超滤浓缩后过S-200凝胶柱，用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，收集目标蛋白峰(通过酶活力测定来确定目标蛋白峰)，经过上述三步纯化后得到葡萄糖苷酶纯酶。
通过凝胶检测表明该葡萄糖苷酶的亚基分子量为116kDa；凝胶检测结果如图3所示，图3中泳道1为葡萄糖苷酶纯酶，泳道2为蛋白分子量标准。
按照步骤1)所述的方法测定上述纯化的葡萄糖苷酶的活力，结果表明，纯化的葡萄糖苷酶的回收率为23.3％，纯化后的葡萄糖苷酶比酶活力为80.83U/mg(粗酶液为0.38U/mg)，与粗酶液相比，比酶活力提高了212.5倍。
表6 耐热β-葡萄糖苷酶的纯化表
| 纯化步骤 | 总酶活力(U) | 总蛋白(mg) | 比酶活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 |
| 透析后酶液 | 166.2 | 435 | 0.38 | 100 | 1 |
| DEAE-52 | 86.4 | 12.22 | 7.07 | 52 | 18.6 |
| S-200 | 38.8 | 0.48 | 80.83 | 23.3 | 212.5 |
耐热β-葡萄糖苷酶的最适温度：分别在不同温度下测定葡萄糖苷酶的活力以确定耐热葡萄糖苷酶的最适反应温度，以酶活力最高点时的反应温度为最适温度，以此酶活力作为100％。
测定耐热β-葡萄糖苷酶的不同温度下的稳定性：将酶液分别在不同的温度下处理30min，冰水浴冷却，然后测定残余酶活力，以未经处理的酶液作为对照(100％)。
葡萄糖苷酶活力的测定按照步骤1中的步骤2)进行。
测定结果表明耐热β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃，当温度高于75℃后酶活力迅速下降，80℃酶活力降为最高值的60％。当反应温度降低时，酶活力也急剧下降，60℃时测定的酶活力只有最高值的50％左右，说明该酶是耐热酶，具有较强的温度耐受性。酶液的温度稳定性结果表明，酶液在低于60℃时很稳定，处理30分钟后几乎没有酶活力损失，65℃处理30分钟后酶活力仍保存96％左右，70℃处理后酶活力急剧下降，损失了50％左右，说明该酶具有较好的温度稳定性。
耐热β-葡萄糖苷酶的最适pH及pH稳定性：将缓冲液分别换为不同pH值及体系的缓冲液加入到底物中50℃条件下测定该酶最适pH，以酶活力最高点作为100％，
结果表明该耐热β-葡萄糖苷酶的最适pH值为pH6.2，当pH处于5-7之间时，该酶比较稳定，酶活力能保留80％左右，当反应体系的pH偏酸或偏碱时，酶活性受到抑制，酶活力下降较快。葡萄糖苷酶的pH稳定性测定结果显示，当pH在5.0-8.2之间时，酶液在60℃下比较稳定，处理2小时后酶活力均能保存在70％以上，当pH在6.2、6.7和7.2时，酶活力能保存在80％以上，说明该酶在中性偏酸的条件下具有很好的稳定性。
实施例4、耐热木聚糖酶在馒头加工中的应用
在6份100g面粉里面分别加入50g水、1g盐，然后分别加入0(对照)、2.5、5、10、15或20ppm(10-6g/g)实施例1固体发酵后并纯化得到的木聚糖酶，分别在和面机中速搅拌5分钟，然后分割(50g/个)、搓圆，将成型的室温馒头静置15分钟后于38℃，85％湿度条件下醒发30分钟，最后沸水蒸制25分钟，待馒头冷却后测定其体积和质量，计算比容，具体计算方法为：比容＝馒头体积(ml)/馒头质量(g)。
结果如表7所示，在面团中添加木聚糖酶后明显的提高了馒头的比容，不加酶的对照组馒头比容为2.67，加酶后馒头比容刚开始随着加酶量的提高而增加，当加酶量为5-10ppm(10-6g/g)时，馒头的比容达到最大值3.05，其后馒头的比容开始随着加酶量的升高而下降，当加酶量为20ppm(10-6g/g)时，比容降为2.87。加入一定量木聚糖酶后馒头的白度有明显的提高；馒头的组织结构有明显的改善；老化在一定程度上得到了延缓，初始硬度降低了10-30％(通过质构仪测定馒头芯应力变化来反映)。
表7 不同木聚糖酶添加量对产馒头比容的影响
| 加酶量 | 对照 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 比容 | 2.67 | 2.84 | 3.05 | 3.05 | 2.9 | 2.87 |
实施例5、耐热木聚糖酶在面包加工中的应用
在7份100g面包粉里面分别加入60g水(分别含0(对照)、5、10、20、40、60、80ppm(10-6g/g)的实施例1液体发酵后并纯化得到的木聚糖酶)，在和面机中按照面包制作法和面，中途加入一定量的盐和起酥油，待面团和好后静置、分割、称量、搓圆、发酵、成型，接着将成型的面包于38℃、85％湿度条件下醒发60分钟，最后烤制20分钟，待面包自然冷却后测定面包的比容，具体计算方法为：比容＝面包体积(ml)/面包质量(g)
结果如表8所示，结果表明，在面团中添加木聚糖酶后明显的提高了面包的比容，不加酶的对照组面包比容为5.8，加酶后面包比容刚开始随着加酶量的提高而增加，当加酶量为60ppm(10-6g/g)时，面包的比容达到最大值8.0，与对照相比提高了38％，其后面包的比容开始随着加酶量的升高而下降。加入一定量木聚糖酶后面包的组织结构有明显的改善；面包的老化在一定程度上得到了延，缓储存7天后，面包芯的硬度为对照的40-80％(通过质构仪测定面包芯应力变化来反映)。
表8 不同木聚糖酶添加量对面包比容的影响：
| 加酶量 | 对照 | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 |
| 比容 | 5.8 | 6.5 | 7 | 7.4 | 7.7 | 8 | 7.5 |
实施例6、耐热β-木糖苷酶与耐热木聚糖酶协同水解木聚糖的应用
将实施例1固体发酵后并纯化得到的木聚糖酶50U和实施例2液体发酵后并纯化得到的木糖苷酶2.5U混合后制成木聚糖酶和木糖苷酶的混合酶液，分别加入100ml质量浓度为1％的玉米芯木聚糖底物溶液或质量浓度为1％的桦木木聚糖底物溶液中，在50℃条件下进行水解反应，以单独加入50U实施例1固体发酵后并纯化得到的木聚糖酶为对照。分别在反应后1、2、4、6、12和24小时采集水解样品，然后采用Somogyi法(Somogyi，M.A new reagent for the determination of sugars.J.Biol.Chem.，1945，160：61-68.)测定生成的还原糖量。
结果表明：以桦木木聚糖为底物时，在反应初期，混合酶液的木聚糖水解率与单独用木聚糖酶对照的水解率差别不大，反应1小时，混合酶与单独的木聚糖酶的水解液中还原糖的量分别为1.31mg/ml和0.93mg/ml，随着反应时间的延长，两者的反应速率差别逐渐加大，水解12小时，两者水解液中还原糖的量分别为2.76mg/ml和1.72mg/ml，此后水解液中还原糖量几乎没有变化，最终24小时协同作用水解液中还原糖的含量比木聚糖酶水解液的高出64％；以玉米芯木聚糖为底物的水解结果与桦木木聚糖为底物的水解结果相似，水解24小时后，粗酶玉米芯水解液中还原糖量比木聚糖酶水解液的高出40％。
取桦木木聚糖水解液样品进行TLC分析，结果发现木聚糖酶只能将桦木木聚糖水解为木二糖和木三糖，不能将其完全降解成木糖，而加入木糖苷酶后桦木木聚糖则全部被降解为木糖。上述结果表明耐热木聚糖酶和耐热β-木糖苷酶的协同作用可以大大提高桦木木聚糖的水解效率，耐热β-木糖苷酶在木聚糖完全降解为木糖以实现生物转化方面有很大的应用前景。
实施例7、耐热β-葡萄糖苷酶的水解特性
分别以不同的二糖、糖苷和聚糖为底物(具体如表9所示)，加入实施例3液体发酵并纯化后的耐热葡萄糖苷酶，在50℃条件下进行水解反应，通过测定葡萄糖含量，测定其活性。活力单位的定义为在50℃条件下，反应每分钟生成1μmol pNP或葡萄糖所需要的酶量为一个单位(U)，葡萄糖含量采用氧化酶法试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，产品目录号：001017)进行测定，测定结果如表9所示，结果表明实施例3液体发酵并纯化后的耐热β-葡萄糖苷酶对合成底物具有很强的特异性，对pNP-β-Glucopyranoside(对硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷)的水解效果最好，而对其它的底物表现出很低的酶活力。同时，该酶还能够水解纤维二糖、龙胆二糖、水杨苷、染料木苷、苦杏苷、黄芪甲苷以及大豆苷，其中对纤维二糖的水解效果最好，水解达到的酶活力为70.12U/g，该酶不能水解木聚糖、纤维素、葡聚糖、淀粉等聚糖。
表9 葡萄糖苷酶的水解特异性
| 底物 | 酶活力(U/mg) | 相对酶活力(％) |
| 对硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷 | 80.75 | 100 |
| 对硝基苯-α-吡喃葡萄糖苷 | 0.34 | 0.3 |
| 对硝基苯-β-吡喃木糖苷 | 0.52 | 0.6 |
| 对硝基苯-α-吡喃木糖苷 | 0.18 | 0.2 |
| 对硝基苯-β-吡喃阿拉伯糖苷 | 0.58 | 0.7 |
| 对硝基苯-β-吡喃果糖苷 | 0.032 | 0.03 |
| 对硝基苯-β-吡喃半乳糖苷 | 0.15 | 0.2 |
| 对硝基苯-β吡喃甘露糖苷 | 0.35 | 0.4 |
| 纤维二糖 | 70.12 | 86.8 |
| 苦杏苷 | 32.40 | 40.1 |
| 水杨苷 | 28.85 | 35.7 |
| 染料木苷 | 39.84 | 49.3 |
| 大豆苷 | 35.98 | 44.6 |
| 龙胆二糖 | 64.8 | 80.2 |
| 淀粉 | nd | 0 |
| 木聚糖 | nd | 0 |
| 纤维素 | nd | 0 |
Claims (10)
1、一种制备耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的方法，是以农业废弃物为碳源，将嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18，在40-60℃，发酵得到耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的方法为固体发酵或液体发酵，所述固体发酵是将所述嗜热拟青霉J18接种到固体发酵培养基上发酵，用柠檬酸缓冲液冲洗，过滤得到含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液；所述液体发酵是将所述嗜热拟青霉J18接种到液体发酵培养基上发酵后，过滤发酵液得到含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液；所述柠檬酸缓冲液为含有柠檬酸和柠檬酸三钠的缓冲液；
所述固体发酵培养基是由重量份数比为1∶0.01-0.1∶2-6的农业废弃物粉、酵母提取物和水组成；所述固体发酵培养基优选为由重量份数比为1∶0.04∶5的农业废弃物粉、酵母提取物和水组成；
所述液体发酵培养基为含有农业废弃物粉10-60g/L，尿素或酵母提取物或胰蛋白胨5-20g/L，CaCl2 0.1-1g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4 0.1-1g/L，初始pH值为5-9的培养基；优选为含有农业废弃物粉40g/L，尿素或酵母提取物或胰蛋白胨10g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，FeSO4 0.3g/L，初始pH值为7的培养基。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述农业废弃物为小麦秸杆、麸皮或玉米芯。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵的时间为2-10天。
5、根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液进行纯化后，得到耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述固体发酵的耐热木聚糖酶的纯化方法为双水相法；所述双水相法为在所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中，加入是所述粗酶液质量25％的聚乙二醇、是所述粗酶液质量50％的硫酸铵、以及是所述粗酶液质量35％的蒸馏水，混匀后，静置2小时或离心待其完全分层，上层即纯化的耐热木聚糖酶。
7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述液体发酵的耐热木聚糖酶的纯化方法包括下述步骤：
1)向固体发酵得到的含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到20％饱和度，冰水浴中搅拌30-60分钟，然后冷冻离心，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到50％饱和度，冰水浴中搅拌0.5-1.5小时，冷冻离心，将沉淀用少量的缓冲液溶解，溶液即为初步纯化的耐热木聚糖酶酶液。
2)将初步纯化的耐热木聚糖酶酶液，过Sephacry S-200HR凝胶过滤柱层析，用pH7.3 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集目标峰。
3)将步骤2)得到的洗脱液收集得到的目标峰过DEAE52弱阴离子层析柱，用0.4-0.7mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标蛋白峰即为纯化的耐热木聚糖酶。
8、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐热β-木糖苷酶或耐热β-葡萄糖苷酶的纯化方法为层析法。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯化得到耐热β-木糖苷酶的步骤为：
1)向所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末至酶液中硫酸铵达到30-50％饱和度，冰水浴中搅拌0.5-2小时，然后8000-14000×g离心10-30分钟，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液达到55-65％饱和度，冰水浴中搅拌0.5-2小时，8,000-14,000×g离心10-30分钟，将沉淀用磷酸柠檬酸缓冲液溶解得到初步纯化的耐热β-木糖苷酶液；
2)将上述经初步纯化的酶液用5-50mM pH5.0-8.0磷酸缓冲液透析，然后过DEAE52弱阴离子层析柱，用20-200mM NaCl溶液洗脱；
3)步骤2)得到的洗脱液用5-50mM pH5.0-8.0的磷酸缓冲液透析，然后过Q-Sepharose Fast Flow强阴离子层析柱，最后用30-300mM NaCl溶液洗脱，洗脱液即为耐热β-木糖苷酶。
10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯化耐热β-葡萄糖苷酶的步骤为：
1)将所述含有耐热木聚糖酶、耐热β-木糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶的粗酶液用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液透析；
2)将步骤1)过DEAE52弱阴离子层析柱，用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液以0.2-2ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质，然后用50-500mM的NaCl溶液洗脱，收集目标蛋白；
3)将步骤2)得到的收集液过Sephacryl-S200HR层析柱，用5-50mM，pH5.2-8.2的磷酸缓冲液洗脱，流速为0.2-2ml/min，收集目标蛋白即为纯化的耐热β-葡萄糖苷酶。
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