CN105154412A - 一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其属于生物发酵工程领域，具体是将银耳废菌包加水提取后，利用硫酸铵对提取液进行盐析，再经透析除盐后利用DEAE-纤维素柱层析进行纯化，得木聚糖酶。本发明原料来源广泛、廉价，提取方法简单，所得木聚糖酶的比活力高达8091U/mg，不仅可在很大程度上实现银耳废菌包的循环再利用，减少资源浪费，也扩展了木聚糖酶的来源，具有较好推广价值。

Description

一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程领域，具体涉及一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法。

背景技术

木聚糖酶是一组降解木聚糖的酶，其具有很大的应用前景，已被广泛应用于制浆和造纸、医药和化工、纺织、食品、能源、环保、酿酒与饲料等各行各业。目前，许多诸如来源于曲霉、木霉和芽孢杆菌的木聚糖酶已被成功商业化生产。现有研究中，产木聚糖酶活力较高的微生物主要有，细菌里的中度嗜盐菌AX2000(BacillusalcalophilusAX2000)，它产生的木聚糖酶活性高达25000U/mg；放线菌里的橄榄绿链霉菌A1，它产生的木聚糖酶活性高达15000U/mL；真菌里的青霉菌Pol6(PenicilliumoccitanisPol6)和黑曲霉BCC14405(AspergillusnigerBCC14405)，它们产生的木聚糖酶活性分别为8549.85和8007U/mg。在木聚糖酶产量方面，真菌与细菌相比具有明显的优势。但是真菌中青霉菌和黑曲霉在产木聚糖过程中常常会伴随着毒素的产生，使木聚糖酶在应用上具有一定的隐患。

银耳（Tremella）又称作白木耳、雪耳、银耳子等，属于真菌类银耳科银耳属，是门担子菌门真菌银耳的子实体，有“菌中之冠”的美称。银耳子实体纯白至乳白色，直径5～10厘米，柔软洁白，半透明，富有弹性。具有强精、补肾、润肺、生津、止咳、清热、养胃、补气、和血、强心、壮身、补脑、提神的功效。目前已经开发了银耳糖浆、口服液等产品，取得了良好的经济效益。

由于银耳功效明显，口感良好被消费者广泛接受。每年的产量与销量节节升高，已经成为食用菌市场的主要产品之一。但是银耳采摘完后会伴随着大量废弃培养料的产生，古田县是银耳主产区，年生产银耳2亿袋以上，每年有10万吨的废菌糠。而从目前情况来看，我国对银耳菌渣的处理多是用做燃料或随意丢弃，这不但浪费了宝贵的生物资源，同时也带来了严峻的环境问题。因此，如何有效开发和合理利用银耳菌渣资源，是银耳行业亟待解决的问题。

通过研究表明，银耳在栽培过程中会产生大量的栽培料降解酶，其中木聚糖酶活力最高，可达200U/g（鲜料），具有很大的提取和应用价值。本发明通过对银耳废菌包中木聚糖酶的提取、分离与纯化，可将木聚糖酶比活力成功提高至8091U/mg，这不仅在很大程度上实现了银耳废菌包的循环再利用，也扩展了木聚糖酶的来源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其不仅可在很大程度上实现银耳废菌包的循环再利用，减少资源浪费，也扩展了木聚糖酶的来源，具有较好推广价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，是将银耳废菌包加水提取后，利用硫酸铵对提取液进行盐析，再经透析除盐后利用DEAE-纤维素柱层析进行纯化，得木聚糖酶。

其具体操作包括以下步骤：

1）粗酶液的提取：将刚采完银耳的废菌包倒入不锈钢锅中，充分混匀后按料液比1:5加水，于25℃、150rpm摇床上放置浸提2-3h，用八层纱布过滤去渣后，将滤液于25℃离心机中10000rpm离心20min，取上清液；

2）盐析与透析：将步骤1）所得上清液装入三角瓶中，加硫酸铵调整至其饱和度为50%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，再取上清液加硫酸铵调整至其饱和度为80%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，所得沉淀用磷酸缓冲液悬浮溶解，经透析去盐得粗酶液；

3）DEAE-纤维素柱层析纯化：柱色谱参数：上样量：2mL，柱子规格：50cm×2cm，柱体积100mL，以50mMTris-HCL（pH8.5）与NaCl（0-0.5M）混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂流速为0.475mL/min；按每0.95mL收集一管，测定每管收集液中蛋白浓度及木聚糖酶活力，然后根据酶活力曲线与蛋白变化曲线，合并酶活力高且无蛋白的部分，浓缩后即得所述木聚糖酶；每克银耳废菌包中提取得到的木聚糖酶的酶活力达130-140U，木聚糖酶的比活力达8091U/mg。

本发明的优点在于：目前市场上大部分木聚糖酶来源于细菌发酵，但是细菌在发酵过程中往往会产生大量有毒物质，这使木聚糖酶在使用上，特别是食品方面的使用存在极大的隐患。申请人通过研究发现，银耳在栽培过程中会产生大量的栽培料降解酶，其中木聚糖酶活力最高。由此，本发明提供一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其盐析后的粗酶具有较高的安全性，即可用于食品生产、饲料添加等方面，而进一步纯化后的木聚糖酶具有很高的纯度，可作为试剂使用。

本发明原料来源广泛、廉价，提取方法简单，实施可行性高，便于机械化和标准化加工，不仅可在很大程度上实现银耳废菌包的循环再利用，减少资源浪费，也扩展了木聚糖酶的来源，具有较好推广价值。

附图说明

图1为不同硫酸铵饱和度下木聚糖酶的活力测定结果。

图2为DEAE-纤维素柱层析纯化过程中蛋白浓度与酶活力随时间变化的曲线。

图3为SDS-PAGE蛋白电泳图，其中A为Maker、B为纯化收集液、C为粗酶液。

图4为粗酶液对甘蔗渣、麸皮、废报纸、废纸箱、棉籽壳的降解情况。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

（1）粗酶液的提取

将刚采完银耳的废菌包倒入不锈钢锅中，充分混匀后按料液比1:5加水，于25℃、150rpm摇床上放置浸提3h，用八层纱布过滤去渣后，将滤液于25℃离心机中10000rpm离心20min，取上清液；

（2）硫酸铵沉淀初始浓度和终浓度的确定

取步骤（1）所得上清液9份，每份100mL，分别装入250mL三角瓶中，然后按照硫酸铵饱和度表，依次加硫酸铵配制成饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液，然后于25℃、150rpm摇床上放置3h，离心，测定上清液中木聚糖酶的活力，以确定硫酸铵沉淀的初始浓度与终浓度；

图1为不同硫酸铵饱和度下木聚糖酶的活力测定结果。由图1可得，随着硫酸铵饱和度的提高，上清液中的木聚糖酶活力逐渐降低，硫酸铵饱和度为50%前，硫酸铵饱和度的提高对上清液中木聚糖酶活力的影响较低，到硫酸铵饱和度为50%后，随着硫酸铵饱和度的继续提高，上清液中木聚糖酶活力快速降低，至饱和度为80%后，上清液中木聚糖酶的活力不到原始的5%，而继续提高硫酸铵饱和度，酶活力未有太大变化。因此，将硫酸铵沉淀的最佳初始饱和度定为50%，最佳终饱和度定为80%。

（3）盐析与透析

取步骤（1）所得上清液500mL，装入1L三角瓶中，加硫酸铵调整至其饱和度为50%，于25℃、150rpm摇床放置3h后，25℃下10000rpm离心20min，再取上清加硫酸铵调整至其饱和度为80%，于25℃、150rpm摇床上放置3h后，25℃下10000rpm离心20min，所得沉淀用25mL磷酸缓冲液悬浮溶解，经透析去盐得粗酶液；

（4）DEAE-纤维素柱层析纯化

柱色谱参数：上样量：2mL，柱子规格：50cm×2cm，柱体积100mL，以50mMTris-HCL（pH8.5）与NaCl（0-0.5M）混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂流速为0.475mL/min；按每0.95mLL收集一管，测定每管收集液中蛋白浓度及木聚糖酶活力，然后根据蛋白浓度与酶活力随时间变化曲线，收集酶活力高且无蛋白峰重叠部分；

图2为DEAE-纤维素柱层析纯化过程中蛋白浓度与酶活力随时间变化的曲线。由图2可得，在洗脱过程中共得到三个蛋白峰，分离效果较好，而通过酶活力测定可得第一峰对应的为木聚糖酶。

实施例2

一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其具体操作包括以下步骤：

（1）粗酶液的提取：将刚采完银耳的废菌包倒入不锈钢锅中，充分混匀后按料液比1:5加水，于25℃、150rpm摇床上放置浸提2h，用八层纱布过滤去渣后，将滤液于25℃离心机中10000rpm离心20min，取上清液；

（2）盐析与透析：将步骤2）所得上清液装入三角瓶中，加硫酸铵调整至其饱和度为50%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，再取上清液加硫酸铵调整至其饱和度为80%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，所得沉淀用磷酸缓冲液悬浮溶解，经透析去盐得粗酶液；粗酶液中蛋白浓度及木聚糖酶活性测定结果见表1；

表1硫酸铵沉淀效果

由表1可见，通过测定硫酸铵沉淀前后溶液的酶活力与蛋白浓度表明，经过硫酸铵沉淀后，木聚糖酶的回收率为85.12%，具有很好的回收效果，纯度相对之前提高了1.4088倍。

（3）DEAE-纤维素柱层析纯化：柱色谱参数：上样量：2mL，柱子规格：50cm×2cm，柱体积100mL，以50mMTris-HCL（pH8.5）与NaCl（0-0.5M）混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂流速为0.475mL/min；按每0.95mL收集一管，测定每管收集液中蛋白浓度及木聚糖酶的活力，然后根据酶活力曲线与蛋白变化曲线，合并酶活力高且无蛋白的部分，再次测定合并液中的木聚糖酶活力与蛋白浓度，结果见表2；

表2DEAE-纤维素柱层析纯化效果

由表2可得，粗酶液经DEAE-纤维素柱层析的纯化效果良好，纯化倍数高达15.6倍，木聚糖酶回收率达到90%。

实施例3

（1）SDS-PAGE蛋白电泳检测目标蛋白大小

浓缩胶：5%浓缩胶，

分离胶10%分离胶，

样品：Maker、粗酶液、纯化收集液。

图3为SDS-PAGE蛋白电泳图，其中A为Maker、B为纯化收集液、C为粗酶液。由图3可得，纯化收集液中蛋白电泳泳道仅有一条条带，大小在30KDa-35KDa之间，表明经过纯化后的木聚糖酶纯度较高，纯化效果良好，而由粗酶液的蛋白泳道可见，在该泳道中有明显的木聚糖酶条带，含量较高，但仍含有大量其他蛋白。

（2）木聚糖酶应用研究

将甘蔗渣、麸皮、废报纸、废纸箱、棉籽壳进行粉碎，粉碎后烘干至恒重。称取1.5g烘干的各样品加入30mL、质量浓度为10%的氢氧化钠溶液，于121℃下提取1h，过滤，取滤液并清洗滤渣，将滤液及洗液合并，加入浓硫酸调pH至中性，放置后产生大量沉淀；10000rpm离心10min，取沉淀于70℃下烘干至恒重；将其碾碎，各称取25mg加入1mLpH6.0的磷酸缓冲液（20mM）进行悬浮，并置于80℃水浴1h后冷却；依次加入0μL（补水400μL）、100μL（补水300μL）、200μL（补水200μL）、300μL（补水100μL）、400μL（补水0μL）实施例2中所得粗酶液，于50℃下水浴6h，取出后立即冰水浴，然后各取0.4mL测定其木糖浓度。

图4为粗酶液对甘蔗渣、麸皮、废报纸、废纸箱、棉籽壳的降解情况。由图4可得，木聚糖酶对麸皮中的木聚糖具有良好的降解效果，降解率高达75%，对甘蔗渣、棉籽壳、废报纸、废纸箱中木聚糖的降解也具有良好的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其特征在于：将银耳废菌包加水提取后，利用硫酸铵对提取液进行盐析，再经透析除盐后利用DEAE-纤维素柱层析进行纯化，得木聚糖酶。

2.根据权利要求1所述从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1）粗酶液的提取：将刚采完银耳的废菌包倒入不锈钢锅中，充分混匀后按料液比1:5加水，于25℃、150rpm摇床上放置浸提2-3h，用八层纱布过滤去渣后，将滤液于25℃离心机中10000rpm离心20min，取上清液；

2）盐析与透析：将步骤1）所得上清液加硫酸铵调整至其饱和度为50%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，再取上清液加硫酸铵调整至其饱和度为80%，于25℃、150rpm摇床上放置2-3h后，25℃下10000rpm离心20min，所得沉淀用磷酸缓冲液悬浮溶解，经透析去盐得粗酶液；

3）DEAE-纤维素柱层析纯化：以50mM、pH8.5的盐酸缓冲溶液与0-0.5MNaCl溶液混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂流速为0.475mL/min，按每0.95mL收集一管，测定每管收集液中蛋白浓度及木聚糖酶活力，然后根据酶活力与蛋白浓度变化曲线，合并酶活力高且无蛋白的部分，浓缩后即得所述木聚糖酶。

3.根据权利要求1所述从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其特征在于：每克银耳废菌包中提取得到的木聚糖酶的酶活力达130-140U/g，木聚糖酶的比活力达8091U/mg。