CN106591409A - 一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽 - Google Patents

一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,制备步骤为:1)预处理;2)酶解;3)超滤;4)纯化;5)干燥。有益效果为:酶解条件温和,节省能源,不会破坏墨寡肽活性;酶解具有高效性和专一性的特点,且复合酶解剂独特的配方能大大缩短制备时间,且不会造成蛋白质流失;采用两次酶水解,酶解充分,得到的分子量小,易被人体吸收;使用离心超滤管不会有浓度梯度,分离速度快,且不会造成蛋白质的流失,脱盐效果好,墨寡肽提取率高;再次超滤,对墨寡肽进一步纯化,得到的墨寡肽纯度高;本发明操作步骤简单,生产工艺先进,产品质量可控,成本低廉,经济效益高。

Description

一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽
技术领域
本发明涉及多肽提取技术领域,具体是一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物。
背景技术
脂质代谢是指生物体内脂质的合成与分解过程。脂肪的消化主要在小肠上段经各种酶及胆汁酸盐的作用,水解为甘油、脂肪酸等。脂类的吸收含两种情况:中链、短链脂肪酸构成的甘油三酯乳化后即可吸收,吸收后的甘油三酯在肠粘膜细胞内水解为脂肪酸及甘油,最后经由门静脉入血。长链脂肪酸构成的甘油三酯在肠道分解为长链脂肪酸和甘油一酯,再吸收后由肠粘膜细胞内再合成甘油三酯,与载脂蛋白、胆固醇等结合成乳糜微粒,最后经由淋巴入血。
随着经济水平的发展,国民生活方式的改变,一系列脂代谢紊乱的疾病的发生率日趋上升。脂质代谢紊乱疾病( lipid metabolism disorders )是指以机体脂质代谢异常为主要特征的能量代谢相关疾病,包括脂肪肝、肥胖、动脉粥样硬化和高脂蛋白血症等。在临床上,脂质代谢紊乱疾病的主要特征是血液及其他组织器官中脂质(脂类)及其代谢产物质和量的异常,可表现出甘油三酯和胆固醇的蓄积,肝脏小叶炎症和谷丙转氨酶(alaninetransaminase ,ALT )含量的增加以及脂肪细胞因子分泌量的改变。脂质代谢紊乱疾病的发病机制复杂,目前治疗比较困难。
鱿鱼是枪乌贼科和柔鱼科软体动物的俗称,是重要的海洋经济头足类,广泛分布于大西洋、印度洋及太平洋各海域,具有巨大的资源潜力。随之而来的鱿鱼开发利用及其加工成为焦点问题。目前,我国鱿鱼加工技术含量还较低,只是简单地将胴体剥离,包装、冷冻后即为成品。对于加工后的废弃物(平均达到全鱿鱼的35%左右),大多数工厂采取了掩埋丢弃的方法,实际上,这些废弃物有着很高的利用价值。最近研究发现鱿鱼墨中的墨寡肽对脂质代谢具有调节作用,可应用到由脂质代谢紊乱引起的疾病。
制备活性肽的方法主要有:直接提取、体外降解和利用重组DNA 技术、酶法或化学法合成活性肽。体外水解蛋白质制备活性肽有三条工艺路线:酸水解、碱水解和酶法水解。前二者方法简单,但存在营养和毒理方面的有害效应,因此在食品加工中的应用受到了极大的限制。蛋白质的酶法水解一般不会导致营养方面的损失,也不会产生毒理上的问题;同时酶作用具有特异性,可在温和的条件下进行,能耗也低,所以酶法水解在食品加工中经常应用。
现有技术如授权公告号为CN101836746B的中国发明专利,公开了一种低温条件下酶解牡蛎提取多肽的方法,是以鲜活牡蛎可食用部分为原料,在低温条件下,用胰蛋白酶进行酶解,滤渣用在低温下再次提取,合并两次滤液,真空浓缩得到含有多肽的浓缩液。该方法解决了在高温条件下酶解蛋白质易使产物小分子多肽失活的问题,拓宽了牡蛎在保健食品中的应用范围。该方法使用单种蛋白酶,酶解不充分,且未进行纯化,提取的多肽纯度不高。现有技术如授权公告号为CN102191306B的中国发明专利,公开了一种海蜇降压肽的酶法制备方法。其是选取新鲜海蜇或矾制海蜇为原料,经脱盐、洗净后进行研磨处理;调节海蜇浆的蛋白质浓度为1%~ 3%;调整pH 值为2 ~ 3.5,控温35 ~40℃,加入胃蛋白酶保温酶解4 ~ 6h,胃蛋白酶的用量为每克蛋白质加入2000 ~ 4000u ;再将海蜇胃蛋白酶水解液调整pH 值为5 ~ 6,控温50 ~55℃,加入木瓜蛋白酶酶解1 ~ 3h,木瓜蛋白酶用量为每克蛋白质加入2000 ~ 4000u ;酶灭活;再经膜过滤除杂、纳滤膜脱盐、浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥得到海蜇降压肽粉。该方法制备的海蜇降压肽经SHR 大鼠( 原发性高血压大鼠) 口服实验证明具有较好的辅助降血压功效。该方法第二步酶解仍采用单种酶进行水解,酶解的充分度还有提高的空间,且蛋白酶中未添加酶激活剂,酶解效率有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子量小,纯度高,活性强的具有调节脂质代谢的鱿鱼墨寡肽提取物,其制备方法酶解充分,提取率高,操作简单,制备时间短。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:
一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,具体制备步骤为:
1)预处理:割取墨囊或刺激鱿鱼使其喷墨,收集鱿鱼墨;
2)酶解:在鱿鱼墨中加入胃蛋白酶,加入量为底物质量的0.2~0.7%,酶解条件为:45~60℃,pH1.0~2.5,酶解时间为0.4~0.8h。再加入复合酶制剂,复合酶制剂按与底物质量比1:100~300加入,成份及其重量份为:10~15份胰蛋白酶,,5~8份木瓜蛋白酶,0.003~0.007份氯化镁,0.001~0.005份氯化钙,0.0002~0.0005份3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和0.004~0.09份苯乙醇苷。酶解温度为40~55℃,pH为6.5~7.8,酶解时间为0.8~1.7h。不使用强酸强碱,酶解条件温和,节省能源,不会破坏墨寡肽活性;酶解具有高效性和专一性的特点,且复合酶解剂独特的配方能大大缩短制备时间,且不会造成蛋白质流失;采用两次酶水解,酶解充分,得到的分子量小,易被人体吸收。酶解结束后,采用沸水浴灭酶,时间为5~15min,过滤;
3)超滤:将得到的滤液注入离心超滤管,离心,离心超滤管上的超滤膜为1000~2500Da,离心速度为5000~10000r/min,取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度,分离速度快,且不会造成蛋白质的流失,脱盐效果好,墨寡肽提取率高;
4)纯化:在得到的目的蛋白中按料液体积比1:10~20加入蒸馏水,超滤,超滤膜为10~30KD,施加的压力为0.4~1.0Mpa。可有效去除分子量大于10~30KD的其他蛋白质,对墨寡肽进一步纯化,得到的墨寡肽纯度高;
5)干燥:将得到的滤出液真空冷冻干燥,真空冷冻干燥分为五个阶段,第一阶段,正常大气压,温度为1~5℃,时间为2~8h;第二阶段,真空度为0.002~0.005Kpa,温度为-10~-3℃,时间为3~6h;第三阶段,真空度为-0.008~-0.002Kpa,温度为-60~-70℃,时间为10~20h;第四阶段,真空度为0.004~0.006 Kpa,温度为-1~4℃,时间为5~12h;第五阶段,真空度为0.03~0.08 Kpa,温度为4~10℃,时间为1~4h。将得到的块状物质粉碎成粉末,得到纯度高,活性强的鱿鱼墨寡肽提取物粉末。
与现有技术相比,本发明的优点在于:不使用强酸强碱,酶解条件温和,节省能源,不会破坏墨寡肽活性;酶解具有高效性和专一性的特点,且复合酶解剂独特的配方能大大缩短制备时间,且不会造成蛋白质流失;采用两次酶水解,酶解充分,得到的分子量小,易被人体吸收;使用离心超滤管不会有浓度梯度,分离速度快,且不会造成蛋白质的流失,脱盐效果好,墨寡肽提取率高;再次超滤,可有效去除分子量大于10~30KD的其他蛋白质,对墨寡肽进一步纯化,得到的墨寡肽纯度高;本发明操作步骤简单,生产工艺先进,产品质量可控,成本低廉,经济效益高。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,具体制备步骤为:
1)预处理:割取墨囊或刺激鱿鱼使其喷墨,收集鱿鱼墨;
2)酶解:在鱿鱼墨中加入胃蛋白酶,加入量为底物质量的0.2~0.7%,酶解条件为:45~60℃,pH1.0~2.5,酶解时间为0.4~0.8h。再加入复合酶制剂,复合酶制剂按与底物质量比1:100~300加入,成份及其重量份为:10~15份胰蛋白酶,,5~8份木瓜蛋白酶,0.003~0.007份氯化镁,0.001~0.005份氯化钙,0.0002~0.0005份3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和0.004~0.09份苯乙醇苷。酶解温度为40~55℃,pH为6.5~7.8,酶解时间为0.8~1.7h。不使用强酸强碱,酶解条件温和,节省能源,不会破坏墨寡肽活性;酶解具有高效性和专一性的特点,且复合酶解剂独特的配方能大大缩短制备时间,且不会造成蛋白质流失;采用两次酶水解,酶解充分,得到的分子量小,易被人体吸收。酶解结束后,采用沸水浴灭酶,时间为5~15min,过滤;
3)超滤:将得到的滤液注入离心超滤管,离心,离心超滤管上的超滤膜为1000~2500Da,离心速度为5000~10000r/min,取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度,分离速度快,且不会造成蛋白质的流失,脱盐效果好,墨寡肽提取率高;
4)纯化:在得到的目的蛋白中按料液体积比1:10~20加入蒸馏水,超滤,超滤膜为10~30KD,施加的压力为0.4~1.0Mpa。可有效去除分子量大于10~30KD的其他蛋白质,对墨寡肽进一步纯化,得到的墨寡肽纯度高;
5)干燥:将得到的滤出液真空冷冻干燥,真空冷冻干燥分为五个阶段,第一阶段,正常大气压,温度为1~5℃,时间为2~8h;第二阶段,真空度为0.002~0.005Kpa,温度为-10~-3℃,时间为3~6h;第三阶段,真空度为-0.008~-0.002Kpa,温度为-60~-70℃,时间为10~20h;第四阶段,真空度为0.004~0.006 Kpa,温度为-1~4℃,时间为5~12h;第五阶段,真空度为0.03~0.08 Kpa,温度为4~10℃,时间为1~4h。将得到的块状物质粉碎成粉末,得到纯度高,活性强的鱿鱼墨寡肽提取物粉末。
实施例2:
一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,最优选制备步骤为:
1)预处理:割取墨囊或刺激鱿鱼使其喷墨,收集鱿鱼墨;
2)酶解:在鱿鱼墨中加入胃蛋白酶,加入量为底物质量的0.5%,酶解条件为:50℃,pH1.5,酶解时间为0.6h。再加入复合酶制剂,复合酶制剂按与底物质量比1:200加入,成份及其最优选重量份为:13份胰蛋白酶,,7份木瓜蛋白酶,0.006份氯化镁,0.005份氯化钙,0.0002份3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和0.03份苯乙醇苷。酶解温度为50℃,pH为7.2,酶解时间为1.5h。使用3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和苯乙醇苷可以避免使用强酸强碱的情况下取得类似效果,酶解条件温和,节省能源,不会破坏墨寡肽活性;酶解具有高效性和专一性的特点,且复合酶解剂独特的配方能大大缩短制备时间,且不会造成蛋白质流失;采用两次酶水解,酶解充分,得到的分子量小,易被人体吸收。酶解结束后,采用沸水浴灭酶,时间为10min,过滤;
3)超滤:将得到的滤液注入离心超滤管,离心,离心超滤管上的超滤膜为1500Da,离心速度为6000r/min,取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度,分离速度快,且不会造成蛋白质的流失,脱盐效果好,墨寡肽提取率高;
4)纯化:在得到的目的蛋白中按料液体积比1:15加入蒸馏水,超滤,超滤膜为15KD,施加的压力为0.8Mpa。可有效去除分子量大于15KD的其他蛋白质,对墨寡肽进一步纯化,得到的墨寡肽纯度高;
5)干燥:将得到的滤出液真空冷冻干燥,真空冷冻干燥分为五个阶段,第一阶段,正常大气压,温度为4℃,时间为6h;第二阶段,真空度为0.004Kpa,温度为-7℃,时间为5h;第三阶段,真空度为-0.003Kpa,温度为-65℃,时间为15h;第四阶段,真空度为0.004Kpa,温度为2℃,时间为7h;第五阶段,真空度为0.07Kpa,温度为9℃,时间为3h。将得到的块状物质粉碎成粉末,得到纯度高,活性强的鱿鱼墨寡肽提取物粉末。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
步骤2中复合酶制剂与底物质量比不仅限于1:100~1:300,还包括1:105或1:110或1:115,……,或1:290或1:295或1:300。
步骤3中离心超滤管的超滤膜规格不仅限于1000~2500Da,还包括1005 Da或1010Da或1015 Da,……,或2490 Da或2495 Da或2500 Da。
步骤4中超滤膜的规格不仅限于10~30KD,还包括10.005 KD或10.01 KD或10.015KD,……,或29.990 KD或29.995 KD或30.000 KD。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的墨寡肽的制备步骤为:
1)预处理:割取墨囊或刺激鱿鱼使其喷墨,收集鱿鱼墨;
2)酶解:在鱿鱼墨中加入单种酶解剂酶解,再加入复合酶制剂,酶解结束后,灭酶,过滤;
3)超滤:将得到的滤液注入离心超滤管,离心,取出内管的目的蛋白;
4)纯化:在得到的目的蛋白中加入蒸馏水,超滤;
5)干燥:将得到的滤出液真空冷冻干燥,粉碎得到鱿鱼墨寡肽提取物。
2.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤2中单种酶解剂为胃蛋白酶,加入量为底物质量的0.2~0.7%,酶解条件为:45~60℃,pH1.0~2.5,酶解时间为0.4~0.8h。
3.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤2中复合酶制剂按与底物质量比1:100~300加入,成份及其重量份为:10~15份胰蛋白酶,5~8份木瓜蛋白酶,0.003~0.007份氯化镁,0.001~0.005份氯化钙,0.0002~0.0005份3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和0.004~0.09份苯乙醇苷。
4.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤2中酶解温度为40~55℃,pH为6.5~7.8,酶解时间为0.8~1.7h。
5.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤2中采用沸水浴灭酶,时间为5~15min。
6.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤3中离心超滤管上的超滤膜为1000~2500Da,离心速度为5000~10000r/min。
7.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤4中按料液体积比1:10~20加入蒸馏水。
8.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤4中超滤膜为10~30KD,施加的压力为0.4~1.0Mpa。
9.根据权利要求1所述的一种具有调节脂质代谢鱿鱼墨寡肽提取物,其特征在于:所述的步骤5中真空冷冻干燥分为五个阶段,第一阶段,正常大气压,温度为1~5℃,时间为2~8h;第二阶段,真空度为0.002~0.005Kpa,温度为-10~-3℃,时间为3~6h;第三阶段,真空度为-0.008~-0.002Kpa,温度为-60~-70℃,时间为10~20h;第四阶段,真空度为0.004~0.006Kpa,温度为-1~4℃,时间为5~12h;第五阶段,真空度为0.03~0.08 Kpa,温度为4~10℃,时间为1~4h。
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