CN101983968A - 乌贼墨寡肽及其酶解制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys。本发明还公开了乌贼墨寡肽利用胰蛋白酶进行酶解制备的方法，本发明还公开了该乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于：采用胰蛋白酶进行酶解，结合优化的反应条件，所得产物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，纯度高，并且，整个过程易于控制，同时，所得的酶解物寡肽对人前列腺癌细胞DU-145有明显的抑制增殖作用，且随着药物浓度和作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，因此具有医学药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种乌贼墨寡肽，本发明还公开了利用胰蛋白酶进行乌贼墨寡肽酶解的制备方法，本发明进一步还公开了该乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
背景技术
乌贼(Sepia)属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。乌贼的营养丰富，除可食用外，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，早在《本草拾遗》中就有“腹中墨，主治血刺心痛”的记载。乌贼墨囊一般是作为废弃物，自从日本表森县产业技术开发中心和弘前大学医学部发现乌贼墨含有抗肿瘤物质以来，科学家们对其抗肿瘤活性进行研究，发现其具有多种抗肿廇机制，如乌贼墨有提高免疫功能，诱生细胞因子，抑制癌细胞生长的作用。国内的公开文献可以参考《现代食品科技》Vol 21 No.1，文章篇号为1007-2764(2005)01-0069-21，杜铁平等著的“乌贼墨抗菌活性的分离与研究”，又可以参考《中国肿瘤》2005年第14卷第3期，刘淑萍所著的“乌贼墨抗肿瘤作用研究进展”，再可以参考《中国药师》2003年第6卷第10期，李孝东和袁建华所著的“乌贼墨抗肿瘤机制研究进展”。这些充分显示了乌贼墨在抗肿瘤药物开发具有十分显著的潜在价值，因此挖掘其潜在的药用价值对充分利用海洋资源、扩大药源也有深远意义。
生物活性肽的制备主要有三条途径：一是从自然界的生物体中提取其本身固有的各种天然活性肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径可以获得具有各种生理功能的生物活性物质；三是应用合成方法来制备生物活性肽。将这三种方法的优缺点进行比较，蛋白质酶降解法生产活性肽安全性极高，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解过程易控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种活性高、抗肿瘤显著的乌贼墨寡肽。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种活性高、反应条件易于控制的乌贼墨寡肽酶解制备方法。
本发明所要解决的再一个问题是提供一种乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys。
一种乌贼墨寡肽酶解制备方法，其特征在于包括如下步骤：
①样品的制备，将鲜乌贼墨原料匀浆，乌贼墨匀浆后原料与超纯水的比值1∶0～1∶3，调节pH值至7.0～8.5；
②加入胰蛋白酶，加酶量为0.032g/ml～0.096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解温度为35～53℃，灭活，离心，取上清液；
③分离与纯化，经过超滤和Sephadex G-25层析分离；
④收集，于280nm处检测，收集各峰洗脱液。
作为优选，步骤③所述的超滤为将样品清液加入超滤杯，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥。
作为优选，步骤③所述的Sephadex G-25层析分离为将样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取样品溶液过Sephadex G-25柱，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱。
作为优选，步骤①中料液比为1∶1，pH值为8，步骤②中的酶解时间为8～20小时，酶解温度为45～51℃，加酶量为0.064g/ml。
进一步，还包括步骤⑤对收集后的样品进行纯度检测。
乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用胰蛋白酶进行酶解，结合优化的反应条件，所得产物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，纯度高，并且，整个过程易于控制，同时，所得的酶解物寡肽对人前列腺癌细胞DU-145有明显的抑制增殖作用，且随着药物浓度和作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，因此具有医学药用价值。
附图说明
图1为不同时间各酶氨基氮生成比较柱状图。
图2为G-25洗脱峰值图。
图3为胰蛋白酶酶解后样品的高效液相检测乌贼墨寡肽纯度检测图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
1、材料
1.1动物：乌贼购于舟山南珍菜场
1.2细胞株：人前列腺癌细胞株DU-145株购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
1.3主要试剂：HamF12培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；CCK-8，杭州昊天生物技术有限公司；胰蛋白酶，北京西美杰科技公司；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，亚太恒信生物科技有限公司；福林酚，上海如吉生物发展有限公司
1.4主要仪器：
SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；
BSW-100-ZCD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；
BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；
PHS-250PH计，上海理达仪器厂；
CF16RXII日立低温离心机，日本日立公司；
DS-1组织捣碎机，上海标本模型厂；
752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司
LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司
高效液相色谱仪(P1201依利特)，大连依利特分析仪器有限公司
G-25分子筛凝胶，上海如吉生物发展有限公司
超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；
超净台Forma3111，上海智城分析仪器制造有限公司；
细胞培养箱ZHJM-C12090，杭州宝城生物科技有限公司；
酶标仪(美国BIO-RAD)；杭州宝城生物科技有限公司；
微量震荡器，上海精密仪器有限公司
2、方法
2.1细胞培养：人前列腺癌DU-145细胞接种于含10％(体积分数)FBS、双抗溶液(青霉素G 100IU/mL、链霉素100IU/mL)的HamF12培养基中，置于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下的孵箱中常规培养，细胞贴壁生长，每2～3天换液1次，当细胞生长汇合时，按1∶3传代，每周传代1～2次。用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA混合消化液消化，收集对数生长期细胞进行实验。
2.2细胞增殖抑制试验(CCK-8法)：将DU-145细胞以每孔5×103个细胞数接种于96孔培养板中，每孔培养液200μL。贴壁生长后，每组细胞分别加入药物浓度5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml乌贼墨提取物，对照组加入等体积培养液，每个药物浓度设8个复孔。置于37℃，5％CO2条件下分别孵育24h。每孔加入CCK-8溶液10μL，置37℃，5％CO2条件下继续孵育4h终止培养。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光密度值D450，重复实验3次。按下列公式计算细胞抑制率：肿瘤细胞抑制率(％)＝(对照组D450-用药组D450)/对照组D450×100％。
2.3氨基态氮以及酶活力的测定：氨基态氮采用中性甲醛滴定法。于250ml烧杯中加个60蒸馏水，加入酶解上清液5ml，开动磁力搅拌器，用0.05M的NaOH标准液滴定到酸度计指示pH8.2，记录消耗NaOH的ml数；再加入10ml40％的中性甲醛，混匀。用上述的NaOH标准溶液继续滴定到pH9.2，记录消耗NaOH标准溶液的ml数，同时做空白试验。
式中V1：样品稀释液在加入甲醛以后滴定至终点pH9.2消耗NaOH标准溶液的ml数；
V2：空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗消耗NaOH标准溶液的ml数
C：NaOH标准溶液的浓度，mol/L
14：氮的摩尔质量，mg/mmol
V样品：测定用样品的溶液的体积，5ml
V总：酶解液定容体积，50ml
m：酶解前料含有乌贼墨重量，10g
酶活力按Folin-酚法作测酶活力，酶活力分别为：胃蛋白酶28495u/g，碱性蛋白酶194000u/g，木瓜蛋白酶155000u/g，胰蛋白酶18700u/g。
2.4样品提取方法：
2.4.1酶解样品的制备：将新鲜乌贼墨原料匀浆，称取10g。用NaOH氢氧化钠和盐酸HCL调节PH值，加入蛋白酶，在水浴箱中酶解，灭活15min，低温离心机10000转/min离心30min，取上清液，超滤，冷冻干燥得样品粉末。
2.4.2 4种蛋白酶水解条件的确定：酶解工艺中有许多影响因素，除底物浓度、加酶量外，反应温度、反应时间、pH等对氨基态氮含量有不同程度的影响。参考有关文献并经预备试验，以氨基态氮含量为指标，以料液比、pH、时间、加酶量、温度为五因素，采用L16(45)正交实验确定酶解的最佳反应条件。各酶的因素与水平如下四个表格：
表1胃蛋白酶的因素与水平
Table 1 Factors and levels of Pepsine
表2碱性蛋白酶的因素与水平
Table 2 Factors and levels of Alcalase
表3木瓜蛋白酶因素与水平
Table 3 Factors and levels of Papain
表4胰蛋白酶因素与水平
Table 4 Factors and levels of Trypsin
2.4.3蛋白酶的选择：通过甲醛滴定法测定氨基态氮含量并进行比较，选择氨基态氮含量最高的酶进行条件优化。
2.2.4样品分离与纯化：超滤：将样品加入超滤杯，用3KD的超滤膜进行超滤，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥。Sephadex G-25层析分离：将样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取样品溶液1.5mL过Sephadex G-25柱，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱。每管收集3mL，于λ280nm处检测，收集各峰洗脱液。
2.4.5高效液相测定法寡肽纯度：色谱条件：1000-10-C18(10×250mm)色谱样；流动相：乙睛-水(1∶4)；体积流量：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μL；检测波长：280nm。
2.5寡肽氨基酸序列检测：由西农生(北京)生物技术有限公司完成寡肽的N端序列检测工作。
3结果
3.1 4种酶正交试验结果
表5胃蛋白酶酶解正交试验结果
Table 5 Results of L16(45)orthogonal test of Pepsine
表6碱性蛋白酶酶解正交试验结果
Table 6 Result of L16(45)orthogonal test of Alcalase
表7木瓜蛋白酶酶解正交试验结果
Table 7 Result of L16(45)orthogonal test of papain
表8胰蛋白酶酶解正交试验结果
Table 8 Result of L16(45)orthogonal test of Trypsin
3.2不同时间各酶氨基氮生成比较
表9不同时间各酶氨基态氮生成比较
Table 9 Comparison of hydrolysis degrees among four enzymes in different times
根据4种酶的正交试验结果，将这四种酶酶解乌贼墨2h、4h、6h、8h后生成氨基态氮含量进行比较，由图1可知，胰蛋白酶酶解乌贼墨产生氨基氮含量远远超过其他三种酶。故选择胰蛋白酶对乌贼墨进行酶解。根据正交试验结果，优化胰蛋白酶酶解条件。
3.3胰蛋白酶酶解条件优化
根据表8的实验结果，进行方差分析，发现因子A、B、C、D、E均高度显著。从极差的结果看出，A＞E＞D＞C＞B，即影响氨基态氮含量大小的因素依次为温度、加酶量、时间、料液比以及PH。由结果可知，A4B3C2D4E3为较好组合。即为反应温度：45℃，PH：8，料液比：1∶1，时间：8h，加酶量：0.064g。再对该组合进行优化，最终确定最佳的酶解条件为温度51℃、PH8、加酶量1200u/g(0.064g/g)、料液比1∶1、反应时间16h。在此条件下氨态氮含量为3.32mg/g。
3.4G-25分离纯化结果：
如图2所示，得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，得到具有抗肿瘤活性的峰2，收集峰2，冷冻干燥，进行高效液相纯度检测。
3.5高效液相纯度测定结果
如图3所示，高效液相纯度检测的结果显示，通过超滤、G-25两步分离纯化得乌贼墨酶解寡肽单一组分。
3.6氨基酸序列检测结果：N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys
3.7CCK-8检测乌贼墨寡肽对DU-145细胞增殖活性的影响：以F-12为对照组，比较不同浓度乌贼墨寡肽对DU-145细胞增殖的影响。各组、各时间点DU-145细胞增殖活性见表10。经统计学分析，各浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；相差5mg/ml的浓度组之间没有统计学意义，各时间点组及相差10mg/ml的浓度组两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)，DU-145细胞的增殖活性与乌贼墨寡肽浓度和作用时间呈负相关。
表10乌贼墨寡肽对前列腺癌细胞DU-145细胞增殖的影响(
n＝7)
Table 10 Effect of oligopeptides from ink of Sepia on proliferation of DU-145 cells(
n＝7)
与对照组相比：*P＜0.05
*P＜0.05vscontrol group
Claims (7)
1.一种乌贼墨寡肽，其特征在于该乌贼墨寡肽的N端氨基酸序列为Gln-Pro-Lys。
2.一种乌贼墨寡肽酶解制备方法，其特征在于包括如下步骤：
①样品的制备，将鲜乌贼墨原料匀浆，乌贼墨匀浆后原料与超纯水的比值1∶0～1∶3，调节pH值至7.0～8.5；
②加入胰蛋白酶，加酶量为0.032g/ml～0.096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解温度为35～53℃，灭活，离心，取上清液；
③分离与纯化，经过超滤和Sephadex G-25层析分离；
④收集，于280nm处检测，收集各峰洗脱液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的超滤为将样品清液加入超滤杯，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的Sephadex G-25层析分离为将样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取样品溶液过Sephadex G-25柱，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①中料液比为1∶1，pH值为8，步骤②中的酶解时间为8～20小时，酶解温度为45～51℃，加酶量为0.064g/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括步骤⑤对收集后的样品进行纯度检测。
7.一种如权利要求1所述的乌贼墨寡肽在人前列腺癌上的应用。
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