CN104789621B - 一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法 - Google Patents

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一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法，其特点是，将蛹虫草经温度60～80℃烘干，粗粉碎过40目筛，再纳米粉碎3～5h，制得蛹虫草纳米微粒；将蛹虫草纳米微粒加入到蒸馏水中，摇匀，自然PH值，在高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min，制得种子培养基；在蒸馏水中放入牛肉膏,蛋白胨，氯化钠,PH在6～7，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，冷却制得普通牛肉膏蛋白胨培养基，将地衣芽孢杆菌菌株斜面菌种接种普通牛肉膏蛋白胨培养基，于30～40℃，培养1～2d制得接种活化好的地衣芽孢杆菌，将活化好的地衣芽孢杆菌接种子培养基中，制得抗氧化肽成品。其制备方法高效、低成本、生产周期短、适用于规模化生产。

Description

一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法。
背景技术
现代研究发现，几乎所有疾病的产生都和自由基有关。自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力。目前，天然抗氧化剂的开发和利用已经普遍展开，就我国而言，存在种类单一，生产力较低，产品稳定性较差的弊端。生物活性肽以其用量少、活性强的独特优势，越来越引起人们重视，其工业化生产也成为当前食品和医药行业发展的大趋势。现已报道国内外从食物蛋白源中酶解或提取具有抗氧化活性的肽有大豆肽、玉米肽、青雪肽等。
蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)又名北冬虫夏草，是我国传统药食两用真菌。蛹虫草含有虫草素、腺苷、虫草多糖、SOD等多种活性成分，具有降血糖、降血脂、抗菌、抗癌、提高免疫力等多种功效。目前，对蛹虫草的研究主要集中在活性成分的提取、分离纯化及药理、药效上。市场上已有多种蛹虫草制品，如虫草茶、虫草酒、虫草饮料和各类胶囊、片剂；生物活性肽日本以为功能因子已经开发出婴儿食品、运动食品、降压食品等系列食品；生物活性肽国内以三九集团有限公司为代表，也开发出多种保健品，如“三九蛋白肽”、“三九大豆多肽”、“三九降糖肽”等。蛹虫草富含蛋白质30％以上，却很少作为功能因子开发利用。有关蛹虫草多肽的研究，见钱卫文等采用蛋白酶水解经脱脂、制粉后的蛹虫草粉，制的多肽含量40％～60％。
获得生物活性肽主要有三种方式：1、从组织器官中提取的天然活性肽，提取过程繁琐；2、人工合成的多肽，存在多种化合物残留问题；3、体外水解蛋白质生产活性肽。目前，利用动植物蛋白制备抗氧化肽主要采用酸水解或酶解法，此两种方法存在水解时间长、水解效率低下，产物与蛋白不易分离等缺陷，因而成为限制抗氧化肽市场化应用的障碍。
发酵法制备蛹虫草抗氧化肽，是利用蛹虫草纳米微粒直接发酵，省去蛹虫草蛋白质提取繁琐工艺，同时，通过微生物自身的复合酶系可以酶解释放出高浓度、分子量分布较为集中的活性肽，提高水解率，增加酶解产物抗氧化活性。目前，将纳米技术结合微生物发酵对蛹虫草进行深加工的研究未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术弊端，提供一种高效、低成本、生产周期短、适用于规模化生产的发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法，其特征是，它包括以下步骤：
(1)将蛹虫草经温度60～80℃烘干，粗粉碎过40目筛，再纳米粉碎3～5h，制得蛹虫草纳米微粒；
(2)按蛹虫草纳米微粒与蒸馏水1：20比例，将蛹虫草纳米微粒5g加入到蒸馏水100mL中，摇匀，自然PH值，在高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min，制得种子培养基；
(3)在烧杯中加入蒸馏水100ml，放入牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，PH在6～7，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，冷却制得普通牛肉膏蛋白胨培养基，将地衣芽孢杆菌菌株斜面菌种接种普通牛肉膏蛋白胨培养基，于30～40℃，培养1～2d制得接种活化好的地衣芽孢杆菌，将活化好的地衣芽孢杆菌5g接入步骤(2)所述的种子培养基中，在转速140r/min条件下，摇床培养4～6d，冷至室温，在4000r/min条件下，离心15/min制得抗氧化肽成品。
所述的地衣芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为：CCTCCNO:M208251。
本发明发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法的有益效果如下：
1.制备的抗氧化肽制剂含有丰富的营养物质，如维生素、微量元素、人体必需的氨基酸等，不含任何有害物质；
2,制备的抗氧化肽制剂含有丰富的功能活性成分，如虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸等，具有显著的抗氧化功效，可提高人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒；
3.以蛹虫草为直接发酵基质，制备方法简化，适用于规模化生产，以地衣芽孢杆菌替代大量昂贵的酶制剂，生产成本低，多肽得率高；
4.制备的抗氧化肽制剂可作为功能食品、抗氧化剂，亦可作为保健药物开发利用。
附图说明
图1蛹虫草粉碎3h纳米粒径分布图；
图2蛹虫草粉碎4h纳米粒径分布图；
图3蛹虫草粉碎5h纳米粒径分布图；
图4蛹虫草发酵液虫草素、腺苷检测谱图；
图5蛹虫草抗氧化肽制剂氨基酸检测谱图。
具体实施方式
本发明的一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤：
(1)将蛹虫草经温度60～80℃烘干，粗粉碎过40目筛，再纳米粉碎3～5h，制得蛹虫草纳米微粒；
(2)按蛹虫草纳米微粒与蒸馏水1：20比例，将蛹虫草纳米微粒5g加入到蒸馏水100mL中，摇匀，自然PH值，在高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min，制得种子培养基；
(3)在烧杯中加入蒸馏水100ml，放入牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，PH在6～7，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，冷却制得普通牛肉膏蛋白胨培养基，将地衣芽孢杆菌菌株斜面菌种接种普通牛肉膏蛋白胨培养基，于30～40℃，培养1～2d制得接种活化好的地衣芽孢杆菌，将活化好的地衣芽孢杆菌5g接入步骤(2)所述的种子培养基中，在转速140r/min条件下，摇床培养4～6d，冷至室温，在4000r/min条件下，离心15/min制得抗氧化肽成品。
所述的地衣芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为：CCTCCNO:M208251。
参照图1-3，蛹虫草纳米微粒的制备
(1)将蛹虫草经温度60～80℃烘干，粗粉碎过40目筛，加入纳米球磨粉碎机中，粉碎3～5h，即为蛹虫草纳米微粒，经纳米粒径分析仪检测，图1～图3分别为蛹虫草粉碎3h、4h、5h纳米粒径分布情况。
蛹虫草发酵的优化
1.响应面法优化菌株发酵
按Central-composite设计原理进行响应面试验设计，试验以随机顺序进行。
表1因素水平表
2.实验结果
根据表1的因素和水平进行试验设计，按照设计的试验点进行试验，得出各试验点下的产量如表2所示。
表2响应面设计及试验结果
利用DesignExpert软件对试验数据进行二次多项拟合，获得活性肽产量y对温度、pH、以及发酵时间的二次多项回归方程：
Y＝0.12+8.98E-003A+0.013B+0.012C+5.75E-003AB+6.25E-003AC+0.012BC－0.026A2－0.026B2－0.027C2
对此二次模型进行方差分析(Analysis ofvariance，ANOVA)，如表3所示，结果表明：在a＝0.01的水平时，该模型回归极显著(P<0.0001)，温度、pH以及时间对活性肽均有显著的影响(P<0.0001)，二次项(A2，B2，C2)均极显著，且交互项AB，AC，BC显著(P<0.05)，说明各因素对响应值的影响并不仅仅是简单的线性关系，而且存在一定的交互作用。
表3 ANOVA分析结果
模型的可决系数R2＝0.9836，失拟项不显著(P>0.05)，如表4所示，从另一个角度说明该方程对数据进行了很好的拟合，同时，相对低的离散系数(CV＝6.58％)说明整个试验具有良好的精密度和可靠性。
表4回归模型的可决系数与离散系数
表5验证试验
(2)按蛹虫草纳米微粒与蒸馏水1：20比例，将蛹虫草纳米微粒5g加入到蒸馏水100mL中，摇匀，自然PH值，在高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min，制得种子培养基；
(3)在烧杯中加入蒸馏水100ml，放入牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g,PH在6～7，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，冷却制得普通牛肉膏蛋白胨培养基，将地衣芽孢杆菌菌株斜面菌种接种普通牛肉膏蛋白胨培养基，于30～40℃，培养1～2d制得接种活化好的地衣芽孢杆菌，将活化好菌龄24h的地衣芽孢杆菌5g接入步骤(2)所述的种子培养基中，在转速140r/min条件下，摇床培养4～6d，冷至室温，在4000r/min条件下，离心15/min,上清液进行虫草素、腺苷检测。虫草素和腺苷检测方法参照NY/T2116-2012。结果：虫草素和腺苷检测谱图见图4，含量分别为86ug/mL和135ug/mL。上清液冷冻干燥得蛹虫草抗氧化肽制剂，进行氨基酸检测，氨基酸检测方法参照GB/T5009.124-2003，氨基酸检测谱图见图5，含量见表6。该抗氧化肽制剂的抗氧化活性检测如下：清除羟自由基IC50值为0.56mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.68mg/mL，清除DPPH自由基的IC50值为1.24mg/mL。
所述的地衣芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为：CCTCCNO:M208251。
表6抗氧化肽制剂氨基酸含量(％)
本发明一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法的具体实施方式并非穷举，本领域技术人员不经过创造性劳动的任何变换均属于本发明权利保护的范围。

Claims (1)

1.一种发酵蛹虫草纳米微粒制备抗氧化肽的方法，其特征是，它包括以下步骤：
(1)将蛹虫草经温度60～80℃烘干，粗粉碎过40目筛，再纳米粉碎3～5h，制得蛹虫草纳米微粒；
(2)按蛹虫草纳米微粒与蒸馏水1：20比例，将蛹虫草纳米微粒5g加入到蒸馏水100mL中，摇匀，自然pH值，在高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min，制得种子培养基；
(3)在烧杯中加入蒸馏水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，pH在6～7，121℃高压蒸汽灭菌20～30min，冷却制得普通牛肉膏蛋白胨培养基，将地衣芽孢杆菌菌株斜面菌种接种普通牛肉膏蛋白胨培养基，于30～40℃，培养1～2d制得接种活化好的地衣芽孢杆菌，将活化好的地衣芽孢杆菌5g接入步骤(2)所述的种子培养基中，在转速140r/min条件下，摇床培养4～6d，冷至室温，在4000r/min条件下，离心15/min，取上清液制得抗氧化肽成品；
其中，所述的地衣芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为：CCTCCNO:M208251。
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