CN104651285A

CN104651285A - 一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104651285A
Application number: CN201510110580.4A
Authority: CN
Inventors: 李纪顺; 吴远征; 扈进冬; 周红姿; 魏艳丽; 杨合同; 陈凯
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明公开了一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用。利用提取红曲色素后剩余的红曲废渣为主要培养基质，接种枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵生产红曲纳豆菌粉，该红曲纳豆菌粉具有降血脂作用，可作为食品或食品添加剂，用于制备预防脉粥样硬化等中老年疾病的食品或保健食品。

Description

一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及红曲废渣再利用技术领域，特别是涉及一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用。

背景技术

近年来，随着人们对合成食品添加剂和化学药物对人体毒副作用的认识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热潮，许多传统的药、食两用品如红曲、纳豆等引起了极大的关注。红曲和纳豆均对中老年人心脑血管具有良好的保健效果，但他们又分别具有各自不同的作用机理，如果将二者有机结合，可以获得更好的预防和治疗高血脂、动脉粥样硬化等中老年疾病的保健食品。

根据中医传统理论，红曲味甘性温，具有调节血脂浓度和减缓心血管疾病的功效。红曲霉（Monascus spp.）是生产红曲酒、红曲米、功能性红曲和天然色素的主要菌种。1979年日本学者远藤章首次从红曲霉中发现胆固醇合成抑制剂—洛伐他汀（Monacolin K），其后红曲的降血脂、降胆固醇、降血压、降血糖等机理功能被广泛研究并证明。红曲发酵后还可分离到辅酶Q₁₀，辅酶Q₁₀又称泛醌、癸烯醌，是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂，具有抗氧化、增强免疫力和清除自由基的作用，可降低脂蛋白和血液胰岛素、抑制胆固醇氧化而防止动脉粥样硬化，在心脏病治疗中有很好的疗效，同时在恶性肿瘤、脑血管障碍、高血压等疾病治疗中也发挥着重要的作用，被广泛应用于医药保健品和美容化妆品中。另外，红曲霉还以发酵生产色素著称。中国食品发酵工业研究所王柏琴等将红曲色素用在发酵香肠中，代替亚硝酸盐发色，用1.6 mg/g红曲色素制作的颜色接近于用0.15 mg/g亚硝酸钠。

纳豆是以黄豆为原料，接种纳豆芽孢杆菌后经过高温发酵等多种工序制作而成。纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. natto）又称纳豆菌，属于细菌科、枯草芽孢杆菌属的一个亚种，由于其能固态发酵黄豆生产纳豆，因此又被俗称为纳豆芽孢杆菌。纳豆源于中国，纳豆传入日本后将其作为营养食品和调味品，已经被开发成多种保健功能食品。研究发现纳豆具有调节血压、降低血液胆固醇的功能，对高血脂、高血压、血栓病等有辅助治疗作用，得到美国FDA的认可。纳豆的保健功能主要与其中的纳豆激酶（nattokinase简称NK）、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子有关。日本宫崎医科大学须见洋行教授动物实验证实，纳豆食品可以抑制血中的LDL氧化，有效降低总胆固醇以及三酸甘油酯的浓度，进而减少粥状动脉硬化的发生。纳豆发酵形成一种特殊气味，是具有很强地方嗜好性的食品，不适合大多数中国居民口味，国内消费者普遍感到不容易接受。

目前国内红曲生产主要以大米为原料接种红曲霉，经固体或液体深层发酵，产生红曲发酵产物，采用脱水、压干等工艺提取红曲色素，产品大多数色价较低、价格较高，质量参差不齐。红曲米生产企业规模偏小，欠缺实用技术的开发，不能够满足目前市场的需要。红曲生产过程中会产生大量的菌丝体废渣（简称为红曲废渣），据统计每生产1吨红曲相应产生2.3-2.5吨废渣，这些废渣一般被作为饲料，价格低廉，是对资源的极大浪费。通过对红曲废渣的分析发现，主要成分为菌丝体与固形物，其中蛋白含量38%-40%，灰分4%，色价300以上，含少量辅酶Q₁₀，基本不含洛伐他汀组分。广东医学院吴铁等用酸或碱处理抽提废弃的红曲菌丝体，发现提取物有很好的降血脂和预防骨质疏松的作用。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用。以提取红色素后剩余的红曲废渣为主要原料接种枯草芽孢杆菌纳豆亚种进行发酵，提升红曲废渣的营养价值，红曲的香气可以掩盖纳豆常规发酵中产生的异味，使其更易为人们所接受，以此为基础调配出一种营养丰富、气味芳香、兼具红曲与纳豆保健功能的红曲纳豆菌粉，可以用在降血脂、预防粥状动脉硬化保健食品等方面。

本发明的一种红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂的制备方法及应用技术方案为，一种红曲纳豆菌粉的制备方法，通过提取红色素后剩下的红曲废渣作为主要培养基质接种培养枯草芽孢杆菌纳豆亚种，烘干粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，依次包括以下步骤：

（1）红曲废渣经烘干粉碎；

（2）添加麸皮和粉碎的黄豆搅拌均匀，调节含水量，121℃灭菌30 min，冷却后作为红曲废渣培养基；

（3）接种枯草芽孢杆菌纳豆亚种培养，60℃烘干12-16 h，粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

步骤（1）中红曲废渣经烘干粉碎后过80目筛。

步骤（2）中分别添加占红曲废渣干物重量10%的麸皮和6%的粉碎的黄豆搅拌均匀，调节含水量至40%，121℃灭菌30 min。

步骤（3）中枯草芽孢杆菌纳豆亚种接种量为红曲废渣培养基的5%-10%（v/w）。

本发明中所述枯草芽孢杆菌纳豆亚种为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JN-1，由家庭自制发酵的纳豆中分离获得。称取10 g豆豉样品于100 mL无菌水中搅拌1 h，取上清液系列稀释，涂布牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.1%，琼脂2.0%，pH 7.0-7.2），用牙签分离挑选单菌落，选择能拉出丝的单菌落，参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版、《微生物分类学》等对所选菌株进行鉴定，初步鉴定获得31株产拉丝粘质的革兰氏阳性芽孢菌，接种液体培养基（蛋白胨1.5%，葡萄糖1.5%，KH₂PO₄ 0.2%，K₂HPO₄ 0.4%，MgSO₄ 0.05%，pH 7.0-7.2）40℃摇床培养48 h，离心制备发酵液。参照Astrup等方法测定发酵液的酶纤溶活性，制备纤维蛋白平板，在平板上分别点样，于37℃恒温培养17 h，分别测定溶圈的垂直直径，以尿激酶标准品作标准曲线。筛选出酶活值最高的一株菌株，鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种（Bacillus subtilis subsp. natto），经过保藏，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JN-1，2014年12月23日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101）保藏，其保藏编号为CGMCC No.10236，其重要特性是能产生纤溶酶与果聚糖等大分子物质。

步骤（3）中接种后在40℃下培养2-3天，60℃烘干12-16 h，粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

步骤（3）中枯草芽孢杆菌通过以下菌种培养步骤得到：

a. 牛肉膏蛋白胨固体平板培养，培养基为牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.1%，琼脂2.0%，余量为水，pH 7.0-7.2；

b. 将固体平板上长出的枯草芽孢杆菌单菌落接入液体培养基中，液体培养基为蛋白胨1.5%，葡萄糖1.5%，KH₂PO₄ 0.2%，K₂HPO₄ 0.4%，MgSO₄ 0.05%，余量为水，pH 7.0-7.2；40℃ 150-220 r/min转速震荡培养8-12 h。

将红曲纳豆菌粉添加总固形物质量分数30%-60%的麦芽糊精和0.5%-2%的阿拉伯糖，进口温度120-200℃，出口温度80-120℃，进行喷雾干燥，制备微胶囊制剂。

所述的方法制备的红曲纳豆菌粉或其微胶囊制剂在制备降血脂保健食品方面的应用，利用上述得到的红曲纳豆菌粉及其微胶囊制剂生产制备降血脂保健食品及食品添加剂，可以预防动脉粥样硬化等中老年疾病。

通过本发明方法获得的红曲纳豆菌粉可作为添加剂用于功能食品或保健品的配方中，供有动脉粥样硬化等中老年疾病的患者作为健康食品应用，优选添加量在5%-20%范围。

本发明的有益效果为：利用大米等原料生产红曲色素剩余的红曲废渣粉碎后过筛，添加适当比例粉碎的黄豆和麸皮，接种枯草芽孢杆菌纳豆亚种进行二次发酵，制备兼具辅酶Q₁₀和纳豆激酶双重活性的红曲纳豆菌粉，红曲的香气能够掩盖纳豆常规发酵中产生的异味。通过饲喂肥胖症大鼠模型检测，证明该红曲纳豆菌粉具有降血脂作用，可作为食品或食品添加剂，用于制备预防脉粥样硬化等中老年疾病的食品或保健食品。

大鼠高脂模型检测本发明得到的红曲纳豆菌粉的降血脂效果：以正常大鼠、高血脂大鼠及阳性药物组大鼠为对照，给予高脂大鼠红曲产品灌胃，连续5周，末次灌胃后禁食12 h，不限饮水，取血，检测血清总胆固醇含量降低39.7%，低密度脂蛋白胆固醇含量降低74.9%，说明本发明产品对高血脂大鼠有显著降血脂的效果。

本发明方法简单易行，成本低，易于工业化，所获得的红曲纳豆菌粉营养丰富、气味芳香、兼具红曲与纳豆保健功能，并具有明显的降血脂功效。

附图说明：

图1所示为本发明实施例1红曲纳豆菌粉中小分子多肽HPLC测定结果（仪器：Alliance HPLC Waters_e2695，进样体积：10.00 μL，方法：纯水至30%乙腈T3，处理软件：Empower 3 Build 3471）；

图2所示为红曲废渣培养基未接种本发明的枯草芽孢杆菌纳豆亚种的小分子多肽HPLC测定结果。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

红曲废渣培养枯草芽孢杆菌纳豆亚种实验

菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JN-1，由家庭自制发酵的纳豆中分离获得。称取10 g豆豉样品于100 mL无菌水中搅拌1 h，取上清液系列稀释，涂布牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.1%，琼脂2.0%，pH 7.0-7.2），用牙签分离挑选单菌落，选择能拉出丝的单菌落，参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版、《微生物分类学》等对所选菌株进行鉴定，初步鉴定获得31株产拉丝粘质的革兰氏阳性芽孢菌，接种液体培养基（蛋白胨1.5%，葡萄糖1.5%，KH₂PO₄ 0.2%，K₂HPO₄ 0.4%，MgSO₄ 0.05%，pH 7.0-7.2）40℃摇床培养48 h，离心制备发酵液。参照Astrup等方法测定发酵液的酶纤溶活性，制备纤维蛋白平板，在平板上分别点样，于37℃恒温培养17 h，分别测定溶圈的垂直直径，以尿激酶标准品作标准曲线。筛选出酶活值最高的一株菌株，鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种（Bacillus subtilis subsp. natto），经过保藏，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JN-1，，2014年12月23日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101）保藏，其保藏编号为CGMCC No.10236，其重要特性是能产生纤溶酶与果聚糖等大分子物质。

将枯草芽孢杆菌纳豆亚种JN-1划线接种于牛肉膏蛋白胨固体平板，40℃培养10 h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，40℃ 150-220 r/min转速震荡培养8-12 h。

将提取红曲色素后剩余的红曲废渣烘干粉碎过80目筛，分别添加占红曲废渣干物重量10%的麸皮和6%的粉碎的黄豆，搅拌均匀，调节含水量至40%，121℃灭菌30 min，冷却后作为红曲废渣培养基。将上述活化好的种子培养液按5%-10%（v/w）接种量接种于装有100 g红曲废渣培养基的1000 mL三角瓶中，40℃下培养2-3天。发酵结束后，检验其中枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌体数量达到10⁹ CFU以上，纤维蛋白平板法纳豆激酶酶活为2500-3000 U，醇碱皂化法测定辅酶Q₁₀含量为250-400 mg/kg，HPLC测定样品中小肽含量比未接菌样品明显增加（见说明书附图图1和图2）。将发酵产物60℃烘干12-16 h，粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

实施例2：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JN-1的鉴定

采用形态特征和生理生化特征鉴定枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JN-1为枯草芽孢杆菌纳豆亚种（Bacillus subtilis subsp. natto）。具体步骤如下：

采用营养琼脂平板（酵母浸粉0.5%，大豆蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 值7.0）接种后在40℃恒温条件下培养，24h后形成明显菌落，圆形、干燥、边缘不整齐、表面褶皱、不透明、有粘性的白色菌落。菌体充分成熟后大部分形成芽孢，大于0.7-0.8μm×2-3μm，革兰氏阳性。最高温度为50℃，最低为10℃，最适合温度为40℃。

生理生化特性表现为有运动性、严格好氧生长、V-P试验和过氧化氢试验阳性；能够水解酪素、淀粉、明胶和纤维蛋白；能够利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和甘露醇发酵产酸；可以在pH值7.5和含有2%-7% NaCl的培养基中生长，同时在生长过程中产生具有纤溶活性的纳豆激酶，其生理生化特性与纳豆芽孢杆菌模式菌株完全一致，可鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种。

实施例3：

用高脂乳剂灌胃建立大鼠高脂模型，给予5 mL/kg/d红曲纳豆菌粉灌胃，连续14周，末次灌胃后禁食12 h，不限饮水，取血。检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，将其与正常大鼠、高血脂大鼠及阳性对照组血脂康大鼠各项指标比较，观察本发明产品对高血脂大鼠血脂的影响。具体实验步骤如下：

1材料与方法

1.1实验动物及饲养条件

3月龄雄性SD大鼠40只，体重242.2±14.9 g，由北京维通利华公司提供。

饲养条件：饲养时室内温度保持24-28℃，湿度在50%-60%，专室分笼饲养，隔日更换垫料，自由摄水、摄食（标准饲料喂养），每周称体重一次。

1.1.1高脂乳剂的组成：5%胆固醇、1%胆酸钠、0.5%丙基硫氧嘧啶和动物油（新鲜猪肠油炼制）

1.1.2本发明产品：实施例1中喷雾干燥后产品，按5 mL/kg/d比例添加。

1.1.3阳性对照药：血脂康（北京北大维信生物科技有限公司）

1.2实验动物及分组

①实验动物：雄性SD大鼠。

②剂量分组：

实验设阴性对照组（正常饲喂）、模型对照组（添加高脂乳剂），血脂康阳性对照组，本发明产品组共4个组，每组10只动物。由大鼠体重应用Microsoft Excel产生随机数列随机分成。

1.3高脂乳剂的配制：

将50 g胆固醇和1O g胆酸钠分别加入到1，2-丙二醇200 mL中混匀，再加入吐温-80 50 mL混匀；向混悬液中加入5 g丙基硫氧嘧啶混匀，最后与猪油500 g充分混匀制得高脂乳剂混悬液，置4℃冰箱保存备用，每天5 mL/kg灌胃，建立高脂大鼠实验模型。

1.4实验方法：

适应性饲养4周后开始实验，空腹12 h称重作为基准。

每组均给予标准饲料喂养，其中模型对照组、血脂康和本发明产品组给予高脂乳剂灌服，阴性对照组灌服蒸馏水，灌胃容量均为5 mL/kg，连续灌服8周，动物自由进食和饮水，每隔7 d称量体重1次。第9周起血脂康和本发明产品组同时添加血脂康和本发明产品配制成的糊剂灌胃，直至第14周，空腹12 h于心脏取血，测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C值。

1.5主要仪器与试剂：

采用总胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C值。

1.6数据处理：

采用SPSS 17.0统计软件包分析，采用OneWay ANVOA分析，差异显著性检验水准为0.05。

2结果

2.1本发明产品对高脂模型动物体重的影响如表1所示

表1 本发明产品对高脂模型动物体重的影响（X±s，η=10）

。

实验各组中大鼠体重随时间均有明显增加趋势。至实验结束各组大鼠体重基本一致，但无统计学意义，差异无显著性。

2.2本发明产品对大鼠血脂的影响见表2。

表2 本发明产品对大鼠血脂的影响

。

与对照组相比在a：P＜0.05，A：P＜0.01差异；与模型组相比在b：P＜0.05，B：P＜0.01差异

从表2结果可见：与阴性对照组相比，模型对照组总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均有显著升高，甘油三酯明显下降，而高密度脂蛋白胆固醇没有明显影响。说明模型有效，与高脂模型组相比，血脂康组总胆固降低了约50.2%（P<0.01）；本发明产品组总胆固醇降低了约39.7%（P<0.01），但降胆固醇作用均未能达到正常水平，与正常对照组比较，差别有明显的显著性（P<0.01）。

与高脂模型组相比，血脂康组低密度脂蛋白胆固醇减少了约56.8%（P<0.01）；红曲产品组低密度脂蛋白胆固醇减少了约74.9%（P<0.01）；与高脂模型组相比，血脂康组高密度脂蛋白胆固醇没有显著性升高，本发明产品组高密度脂蛋白胆固醇升高了约23.7%（P<0.01）。

与高脂模型组相比，血脂康组和本发明产品组对甘油三酯没有显著性差异，但与正常对照组比较，模型组及三组用药组的血清甘油三酯均比对照组要低，差异具有显著性（P<0.01）。

综上所述，以红曲废渣为主要基料发酵获得的本发明产品具有降胆固醇、降血脂等功能，同时其营养丰富，使用安全、副作用小等多种优势，可制成药物或保健食品，特别是饼干及饮料，具有极为广阔的市场空间。

Claims

1.一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，提取红色素后剩下的红曲废渣作为主要培养基质接种培养枯草芽孢杆菌纳豆亚种，烘干粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

2. 根据权利要求1所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

（1）红曲废渣经烘干粉碎；

3. 根据权利要求2所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中红曲废渣经烘干粉碎后过80目筛。

4. 根据权利要求2所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中分别添加占红曲废渣干物重量10%的麸皮和6%的粉碎的黄豆搅拌均匀，调节含水量至40%，121℃灭菌30 min。

5. 根据权利要求2所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中枯草芽孢杆菌纳豆亚种为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JN-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.10236，保藏日期为2014年12月23日。

6. 根据权利要求5所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中枯草芽孢杆菌纳豆亚种接种量为红曲废渣培养基的5%-10%（v/w）。

7. 根据权利要求6所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中接种后在40℃下培养2-3天，60℃烘干12-16 h，粉碎后获得红曲纳豆菌粉。

8. 根据权利要求7所述的一种红曲纳豆菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中枯草芽孢杆菌通过以下菌种培养步骤得到：

9.一种红曲纳豆菌粉微胶囊制剂的制备方法，其特征在于，提取红色素后剩下的红曲废渣作为主要培养基质接种培养枯草芽孢杆菌，烘干粉碎后获得红曲纳豆菌粉，将红曲纳豆菌粉添加总固形物质量分数30%-60%的麦芽糊精和0.5%-2%的阿拉伯糖，进口温度120-200℃，出口温度80-120℃，进行喷雾干燥，制备红曲纳豆菌粉微胶囊制剂。

10. 如权利要求1或8所述的方法制备的红曲纳豆菌粉或其微胶囊制剂在制备降血脂保健食品方面的应用。