CN105132343A - 一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法 - Google Patents

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CN105132343A CN201510672916.6A CN201510672916A CN105132343A CN 105132343 A CN105132343 A CN 105132343A CN 201510672916 A CN201510672916 A CN 201510672916A CN 105132343 A CN105132343 A CN 105132343A
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Abstract

本发明属于生物化工及着色剂生物技术领域，尤其涉及一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法。所述菌株为从土壤中筛选得到产红色素的细菌XF105，菌种为Paenibacillus？agaridevoransXF-105，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2014644，保藏日期：2014年12月11日，所述菌株的基因序列如SEQ？ID？No.1所示。产红色素稳定，红色素色调自然，菌株易于包藏，保藏时间长存活率高，4℃斜面包藏半年菌株仍能存活；该红色素的提取方法成本低廉。

Description

一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法
技术领域
本发明属于生物化工及着色剂生物技术领域，尤其涉及一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法。
背景技术
现在常用的食品色素包括两类：天然色素与人工合成色素。天然色素来自天然物，主要由植物组织中提取，也包括来自动物和微生物的一些色素。人工合成色素是指用人工化学合成方法所制得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成的。合成色素存在致癌、致畸的风险，随着合成色素致癌事件的增多，色素安全问题备受人们关注，同时食品行业的快速发展也使得市场对色素的需求也随之增加。红色素作为三原色之一，已成为色素研究领域的热点。
市场上销售的天然红色素是以植物红色素为主，但植物色素因受产地、气候、时间以及提取成本的影响，导致其应用受到一定的制约。微生红色素也作为另一类具有巨大潜力的天然色素，与其相关的研究及报道较多。已报道的微生物红色素主要有灵菌红色素、类胡萝卜素、番茄红色素、紫色杆菌素、放线紫红素以及红曲霉色素。其产生菌株主要有：细菌、丝状真菌、酵母、放线菌和藻类。其中，利用红曲霉生产红曲色素在我国及日本已有较长历史，但因其代谢过程中会伴随桔霉素的产生而未能进入欧洲市场，在欧洲三孢不拉霉菌已被应用于生产食品级β-胡萝卜素和番茄红。
红曲色素的光稳定性较弱且其代谢合成途径人存在较大争议，灵菌红色素、放线紫红素、紫色杆菌素等仍处于实验研究阶段，筛选新的红色素生产菌株仍然是目前色素研究领域的热点。
研究发现，部分细菌、霉菌、酵母等都能在代谢过程中产生红色素，且已发现的微生物红色素大多具有一定的抗氧化、促进生长、抗癌等生物活性。目前投入应用的主要投入生产的主要有红曲霉素和类胡萝卜素，且其生产菌株均为霉菌。而关于细菌红色素投入生产还未见报道，且细菌较真菌代谢更快是一种潜在的红色素生产菌株。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法，该菌株为产红色素的Paenibacillusagaridevorans属菌株，产红色素稳定，红色素色调自然，菌株易于保藏，保藏时间长存活率高，4℃斜面包藏半年菌株仍能存活；该红色素的提取方法成本低廉。
解决以上技术问题的本发明中的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述菌株为从土壤中筛选得到产红色素的细菌XF105，菌种为红色类芽孢杆菌XF-105(PaenibacillusagaridevoransXF-105)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2014644，保藏日期：2014年12月11日。
所述菌株的基因序列如SEQIDNo.1所示。
本发明提供一类新的红色素产生菌株，以丰富现有微生物红色素品种，为红色素的生产提供一种新的途径。
本发明中一种产红色素的细菌菌株，所述菌株采用以下方法制备：
(1)菌种的分离：
采集土壤，称取土样装入仪器中，再加入无菌水，土样与无菌水的质量体积比例为1：8-9，转速140-160r/min振荡25-35min，静置25-35min后梯度稀释，吸取稀释液，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，26-29℃恒温培养1-5d；可为10倍梯度稀释，可吸取稀释液200uL涂布。
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉19-21份，KNO30.8-1.2份，NaCl0.4-0.6份，K2HPO4·3H2O0.4-0.6份，MgSO4·7H2O0.4-0.6份，FeSO4·7H2O0.008-0.012份，琼脂17-19份，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏2.5-3.5份,蛋白胨9-11份，NaCl4.5-5.5份,琼脂16-19份，蒸馏水0.98-1.2L,pH6.9-7.1；
PDA培养基的配方为土豆198-202份，葡萄糖19-21份，琼脂17-19份，蒸馏水0.98-1.2L，pH6.9-7.1；
(2)菌种纯化、培养：
挑取步骤(1)中已产红色素菌株采用平板划线的方式在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉19-21份，KNO30.8-1.2份，NaCl0.4-0.6份，K2HPO4·3H2O0.4-0.6份，MgSO4·7H2O0.4-0.6份，FeSO4·7H2O0.008-0.012份，琼脂16-17份，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3；
(3)种子的制备：
将步骤(2)中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉29-31g，KNO31.3-1.6g，NaCl0.4-0.6g，K2HPO4·3H2O1.2-1.6g，MgSO4·7H2O1.9-2.1g，FeSO4·7H2O0.009-0.012g，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3。
进一步优化方案中所述土壤为光照较弱环境下的干燥土壤，可为砂质土壤，一般选择树荫下，表面无明显潮湿现象的土壤。
利用本发明中的细菌制备红色素的方法，具体制备方法如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度20-32℃、发酵时间24-54h，装液量20-100mL/250mL、接种量2-14％、pH4-8；
发酵培养基的配方为：可溶性淀粉29-31g，KNO31.3-1.6g，NaCl0.4-0.6g，K2HPO4·3H2O1.2-1.6g，MgSO4·7H2O1.9-2.1g，FeSO4·7H2O0.009-0.012g，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3；
B、发酵液处理：
将发酵液倒入仪器中静置5-6.5h，待菌体沉降在仪器底部时收集菌体，移取收集到的菌体在转速10000r/min条件下离心8-12min，去掉上清液，再加入蒸馏水漩涡振荡1min洗涤菌体，菌体与蒸馏水的体积比为4：2.5-3.5，再次10000r/min离心8-12min后收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤(B)中所得的菌体中按固液体积比1:18-22(w/v)加入95％乙醇，58-62℃水浴1.5-2.5h，以10000r/min离心8-12min，得到红色素粗提液；
红色素粗提液中加入大孔树脂X-5避光静置22-25h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为9-11：1。
优化方案中所述步骤(A)中发酵温度26-32℃、发酵时间36-48h，装液量40-80mL/250mL、接种量6-12％、pH6-8。
进一步优化方案中所述步骤(A)中发酵温度27℃、装液量56mL/250mL、接种量9.78％、pH6.15。
所述步骤(A)中菌株红色素的吸光度为0.415，回归模型的预测值为0.3996。
所述步骤(C)中乙酸乙酯为V树脂：V乙酸乙酯＝1:1的洗脱混合液。
还有利用本发明中的制备红色素的方法得到的红色素。
本发明以该菌株为生产菌株，采用乙醇浸提，大孔树脂X-5吸附，乙酸乙酯洗脱，从而对红色素进行浓缩。整个制备过程所需设备及生产工艺简单，乙醇及大孔树脂均能重复利用避免蒸发浓缩过程中色素的损失且大大降低生产成本。
本发明中菌株发酵周期短(24-48h),所用碳源为淀粉，成本较低，提取所需设备简单，所需试剂少且无毒能满足现代工业生产的要求。
本发明首次采用类芽孢杆菌属菌株生产红色素，生产过程中所需设备及试剂成本低廉适合工业化生产。与已投入生产的红色素产生菌株相比，该菌株代谢稳定且易于保藏，且破壁容易，红色素易于提取，浓缩简单无需蒸馏，有机溶剂能重复利用，进一步降低提取成本。
附图说明
图1为本发明中发酵时间对红色素产量的影响图
图2为本发明中温度对发酵结果的影响图
图3为本发明中pH对发酵结果的影响图
图4为本发明中接种量对发酵结果的影响图
图5为本发明中装液量对发酵结果的影响图
图6为本发明中红色素溶液吸光度残差分析图
图7为本发明中温度和pH的响应面分析图
图8为本发明中温度和装液量的响应面分析图
图9为本发明中接种量和温度的响应面分析图
图10为本发明中的工艺流程图
具体实施方式
以下用具体实施例来进一步说明本发明中的技术方案，其中所用菌株为从土壤中筛选得到产红色素的细菌XF105，菌种为红色类芽孢杆菌XF-105(PaenibacillusagaridevoransXF-105)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2014644。
保藏日期为2014年12月11日，菌株的基因序列如SEQIDNo.1所示。
实施例1
所述菌株采用以下方法制备：
(1)菌种的分离：
采集土壤，称取土样装入仪器中，再加入无菌水，土样与无菌水的质量体积比例为1：8，转速140r/min振荡25min，静置25min后10倍梯度稀释，吸取稀释液200uL，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，26℃恒温培养1-5d；所述土壤为光照较弱环境下的干燥土壤，可为砂质土壤，一般选择树荫下，表面无明显潮湿现象的土壤。
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉19份，KNO30.8份，NaCl0.4份，K2HPO4·3H2O0.4份，MgSO4·7H2O0.4份，FeSO4·7H2O0.008份，琼脂17份，蒸馏水0.98L，pH7.1；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏2.5份,蛋白胨9份，NaCl4.5份,琼脂16份，蒸馏水0.98L,pH6.9；
PDA培养基的配方为土豆198-202份，葡萄糖19份，琼脂17份，蒸馏水0.98L，pH6.9；
(2)菌种纯化、培养：
挑取步骤(1)中已产红色素菌株采用平板划线的方式在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉19份，KNO30.8份，NaCl0.4份，K2HPO4·3H2O0.4份，MgSO4·7H2O0.4份，FeSO4·7H2O0.008份，琼脂16份，蒸馏水0.98L，pH7.1；
(3)种子的制备：
将步骤(2)中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉29g，KNO31.3g，NaCl0.4g，K2HPO4·3H2O1.2g，MgSO4·7H2O1.9g，FeSO4·7H2O0.009g，蒸馏水0.98L，pH7.1。
实施例2
所述菌株采用以下方法制备：
(1)菌种的分离：
采集土壤，称取土样装入仪器中，再加入无菌水，土样与无菌水的质量体积比例为1：9，转速160r/min振荡25min，静置35min后9倍梯度稀释，吸取稀释液195uL，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，29℃恒温培养1-5d；所述土壤为光照较弱环境下的干燥土壤，可为砂质土壤，一般选择树荫下，表面无明显潮湿现象的土壤。
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉21份，KNO31.2份，NaCl0.6份，K2HPO4·3H2O0.6份，MgSO4·7H2O0.6份，FeSO4·7H2O0.012份，琼脂19份，蒸馏水1.2L，pH7.3；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏3.5份,蛋白胨11份，NaCl5.5份,琼脂19份，蒸馏水1.2L,pH7.1；
PDA培养基的配方为土豆202份，葡萄糖21份，琼脂19份，蒸馏水1.2L，pH7.1；
(2)菌种纯化、培养：
挑取步骤(1)中已产红色素菌株采用平板划线的方式在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉21份，KNO31.2份，NaCl0.6份，K2HPO4·3H2O0.6份，MgSO4·7H2O0.6份，FeSO4·7H2O0.012份，琼脂17份，蒸馏水1.2L，pH7.3；
(3)种子的制备：
将步骤(2)中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉31g，KNO31.6g，NaCl0.6g，K2HPO4·3H2O1.6g，MgSO4·7H2O2.1g，FeSO4·7H2O0.012g，蒸馏水1.2L，pH7.3。
实施例3
所述菌株采用以下方法制备：
(1)菌种的分离：
采集土壤，称取土样装入仪器中，再加入无菌水，土样与无菌水的质量体积比例为1：8-9，转速140-160r/min振荡25-35min，静置25-35min后11倍梯度稀释，吸取稀释液205uL，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，26-29℃恒温培养1-5d；所述土壤为光照较弱环境下的干燥土壤，可为砂质土壤，一般选择树荫下，表面无明显潮湿现象的土壤。
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉20份，KNO31.1份，NaCl0.55份，K2HPO4·3H2O0.5份，MgSO4·7H2O0.5份，FeSO4·7H2O0.009份，琼脂18份，蒸馏水1L，pH7.2；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏2.8份,蛋白胨11.5份，NaCl5.1份,琼脂17份，蒸馏水1.1L,pH7.05；
PDA培养基的配方为土豆201份，葡萄糖19.5份，琼脂18份，蒸馏水1.1L，pH7.1；
(2)菌种纯化、培养：
挑取步骤(1)中已产红色素菌株采用平板划线的方式在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉20份，KNO31.1份，NaCl0.55份，K2HPO4·3H2O0.5份，MgSO4·7H2O0.5份，FeSO4·7H2O0.009份，琼脂18份，蒸馏水1L，pH7.2；
(3)种子的制备：
将步骤(2)中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉30g，KNO31.4g，NaCl0.55g，K2HPO4·3H2O1.4g，MgSO4·7H2O2.05g，FeSO4·7H2O0.011g，蒸馏水1L，pH7.23。
实施例4
利用本发明中的细菌制备红色素的方法，具体制备方法如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度26℃、装液量54mL/250mL、接种量9.5％、pH6；发酵培养基的配方为：可溶性淀粉29g，KNO31.3g，NaCl0.4g，K2HPO4·3H2O1.2g，MgSO4·7H2O1.9g，FeSO4·7H2O0.009g，蒸馏水0.98L，pH7.1；
B、发酵液处理：
将发酵液倒入仪器中静置5h，待菌体沉降在仪器底部时收集菌体，移取收集到的菌体在转速10000r/min条件下离心8min，去掉上清液，再加入蒸馏水漩涡振荡1min洗涤菌体，菌体与蒸馏水的体积比为4：2.5，再次10000r/min离心8min后收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤(B)中所得的菌体中按固液体积比1:18加入95％乙醇，58℃水浴2.5h，以10000r/min离心12min，得到红色素粗提液；
红色素粗提液中加入大孔树脂X-5避光静置22h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为9：1。乙酸乙酯为V树 脂：V乙酸乙酯＝1:1的洗脱混合液。
实施例5
利用本发明中的细菌制备红色素的方法，具体制备方法如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度28℃、装液量57mL/250mL、接种量9.85％、pH6.2；发酵培养基的配方为：可溶性淀粉31g，KNO31.6g，NaCl0.6g，K2HPO4·3H2O1.6g，MgSO4·7H2O2.1g，FeSO4·7H2O0.012g，蒸馏水1.2L，pH7.3；
B、发酵液处理：
将发酵液倒入仪器中静置6.5h，待菌体沉降在仪器底部时收集菌体，移取收集到的菌体在转速10000r/min条件下离心12min，去掉上清液，再加入蒸馏水漩涡振荡1min洗涤菌体，菌体与蒸馏水的体积比为4：3.5，再次10000r/min离心12min后收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤(B)中所得的菌体中按固液体积比1:22加入95％乙醇，62℃水浴1.5h，以10000r/min离心12min，得到红色素粗提液；
红色素粗提液中加入大孔树脂X-5避光静置25h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为11：1。乙酸乙酯为V树 脂：V乙酸乙酯＝1:1的洗脱混合液。
实施例6
利用本发明中的细菌制备红色素的方法，具体制备方法如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度27℃、装液量55mL/250mL、接种量9.2％、pH6.15；
发酵培养基的配方为：可溶性淀粉30g，KNO31.4g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.4g，MgSO4·7H2O2g，FeSO4·7H2O0.011g，蒸馏水1.1L，pH7.2；
B、发酵液处理：
将发酵液倒入仪器中静置5.5h，待菌体沉降在仪器底部时收集菌体，移取收集到的菌体在转速10000r/min条件下离心11min，去掉上清液，再加入蒸馏水漩涡振荡1min洗涤菌体，菌体与蒸馏水的体积比为4：2.8，再次10000r/min离心10min后收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤(B)中所得的菌体中按固液体积比1:21加入95％乙醇，61℃水浴1.9h，以10000r/min离心10min，得到红色素粗提液；
红色素粗提液中加入大孔树脂X-5避光静置24h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为10.5：1。乙酸乙酯为V树脂：V乙酸乙酯＝1:1的洗脱混合液。
实施例7
产红色素的细菌菌株，采用以下方法制备：
(1)菌种的分离：
采集光照弱环境下的干燥土壤，称取10g土样装入仪器中，再加入90mL无菌水，150r/min振荡30min，静置30min后梯度稀释，吸取稀释液200uL，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，28℃恒温培养1-5d；
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉20份，KNO31份，NaCl0.5份，K2HPO4·3H2O0.5份，MgSO4·7H2O0.5份，FeSO4·7H2O0.01份，琼脂18份，蒸馏水1L，pH7.2；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏3份,蛋白胨10份，NaCl5份,琼脂18份，蒸馏水1L,pH7.0；PDA培养基的配方为土豆200份，葡萄糖20份，琼脂18份，蒸馏水1L，pH7.0；
(2)菌种纯化、培养：
挑取步骤(1)中已产红色素菌株在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉20份，KNO31份，NaCl0.5份，K2HPO4·3H2O0.5份，MgSO4·7H2O0.5份，FeSO4·7H2O0.01份，琼脂18份，蒸馏水1L，pH7.2；
(3)种子的制备：
将步骤(2)中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉30g，KNO31.5g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.5g，MgSO4·7H2O2.0g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1L，pH7.2。
利用上述的细菌制备红色素的方法，具体制备步骤如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度27℃、装液量56mL/250mL、接种量9.78％、pH6.15；
发酵培养基的配方为：可溶性淀粉30g，KNO31.5g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O1.5g，MgSO4·7H2O2.0g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1L，pH7.2；
B、发酵液处理：
将发酵液倒入分液漏斗中静置6h，待菌体沉降在分液漏斗底部时将菌体放出，弃上清液；将收集到的菌体移取40mL，10000r/min离心10min，弃上清液，再加入30mL蒸馏水，漩涡振荡1min洗涤菌体，再次10000r/min离心10min收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤(2)中所得的菌体中按固液体积比1:20加入95％乙醇，60℃水浴2h，以10000r/min离心10min，得到红色素粗提液；加入大孔树脂X-5避光静置24h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为10：1，每100mL红色素粗提液加10g大孔树脂，乙酸乙酯为V树脂：V乙酸乙酯＝1:1的混合洗脱液。
菌株红色素的吸光度为0.415，回归模型的预测值为0.3996。
试验一(试验一中所取发酵过程中的各个参数的数值，也可作为实施例来使用)
其它如实施例7中内容所述，其菌种按以下步骤制备：
菌种的鉴定
细菌基本形态特征及生理生化参考东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》和R.E.布坎南,N.E.吉本斯等编著《伯杰细菌鉴定手册》对目的菌株进行形态特征和生理生化的鉴定，该菌株28℃条件下培养48小时，革兰氏染色为阴性，接触酶试验、明胶液化试验、淀粉水解、葡萄糖产酸等试验均为阳性，吲哚试验、V-P试验、甲基红试验、硝酸盐还原、葡萄糖产气、柠檬酸盐利用试验等均为阴性。在高氏一号培养基上，菌落形态较小，呈红色，圆形，低突起，光滑，湿润，易挑起，且在4～37℃都可生长，最适温度在28～30℃。NaCl浓度为2％可生长。结合分子生物学对该菌株进行鉴定，PCR产物送至上海杰李生物科技有限公司测序，基因序列在NCBI上进行Blast比对，采用N-J法构建系统发育树，并在GenBank上登陆注册，登录号为KP250830。鉴定结果为Paenibacillusagaridevorans属，并将其命名PaenibacillusagaridevoransXF-105。
种子制备和发酵的方法
种子液的制备：挑取2环活化后的菌株，接种于种子培养液培养基中，装液量为100mL/250mL，28℃，150rpm条件下培养24h。
发酵：吸取一定量的种子液接种于发酵培养基中，于设定温度，转速下，培养一定时间(具体详见图1-5)。
发酵时间的确定
将种子液按2％(v/v)的量接种到发酵培养基上，置于28℃摇床培养，在起始pH7.0，150r/min条件下，测定不同发酵时间红色素的吸光度，实验结果见下图1。
由图1可知，发酵时间在24-48h期间，红色素的产量随着发酵时间的延长显著增加，在48-54好期间红色产量变化不大，当发酵时间大于54h，红色素产量成递减趋势。原因在于菌体在生长后期会出现自溶不利于代谢产物的积累，且发酵时间会直接影响到生产周期，因此以48h为最适发酵时间。
发酵温度的确定
将种子液按2％(v/v)的量接种到发酵培养基上，分别置于20，24，28，32，36，40℃摇床培养，在起始pH7.0，150r/min条件下，发酵48h后测定红色素的吸光度，实验结果见下图2。
由图2可知，温度在20℃～28℃时，红色素的产量随着温度的升高逐渐增加，当温度高于28℃时，红色素的产量逐渐递减。温度高于36℃后，PaenibacillusagaridevoransXF-105几乎不产红色素。原因在于PaenibacillusagaridevoransXF-105的最适生长温度为28℃～32℃，温度过高可能抑制了该菌株酶的活性，使代谢产生的红色素产量降低，因此初步确定最适发酵温度为28℃。
起始pH的确定
将种子液按2％(v/v)的量接种到发酵培养基中，起始pH值分别为4，5，6，7，8，9，在150r/min，28℃条件下培养，发酵48h后测定红色素的吸光度，实验结果见下图3。
由图3可知，在pH低于4时，该菌株几乎不产红色素，当pH值在4～6时，红色素产量随着pH值的升高而逐渐增加，pH在6～8时，红色素产量逐渐降低。表明该菌株代谢产生的红色素受pH值的影响显著，可能是因为该菌株代谢过程需要的酶的活性对pH敏感，其最适pH值为6左右。
接种量的确定
将种子液分别按2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％(v/v)的量接种到发酵培养基中，在150r/min，起始pH7.0的条件下，发酵48h后测定红色素的吸光度，实验结果见下图4。
由图4可知，接种量在2％～10％时，红色素的产量随着接种量的增加逐渐增加，当接种量大于10％(v/v)时，红色素的产量呈递减趋势。主要是因为接种量较少时，菌体的延迟期较长并不利于代谢产物的积累。而接种量高时，培养基中的营养物质大多用于菌体的生长，红色素的产量反而降低。所以初步确定最适接种量为10％(v/v)。
装液量的确定
将种子液按2％(v/v)的量分别接种到装有20，40，60，80，100，120mL发酵培养基，容积为250mL摇瓶中，在150r/min，起始pH值为7.0，28℃条件下，发酵48h后测定红色素的吸光度，实验结果见下图5。
由图5可知，当装液量在20～60mL时，红色素产量随着装液量逐渐递增，当装液量高于60mL时，红色素产量逐渐降低。主要是因为液体培养基的装液量会影响到培养基中氧溶量，装液量少时，培养基中溶氧量偏高，可能会促进红色素的分解，不利于红色素的积累。装液量较多时，培养基中溶氧量不足从而抑制了红色素的积累。因此最适装液量初步确定为60mL。
细菌红色素的提取与测定：
取40mL发酵培养液在10000r/min下离心10min，收集菌体，菌体经蒸馏水洗涤三次后，加入95％乙醇(v/v)5mL，用漩涡振荡器振荡20s，然后在200W超声波清洗器中振荡30min，将色素提取液再次10000r/min离心10min，弃菌体即得到红色素乙醇溶液。根据朗伯比尔定律，色素乙醇溶液的OD503值与红色素的含量成正比。
Box-Behnken设计及结果
根据单因素实验结果确定因素水平，利用Box-Behnken中心组合实验设计四因素三水平的响应面分析实验，实验设计及结果见表1-3及图6。
表1Box-Behnken设计因素及水平
Table1VariablesandlevelsinBox-Behnkendesign
表2Box-Behnken设计实验及结果
Table2Centralcompositeexperimentaldesignandresults
表3相应面模型的方差分析
Table3Analysisofvarianceandsignificanceoftheresponsesurfacequadraticregressionmodel
注：*表示显著(p<0.05)；**表示极显著(p<0.01)
利用Design-export8.0软件对实验结果进行分析，得到4个因素与红色素乙醇溶液的OD值的回归方程如下：
Y＝0.39-0.042A+3.500E-003B-0.015C-2.583E-003D+4.000E-003AB-0.014AC+5.750E-003A
D-0.012BC-2.000E-003BD-8.000E-003CD-0.078A2-0.017B2-0.032C2-0.012D2
对响应曲面的方差分析，见表3。从表3可以看出，失拟项不显著(p＝0.0749)，回归模型达到了显著水平(p<0.001)，且模型R2＝92.92％，说明方程与实际情况拟合较好。方差分析结果表明，温度以及装液量对红色素的产量都有显著影响，且影响红色素产量的各因素按大小排列为：温度>装液量>起始pH>接种量。
从图6中可以看出，红色素溶液OD值的残差分布几乎处于同一条直线上，说明模型拟合效果较好。
各因素间交互作用对红色素产量的响应面分析
采用design-export8.0软件对实验结果进行分析，分析结果见下图7～图9。
由图7～图9可直观的看到各因素之间的交互情况。对三组图进行比较可知：温度(A)及装液量(C)的曲线较陡且响应值变化较大，即A、C对红色素的产量影响显著，接种量(D)和起始pH(B)对应的曲线较平滑且响应值变化较小，即因素B、D对红色素的产量影响不显著，这与方差分析结果一致。
利用design-export8.0软件对实验结果进行分析，可以确定各因素的最优取值。即发酵条件的最优参数为：温度27℃，pH6.15，装液量为56mL，接种量为9.78％。用此最优参数进行验证试验，试验测得OD值为0.415与理论值0.3996较为接近。
本发明在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面原理设计实验，研究了发酵温度、起始pH、装液量、接种量对红色素产量的影响。实验模型拟合度高、实验误差较小。
目前，天然色素还无法完全取代合成色素，主要原因在于合成色素成本较低、稳定性强、色价高，而且大多数天然色素又存在对光照、温度、金属离子、pH等因素的稳定性较差的技术问题。因此本发明在制备新的天然红色素的研究开发中考虑了红色素的提取成本及稳定性等因素，简化提取及纯化工艺，从而利于红色素的开发利用，又解决了微生物红色素的成本在菌体破壁及色素纯化上高的问题。
SEQIDNo.1
SEQUENCELISTING
<110>四川理工学院
<120>一种产红色素的细菌菌株及制备红色素的方法
<130>2015
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1428
<212>DNA
<213>红色类芽孢杆菌(Paenibacillusagaridevorans)
<400>1
tcatgcagtcgagcggatctgatggagtgcttgcactcctgatggttagcggcggacggg60
tgagtaacacgtaggtaacctgcccgacagaccgggataacattcggaaacgaatgctaa120
taccggatacgcgatttcctcgcatgggggaatcgggaaagacggagcaatctgtcactg180
ttggatggacctgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgat240
gcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcct300
acgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgc360
gtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgctcaggaga420
gtaactgctcctgaggtgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagca480
gccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgca540
ggcggttaattaagtctggtgtttaaggctggggctcaaccccggttcgcactggaaact600
ggttgacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtaga660
gatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctgggctgtaactgacgctgaggcgc720
gaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaat780
gctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgccgaagttaacacattaagcattccgcc840
tggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagt900
ggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctct960
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gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta1080
gttgccagcatttcggatgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggt1140
ggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggc1200
cagtacaacgggaagcgaaaccgcgaggtggagccaatcctatcaaagctggtctcagtt1260
cggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaattgctagtaatcgcggatcagc1320
atgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagttt1380
acaacacccgaagtcggtggggtaacccgcaagggagccagccgccga1428

Claims (10)

1.一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述菌株为从土壤中筛选得到产红色素的细菌XF105，菌种为红色类芽孢杆菌XF-105（PaenibacillusagaridevoransXF-105），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M2014644。
2.根据权利要求1所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述菌株的基因序列如SEQIDNo.1所示。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述菌株采用以下方法制备：
（1）菌种的分离：
采集土壤，称取土样装入仪器中，再加入无菌水，土样与无菌水的质量体积比例为1：8-9，转速140-160r/min振荡25-35min，静置25-35min后梯度稀释，吸取稀释液，分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上，26-29℃恒温培养1-5d；
其中高氏一号固体培养基的配方为：可溶性淀粉19-21份，KNO30.8-1.2份，NaCl0.4-0.6份，K2HPO4·3H2O0.4-0.6份，MgSO4·7H2O0.4-0.6份，FeSO4·7H2O0.008-0.012份，琼脂17-19份，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3；
牛肉膏蛋白胨的配方为牛肉膏2.5-3.5份,蛋白胨9-11份，NaCl4.5-5.5份,琼脂16-19份，蒸馏水0.98-1.2L,pH6.9-7.1；
PDA培养基的配方为土豆198-202份，葡萄糖19-21份，琼脂17-19份，蒸馏水0.98-1.2L，pH6.9-7.1；
（2）菌种纯化、培养：
挑取步骤（1）中已产红色素菌株在纯化培养基上进行纯化，并将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，28℃斜面培养24h后置于4℃条件下保藏；
其中斜面培养基或纯化培养基的配方为：可溶性淀粉19-21份，KNO30.8-1.2份，NaCl0.4-0.6份，K2HPO4·3H2O0.4-0.6份，MgSO4·7H2O0.4-0.6份，FeSO4·7H2O0.008-0.012份，琼脂16-17份，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3；
（3）种子的制备：
将步骤（2）中斜面培养基斜面上的菌株划线接种到高氏一号固体培养基平板上活化，28℃恒温培养24h后挑取一环菌体接种到种子培养基中，28℃,摇床转速为150r/min条件下培养24h，即得；
种子培养基的配方为：可溶性淀粉29-31g，KNO31.3-1.6g，NaCl0.4-0.6g，K2HPO4·3H2O1.2-1.6g，MgSO4·7H2O1.9-2.1g，FeSO4·7H2O0.009-0.012g，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3。
4.根据权利要求3所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述土壤为光照弱环境下的干燥土壤。
5.一种利用权利要求1-3中任一项所述的细菌制备红色素的方法，其特征在于：制备步骤如下：
A、摇瓶发酵：
吸取种子液接种于发酵培养基中，发酵温度20-32℃、发酵时间24-54h，装液量20-100mL/250mL、接种量2-14%、pH4-8；
发酵培养基的配方为：可溶性淀粉29-31g，KNO31.3-1.6g，NaCl0.4-0.6g，K2HPO4·3H2O1.2-1.6g，MgSO4·7H2O1.9-2.1g，FeSO4·7H2O0.009-0.012g，蒸馏水0.98-1.2L，pH7.1-7.3;
B、发酵液处理：
将发酵液倒入仪器中静置5-6.5h，待菌体沉降在仪器底部时收集菌体，移取收集到的菌体在转速10000r/min条件下离心8-12min，去掉上清液，再加入蒸馏水漩涡振荡1min洗涤菌体，菌体与蒸馏水的体积比为4：2.5-3.5，再次10000r/min离心8-12min后收集菌体，待用；
C、色素的提取：
在步骤（2）中所得的菌体中按固液体积比1:18-22加入95%乙醇，58-62℃水浴1.5-2.5h，以10000r/min离心8-12min，得到红色素粗提液；
红色素粗提液中加入大孔树脂X-5避光静置22-25h，以乙酸乙酯洗脱后放置在通风处自然风干即得到红色素初提物，其中红色素粗提液与大孔树脂质量体积比例为9-11：1。
6.根据权利要求5所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述步骤（A）中发酵温度26-32℃、发酵时间36-48h，装液量40-80mL/250mL、接种量6-12%、pH6-8。
7.根据权利要求6所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述步骤（A）中发酵温度27℃、装液量56mL/250mL、接种量9.78%、pH6.15。
8.根据权利要求5所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述菌株红色素的吸光度为0.415，回归模型的预测值为0.3996。
9.根据权利要求5所述的一种产红色素的细菌菌株，其特征在于：所述乙酸乙酯为V树脂：V乙酸乙酯=1:1的洗脱混合液。
10.根据权利要求5所述的方法得到的红色素。
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