CN109880747B - 一种中国被毛孢人工培养物的制备方法 - Google Patents
一种中国被毛孢人工培养物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种中国被毛孢人工培养物的制备方法。通过在冬虫夏草菌（中国被毛孢）的不同培养阶段添加代谢调节剂，干预中国被毛孢的代谢，特别是干预常规培养物与野生冬虫夏草代谢差异物的代谢通路，使人工培养的中国被毛孢菌的代谢物更接近野生冬虫夏草。调节结果显示，代谢调节后的中国被毛孢菌丝代谢物与野生冬虫夏草代谢物聚类在一起，同时其指纹图谱基本一致，表明经过本发明代谢调节的中国被毛孢人工培养物可代替野生冬虫夏草。本发明的中国被毛孢菌丝产品是由室内发酵生产，可工厂化全年生产，不受野生冬虫夏草的高原低温等恶劣环境影响，不破坏生态环境，具有广阔的市场。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的培养制备技术领域，具体涉及一种中国被毛孢菌丝的培养方法。
背景技术
冬虫夏草是我国一种著名的传统中草药，已有千余年的应用历史，与人参、鹿茸齐名。它是冬虫夏草菌与寄生昆虫形成的一种虫菌复合体，包括充满菌丝（菌核）的虫体部分和由头部长出的子实体部分。现代药理研究表明，冬虫夏草能够调节免疫系统、延缓衰老、降血压、调节内分泌、消除疲劳、防治肿瘤、急性或慢性肝炎、肾炎，抑菌、抗病毒等多种药理活性，具有重要的医疗和保健价值。由于天然冬虫夏草生长环境特殊，且易受到外部环境的影响，加之人为的掠夺式采集，使得天然冬虫夏草数量不断减少，目前天然冬虫夏草资源已处于濒临枯竭的状态。为了解决资源枯竭和需求却不断攀升的矛盾，人们努力寻找冬虫夏草的替代品。
目前已有金水宝和百令胶囊等40余种有关冬虫夏草菌丝或发酵物所制得的替代品投放于市场，然而，虽然这些替代品都声称其成分与冬虫夏草接近，但大部分使用的菌种都不是真正的冬虫夏草菌，其所用菌种涉及十余属二十余种，如蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces）、头孢霉（Cephalosporiumsp.）、中国拟青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾柱霉（Scytalidium hepiali）、中国弯颈霉（Tolypocladium sinense）、中国金孢霉（Chrysosporium sinense）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepiali）、圆柱菌（Scytalidiumsp.）等等。随着现代分子生物学的发展并结合其它多种确认手段的应用，目前中国被毛孢（Hirsutella sinensis）已被确认为真正冬虫夏草菌，并已被全世界所公认。
我们研究发现，非冬虫夏草菌所得的菌丝或培养物，其成分与野生冬虫夏草差别很大，即使使用真正冬虫夏草菌（中国被毛孢）的人工培养菌丝或培养物，其成分与野生冬虫夏草也有一定差异。实际上，不仅中国被毛孢的人工培养菌丝或培养物，其成分与野生冬虫夏草有一定差异，野生冬虫夏草的不同部位和不同生长阶段，其成分也不完全一致。
发明内容
为使中国被毛孢人工培养物（菌丝体）与野生冬虫夏草的代谢物一致，实现中国被毛孢人工培养物（菌丝体）可代替野生冬虫夏草，本发明对人工培养的冬虫夏草菌（中国被毛孢）进行了代谢调节，使中国被毛孢人工培养物（菌丝体）的成分与野生冬虫夏草成分一致。本发明旨在，提供一种中国被毛孢人工培养物的制备方法。
一种中国被毛孢人工培养物的制备操作步骤如下：
（1）制备一级固体菌种
将分离纯化的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）斜面菌种接种于平板固体培养基中，每支斜面菌种接2个9cm平板；然后于温度17～20℃，培养20～30天，得到一级固体菌种；
所述固体培养基为马铃薯培养基；
（2）制备二级液体菌种
将一级固体菌种接种于液体培养基中，每个9cm平板菌种接200mL液体培养基；接种后于温度17～20℃、转速160～200转/分钟、振荡培养10～20天，得到二级液体菌种；
（3）制备三级发酵物
将二级液体菌种按5～10%体积比接入发酵罐中，发酵罐的发酵培养基装液量50～70%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度17～20℃条件下，培养5～15天后加入100～500mg/L一号代谢调节剂和50～250mg/L二号代谢调节剂；培养10～20天后加入10～50mg/L三号代谢调节剂；继续培养20～40天，得到三级发酵物；
所述一号调节剂为硫酸锌或氯化锌；
所述二号调节剂为亚油酰甘油磷酸乙醇胺或亚油酰丝氨酸磷酸酯；
所述三号调节剂为植物鞘胺醇或1-磷酸鞘胺醇；
（4）制备中国被毛孢人工培养物
将三级发酵物离心分离、过滤滤出菌丝，温度100℃以下干燥，粉碎，即得中国被毛孢人工培养物，中国被毛孢人工培养物为灰白色粉末；中国被毛孢人工培养物的成分与天然冬虫夏草的成份基本一致，二者具有类似的指纹图谱，其中甘露醇含量大于3.5%、腺苷含量大于0.04%、甾醇含量大于0.3%。。
进一步限定的制备操作技术方案如下：
步骤（1）中，所述固体培养基：由马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、硫酸镁（MgSO4）1.5 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用浓度1.0M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
步骤（2）中，所述液体培养基：由葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
步骤（3）中，所述发酵培养基由葡萄糖15.0～20.0 g、蚕蛹粉20.0～30.0 g、酵母粉15.0～20.0 g、硫酸镁（MgSO4） 0.3～0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5～1.0 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
步骤（4）中，所述离心分离条件：转速5000～10000转/分钟、时间5～15分钟。
步骤（4）中，所述过滤为过50～150目筛。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、本发明的中国被毛孢人工培养物（菌丝体）与野生冬虫夏草的高分辨液质联用指纹图谱基本一致，表明它们成分基本一致，可真正代替野生冬虫夏草。通过代谢组学方法，我们发现了人工培养菌丝体和野生冬虫夏草代谢差异的关键成分及其代谢途径，从而找到了通过代谢调节的方法使人工培养菌丝与野生子实体代谢物更加一致。参见图1和图2，聚类分析表明，代谢调节前人工培养菌丝（图1中四边形点）与野生冬虫夏草（图1中的三角形点）没有聚在一起，表明其代谢物不一致，代谢调节后的人工培养菌丝（图2中的三角形点）与野生冬虫夏草（图2中的四边形点）聚在一起，表明代谢调节后的人工培养菌丝代谢物与野生冬虫夏草一致。作为对照的一种市售冬虫夏草菌培养物产品（图1中五角星）不能与冬虫夏草聚到一起。显然，代谢调节后的中国被毛孢菌丝体更适合作为野生冬虫夏草的替代品。
代谢物比较发现：代谢调节后的中国被毛孢菌丝体与野生冬虫夏草的的甘露醇、核苷、肽类和甾醇类成分都一致，二者指纹图谱的主要成分一致（见图3、4）。
2、本发明的中国被毛孢人工培养物（菌丝体）由室内发酵生产，可工厂化全年生产，不受野生冬虫夏草的高原低温等恶劣环境影响。野生冬虫夏草需要在海拔4000米以上高山生长，不仅环境恶劣，采集困难，并且每年仅有一个多月的采集期。人工培养中国被毛孢，在室内17~20℃培养，不需要极端环境，并且，通过连续接种和发酵，可实现常年生产，每天都有产品，极大提高生产效率。
3、本发明的中国被毛孢人工培养物（菌丝体）生产成本低，每千克成本在100元以下，远低于野生冬虫夏草每公斤数十万元，也远低于冬虫夏草的室内仿生栽培的每公斤数万元成本。
4、采用人工发酵生产中国被毛孢人工培养物（菌丝体）代替野生冬虫夏草，可保护野生冬虫夏草产地生态环境，避免过度采挖导致的资源枯竭和草场退化。
附图说明
图1为代谢调节前的中国被毛孢人工培养物（菌丝体）与野生冬虫夏草及一种市售产品的代谢聚类图。
图2为代谢调节后的中国被毛孢人工培养物（菌丝体）与野生冬虫夏草及一种市售产品的代谢聚类图。
图3为野生冬虫夏草与代谢调节后的中国被毛孢菌丝体代谢物指纹图。
图4为代谢调节后的中国被毛孢菌丝体代谢物指纹图。
图5为实施例1中代谢调节后的中国被毛孢人工培养物代谢物指纹图。
图6为实施例2中代谢调节后的中国被毛孢人工培养物代谢物指纹图。
图7为实施例3中代谢调节后的中国被毛孢人工培养物代谢物指纹图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。
实施例1：
一种中国被毛孢人工培养物的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）。
）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）制备一级固体菌种
将分离纯化的斜面菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中，固体培养基由马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、硫酸镁（MgSO4）1.5 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用浓度1.0M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。放入17℃培养箱，培养时间为20天，得到一级固体菌种；
2.2）制备二级液体摇瓶菌种
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基，液体培养基由葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将1个培养皿的固体菌种接种到200mL液体培养基中，并置于恒温振荡培养箱，温度17℃，160转/分钟的条件下培养10天，得到二级液体菌种；
2.3）制备三级发酵物
将二级液体种子按5%体积比接入1000mL三角瓶中，发酵培养基的装液量为400mL，并置于恒温振荡培养箱，温度17℃，160转/分钟条件下，培养5天后加入100 mg/L一号代谢调节剂和50 mg/L二号代谢调节剂；继续培养10天加入10 mg/L三号代谢调节剂，继续恒温振荡培养20天，得到三级发酵物；
发酵培养基由葡萄糖15.0 g、蚕蛹粉20.0 g、酵母粉15.0 g、硫酸镁（MgSO4）0.3g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成；一号调节剂为硫酸锌，二号调节剂为亚油酰甘油磷酸乙醇胺，三号调节剂为植物鞘胺醇。
）制备中国被毛孢人工培养物
将三级发酵物在转速5000转/分钟条件下离心5分钟，在-40℃条件下将离心得到的菌丝冷冻干燥即得中国被毛孢人工培养物，中国被毛孢人工培养物为灰白色粉末；中国被毛孢人工培养物的高分辨液质联用指纹图谱与野生冬虫夏草的高分辨液质联用指纹图谱基本一致，由图5和图3比较可见，中国被毛孢人工培养物与野生冬虫夏草的液质联用图谱上的峰位（保留时间）和峰强都基本相同，表明中国被毛孢人工培养物的成分种类和含量都与天然冬虫夏草的成份基本一致。中国被毛孢人工培养物仅脂肪酸含量偏低，但脂肪酸不是冬虫夏草的有效成分。
实施例2：
一种中国被毛孢人工培养物的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）制备一级固体菌种
将分离纯化的斜面菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中（培养基为：马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、MgSO4 1.5 g、KH2PO4 3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用1.0M的NaOH调pH到6.5），放入20℃培养箱，培养时间为30天，得到一级固体菌种；
2.2）制备二级液体摇瓶种子
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基，在1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5，得到液体培养基；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将1个培养皿的一级固体菌种接种到200mL液体培养基中，并置于恒温振荡培养箱，温度20℃，180转/分钟的条件下培养20天，得到二级液体菌种；
2.3）制备三级发酵物
将二级液体菌种按10%体积比接入发酵罐中，发酵罐的发酵培养基装液量为罐容积的50%；每升发酵培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.0 g，pH值为6.5。通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度20℃培养15天后加入500mg/L一号代谢调节剂和250mg/L二号代谢调节剂；继续培养20天加入50mg/L三号代谢调节剂。一号调节剂为氯化锌。二号调节剂为亚油酰丝氨酸磷酸酯。三号调节剂为1-磷酸鞘胺醇。
）制备中国被毛孢人工培养物
将发酵罐的三级发酵物恒温振荡培养40天后，10000转/分钟离心15分钟，在100℃条件下将离心得到的菌丝鼓风干燥即得代谢调节后的中国被毛孢菌丝体。该菌丝的高分辨液质联用指纹图谱与野生冬虫夏草基本一致，由图6和图3比较可见，中国被毛孢人工培养物与野生冬虫夏草的液质联用图谱上的峰位（保留时间）和峰强都基本相同，表明中国被毛孢人工培养物的成分种类和含量都与天然冬虫夏草的成份基本一致。仅脂肪酸含量偏低，但脂肪酸不是冬虫夏草的有效成分。
实施例3：
一种中国被毛孢人工培养物的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）制备一级固体菌种
将分离纯化的斜面菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中，固体培养基为：马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、MgSO4 1.5g、KH2PO4 3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用1.0M的NaOH调pH到6.5；放入18.5℃培养箱，培养时间为25天，得到一级固体菌种；
2.2）制备二级液体摇瓶种子
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基；每1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将1个培养皿的一级固体菌种接种到200mL液体培养基中，并置于恒温振荡培养箱，温度18.5℃、180转/分钟的条件下培养15天，得到二级液体菌种；
2.3）制备三级发酵物
将二级液体菌种按8%体积比接入发酵罐中；发酵罐的发酵培养基装液量为罐容积的60%；每升发酵培养基中含葡萄糖17.5 g、蚕蛹粉25.0 g、酵母粉17.5 g、MgSO4 0.4g、KH2PO4 0.75 g，pH值为6.5。通气量按体积比1:1（v/v）、压力0.1MP、温度18.5℃条件下培养7天加入300 mg/L一号代谢调节剂和150 mg/L二号代谢调节剂；继续培养15天加入30mg/L三号代谢调节剂。一号调节剂为氯化锌。二号调节剂为亚油酰丝氨酸磷酸酯。三号调节剂为1-磷酸鞘胺醇。
）制备中国被毛孢人工培养物
将发酵罐的三级发酵物恒温振荡培养30天后，过75目筛滤出菌丝，在-40℃条件下将菌丝冷冻干燥即得代谢调节后的中国被毛孢菌丝体。该菌丝的高分辨液质联用指纹图谱与野生冬虫夏草基本一致，由图7和图3比较可见，中国被毛孢人工培养物与野生冬虫夏草的液质联用图谱上的峰位（保留时间）和峰强都基本相同，表明中国被毛孢人工培养物的成分种类和含量都与天然冬虫夏草的成份基本一致。
Claims (6)
1.一种中国被毛孢人工培养物的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）制备一级固体菌种
将分离纯化的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）斜面菌种接种于平板固体培养基中，每支斜面菌种接2个9cm平板；然后于温度17～20℃，培养20～30天，得到一级固体菌种；
所述固体培养基为马铃薯培养基；
（2）制备二级液体菌种
将一级固体菌种接种于液体培养基中，每个9cm平板菌种接200mL液体培养基；接种后于温度17～20℃、转速180转/分钟、振荡培养10～20天，得到二级液体菌种；
（3）制备三级发酵物
将二级液体菌种按5～10%体积比接入发酵罐中，发酵罐的发酵培养基装液量50～70%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度17～20℃条件下，培养5～15天后加入100～500mg/L一号代谢调节剂和50～250mg/L二号代谢调节剂；培养10～20天后加入10～50mg/L三号代谢调节剂；继续培养20～40天，得到三级发酵物；
所述一号调节剂为硫酸锌或氯化锌；
所述二号调节剂为亚油酰甘油磷酸乙醇胺或亚油酰丝氨酸磷酸酯；
所述三号调节剂为植物鞘胺醇或1-磷酸鞘胺醇；
（4）中国被毛孢人工培养物制备
将三级发酵物离心分离、过滤滤出菌丝，温度100℃以下干燥，粉碎，即得中国被毛孢人工培养物，中国被毛孢人工培养物为灰白色粉末，其中甘露醇含量大于3.5%、腺苷含量大于0.04%、甾醇含量大于0.3%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述固体培养基：由马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、硫酸镁（MgSO4）1.5 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用浓度1.0M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述液体培养基：由葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述发酵培养基由葡萄糖15.0～20.0 g、蚕蛹粉20.0～30.0 g、酵母粉15.0～20.0 g、硫酸镁（MgSO4） 0.3～0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5～1.0 g充分混合，加水补至1000mL，并用浓度1.0 M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5制成。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述离心分离条件：转速5000～10000转/分钟、时间5～15分钟。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述过滤为过50～150目筛。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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