CN105886412B - 一种冬虫夏草菌的液体发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种冬虫夏草菌的液体发酵培养基，该培养基除了含有常规培养基中的碳源、氮源、金属盐等物质之外，添加磷酸胆碱、磷酸乙醇胺以及胆固醇、脂肪酸等物质作为生长促进剂，可有效促进冬虫夏草菌形成芽生孢子或菌丝段，经本发明培养基发酵获得的菌悬液富含芽生孢子或菌丝段生长点，可继续发酵或作为种子液用于后续液体或固体发酵，有助于冬虫夏草菌的发酵生产效率提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的培养基，特别是涉及一种冬虫夏草菌的液体发酵培养基。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是我国青藏高原的一种特色名贵药材，分布于青藏高原高海拔区域，其生长范围局限，产量也极为有限，具有重要的药用和经济价值。其性味甘平，具有保肺益肾、止血化痰、已唠嗽之功效。现代医学研究过程发现，冬虫夏草还具有抑制肿瘤、抗癌和显著提高人体免疫功能等独特功效。
作为一种虫生子囊真菌，冬虫夏草的生活史包括有性阶段和无性阶段两个部分。形态学研究和分子鉴定均证实中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是冬虫夏草的无性型，冬虫夏草菌专性寄生于栖息在青藏高原高寒草甸土壤中的钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的幼虫内完成有性阶段。
近年来，青藏高原的冬虫夏草已无法满足国内外迅猛增长的市场需求，资源面临枯竭的风险。通过发酵培养冬虫夏草菌的无性型中国被毛孢菌丝可以作为一种冬虫夏草的替代物作为保健食品或药品。目前已公开的冬虫夏草菌发酵技术存在着发酵效率不高，产物收率低等特点。根据现有公知的微生物液体发酵特点，在培养基中的冬虫夏草菌的生长点越多，发酵的生长效率就越高。冬虫夏草菌是一种虫生真菌，在液体发酵培养基中可形成单细胞的芽生孢子，又称菌丝段，芽生孢子或菌丝段以酵母状出芽生殖的方式增殖，可指数级增加冬虫夏草菌发酵菌悬液中的生长点。冬虫夏草现有的冬虫夏草菌发酵技术方案“冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法”(专利号：ZL200510104832.9)中提到，利用机械外力破碎可以增加冬虫夏草菌的生长点，从而提高发酵的效率，但机械外力的破碎方案往往会损伤大量细胞，且破碎效果有限，需要在发酵装置中增加破碎装备，从而增加了潜在的污染源，因此工艺流程繁琐；另一技术方案“冬虫夏草菌的固体发酵法”(专利号：ZL200910197957.9)提到液体培养的种子液具有生长点较多的特点，但未提到如何促进发酵培养基中的生长点数量的提高。因此，提供一种能促进冬虫夏草菌中国被毛孢增加芽生孢子(或称菌丝段)生长点的培养基配方，将有利于冬虫夏草发酵产业 效率的提高，促进冬虫夏草资源的可持续利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效促进冬虫夏草菌中国被毛孢形成芽生孢子或菌丝段生长点液体发酵培养基配方，该配方为：在常规含有碳源、氮源和微量元素的培养基中，加入磷酸胆碱或磷酸乙醇胺中的一种或两种，可以有效促进冬虫夏草菌中国被毛孢形成芽生孢子出芽生殖。
同时，在上述培养基中加入胆固醇、软脂酸、油酸、亚油酸可以更有效地促进中国被毛孢形成芽生孢子出芽生殖。其中，软脂酸、油酸、亚油酸可以由花生油单独替代或由玉米油与橄榄油的混合油替代。
在配制冬虫夏草液体发酵培养基时，在基础培养基中添加的磷酸胆碱含量为10～30mmol/L，磷酸乙醇胺的含量为12～35mmol/L。加入的胆固醇含量为15～32mmol/L、软脂酸的含量为1～4mmol/L，油酸的含量2～8mmol/L，亚油酸的含量为2～8mmol/L。其中加入的“软脂酸、油酸、亚油酸”三种化合物整体可以由1～6g/L的花生油，或1～6g/L体积比为2～10∶1～2的玉米油∶橄榄油来代替。
本发明所述的菌株是冬虫夏草菌的无性型中国被毛孢，可以从新鲜冬虫夏草常规微生物方法分离获得或从市售获得。
通常地，冬虫夏草菌的液体发酵培养基中含有15～35g的糖和15～45g的蛋白。其中糖可以由蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或多种组成，优化地由质量比为4～6∶0～2的海藻糖∶葡萄糖组成；所述的蛋白可以由蛋白胨、水解乳蛋白、酵母提取物、牛肉膏等常规蛋白氮源中的一种或多种组成，优化地由蛋白胨或水解乳蛋白∶酵母提取物质量体积比为1～3∶1～2组成。通常地，培养基中含有1g/L的磷酸二氢钾和0.5g/L的硫酸镁，调节pH值为6.5～7。
在本发明的培养基中接种中国被毛孢菌种，在15～18℃的环境中摇瓶或发酵罐中通气培养15～30天，既得富含芽生孢子及菌丝段的菌悬液。菌悬液可以在原培养基中继续发酵或作为发酵种子液用于后续液体或固体培养基发酵。
附图说明
图1是本发明培养基所制备的冬虫夏草菌中国被毛孢芽生孢子的低倍镜检图；
图2是本发明培养基所制备的冬虫夏草菌中国被毛孢芽生孢子出芽生殖的镜检高倍图。
具体实施方式
实施例一
阴性对照液体发酵培养基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加18mmol/L的磷酸胆碱。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床15℃培养20天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为1.2-1.5×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.3-0.5×103个/mL。
实施例二
阴性对照液体发酵培养基由20g/L海藻糖，0.5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加25mmol/L的磷酸乙醇胺。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床18℃培养15天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为1.3-1.4×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.2～0.4×103个/mL。
实施例三
阴性对照液体发酵培养基由25g/L海藻糖，10g/L葡萄糖，35g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加10mmol/L的磷酸胆碱和35mmol/L的磷酸乙醇胺。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床16℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为2.8-3.0×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.7-0.8×103个/mL。
实施例四
阴性对照液体发酵培养基由15g/L蔗糖，25g/L蛋白胨，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加30mmol/L的磷酸胆碱和12mmol/L的磷酸乙醇胺。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床18℃培养15天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为1.2-1.4×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.1-0.2×103个/mL。
实施例五
阴性对照液体发酵培养基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加10mmol/L的磷酸胆碱，12mmol/L的磷酸乙醇胺，15mmol/L的胆固醇，1mmol/L的软脂酸，2mmol/L的油酸和2mmol/L的亚油酸。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床17℃培养20天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为3.2-3.8×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.5-0.7×103个/mL。
实施例六
阴性对照液体发酵培养基由30g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g/L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加32mmol/L的磷酸胆碱，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，4mmol/L的软脂酸，8mmol/L的油酸和8mmol/L的亚油酸。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床16℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为6.8-7.2×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.6-0.8×103个/mL。
实施例七
阴性对照液体发酵培养基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加22mmol/L的磷酸胆碱，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，2mmol/L的软脂酸，4mmol/L的油酸和4mmol/L的亚油酸。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床17.5℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为8.2-9.3×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.8-1.0×103个/mL。
实施例八
阴性对照液体发酵培养基由10g/L海藻糖，5g葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加10mmol/L的磷酸胆碱，12mmol/L的磷酸乙醇胺，15mmol/L的胆固醇，1g/L花生油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床17℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为2.8-3.2×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.5-0.7×103个/mL。
实施例九
阴性对照液体发酵培养基由30g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g/L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加32mmol/L的磷酸胆碱，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，6g/L的花生油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床16℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为4.8-5.0×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.8-1.0×103个/mL。
实施例十
阴性对照液体发酵培养基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加22mmol/L的磷酸胆碱，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，2.5g/L的花生油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床17℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为6.2-6.5×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.6-0.8×103个/mL。
实施例十一
阴性对照液体发酵培养基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加10mmol/L的磷酸胆碱，12mmol/L的磷酸乙醇胺，15mmol/L的胆固醇，0.5g/L玉米油和0.5g/L的橄榄油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床17℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为3.0-3.3×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.5-0.7×103个/mL。
实施例十二
阴性对照液体发酵培养基由30g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g/L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加32mmol/L的磷酸胆碱，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，5.45g/L玉米油和0.545g/L的橄榄油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床15℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为4.6-4.9×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.8-1.0×103个 /mL。
实施例十三
阴性对照液体发酵培养基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸镁和1g/L磷酸二氢钾组成；本发明的液体发酵培养基在上述配方的基础上添加22mmol/L的磷酸胆碱，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的胆固醇，2g/L玉米油和0.66g/L的橄榄油。分别在两组培养基中接种冬虫夏草菌种(中国被毛孢)，120rpm摇床15℃培养30天后，取出发酵液镜检，用细胞计数法进行统计，镜检可见液体培养液中的芽生孢子(或称菌丝段)，统计结果本发明的液体发酵培养基中的芽生孢子浓度为6.1-6.3×103个/mL，而阴性对照培养基中只有0.6-0.8×103个/mL。
Claims (4)
1.一种冬虫夏草菌的液体发酵培养基，其特征在于培养基含有含量为10～30mmol/L的磷酸胆碱和含量为12～35mmol/L的磷酸乙醇胺中的一种或两种。
2.如权利要求1所述的液体发酵培养基，其特征是培养基中还含有胆固醇、软脂酸、油酸和亚油酸；所述的胆固醇含量为15～32mmol/L，软脂酸的含量为1～4mmol/L，油酸的含量为2～8mmol/L，亚油酸的含量为2～8mmol/L。
3.如权利要求2所述的液体发酵培养基，其特征是所述的“软脂酸、油酸和亚油酸”三种化合物整体由含量为1～6g/L的花生油单独替代，或由含量为1～6g/L，体积比为2～10∶1～2的玉米油与橄榄油的混合油替代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的液体发酵培养基，其特征是培养基中还含有15～35g/L的质量比为4～6∶0～2的海藻糖∶葡萄糖和15～45g/L的蛋白胨或水解乳蛋白∶酵母提取物质量比为1～3∶1～2。
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