CN109731015B - 一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂及制备方法。一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂为白色干燥粉末，主要成分为糖类、氨基酸及其衍生物和核苷类化合物，具有免疫增强作用，可提高人体免疫，具有广阔的市场。本发明通过添加代谢诱导物等方法，优化中国被毛孢菌的培养，使培养物中免疫活性物质增加；通过提取和色谱分离制备工艺优化，得到中国被毛孢菌发酵物中免疫活性物质的最佳提取工艺。本发明免疫活性物质主要是从中国被毛孢培养液中得到，而作为副产物的中国被毛孢丝体还可代替野生冬虫夏草加工相关保健品，一举两得。本发明由室内发酵生产，可工厂化全年生产，不受野生冬虫夏草的高原低温等恶劣环境影响，不破坏生态环境。
Description
技术领域
本发明属于生物制品及制备技术领域，具体涉及基于中国被毛孢菌的免疫增强剂及制备方法。
背景技术
冬虫夏草是我国一种著名的传统中草药，已有千余年的应用历史，与人参、鹿茸齐名。它是冬虫夏草菌与寄生昆虫形成的一种虫菌复合体，包括充满菌丝（菌核）的虫体部分和由头部长出的子实体部分。现代药理研究表明，冬虫夏草能够调节免疫、延缓衰老、降血压、调节内分泌、消除疲劳，防治肿瘤、急性或慢性肝炎、肾炎，抑菌和抗病毒等多种药理活性，具有重要的医疗和保健价值。由于天然冬虫夏草生长环境特殊，且易受到外部环境的影响，加之人为的掠夺式采集，使得天然冬虫夏草数量不断减少，目前天然冬虫夏草资源已处于濒临枯竭的状态。为了解决资源枯竭和需求却不断攀升的矛盾，人们努力寻找冬虫夏草的替代品。目前越来越多的野生冬虫夏草产品是由真正冬虫夏草菌——中国被毛孢（Hirsutella sinensis）培养物所代替。
研究表明中国被毛孢培养物同样具有免疫调节作用，但到目前尚无有关中国被毛孢中具有免疫增强活性的成分提取制备的研究报道。免疫调节剂是通过调节人体免疫达到防病和治病作用，是中药中扶正祛邪的重要物质基础，因此有必要深入研究和开发。本发明前期研究通过改进中国被毛孢培养方法，可使免疫活性物质含量增加，通过进一步用活性指导下的分离方法，发现组分3和7组具有较强免疫增强作用，并对该活性组分进行了提取方法优化，得到最佳提取和制备工艺。
发明内容
本发明旨在，提供一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂，同时，提供一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂的制备方法。
一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂为白色干燥粉末；其中糖类含量为5～50%、氨基酸及其衍生物含量为3～30%、核苷类含量为1～10%。
一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂的制备操作步骤如下：
（1）制备一级固体菌种
将分离纯化的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）斜面菌种接种于平板固体培养基，接种量为每支斜面接种2个9cm平皿；温度17～20℃、培养20～30天，得到一级固体菌种；
（2）制备二级液体菌种
将一级固体菌种接种于液体培养基中，接种量为每100mL液体培养基接种1平皿一级固体菌种；振荡培养：温度17～20℃、转速160～200转/分钟；培养10～20天，得到二级液体菌种；
（3）制备三级液体菌种
将二级液体菌种按5～20%体积比接入发酵系统的种子罐中，发酵罐的液体培养基装液量50～70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，在温度17～20℃条件下，培养5～15天，得到三级液体菌种；
所述液体培养基配方与二级液体菌种所用的液体培养基相同；
（4）制备发酵液
将三级液体菌种按5～10%体积比接入发酵系统的发酵罐中，发酵罐装液量50～70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，在温度17～20℃条件下，培养5～30天加入100～1000mg/L一号添加剂；继续培养10～40天加入1.0～100.0 mg/L二号添加剂剂，继续培养20～40天；得到发酵液；
所述发酵培养基和液体培养基配方相同；
所述一号添加剂：由硫酸锌：植物鞘胺醇：甘露糖按重量比0.1～0.9：0.01～0.2：0.1～0.5配制得到；
所述二号添加剂：由双氧水（H2O2）：亚硝基二磺酸钾（K2NO(SO3)2）按重量比0.01～0.8：0.5～0.01配制得到；
（5）制备中国被毛孢免疫增强剂
将发酵液加热至50.0～99.9℃、保持5～20分钟；冷却至室温，加入发酵液体积0.1～2.0倍的乙醇，温度0～20℃、静置1～24小时；离心分离取上清或过滤取滤液；将上清或滤液浓缩到原体积的1/10～1/2，过反相碳18色谱柱，用0～90%乙醇洗脱，收集进样后2～50分钟的洗脱物，脱去洗脱物中的溶剂，回收乙醇，即得中国被毛孢免疫增强剂。
进一步限定的制备操作技术方案如下：
步骤（1）中，所述固体培养基：马铃薯煮汁200g、葡萄糖20g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、酵母粉10g、硫酸镁（MgSO4）1.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3g、琼脂20g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH到6.5。
步骤（2）和（3）中，所述液体培养基：葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5。
步骤（3）中，所述发酵培养基：葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5。
步骤（4）中，所述发酵培养基：葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5。
步骤（5）中，将上清或滤液，在压力0.0001～0.01Mpa减压浓缩到原体积的1/10～1/2。
步骤（5）中，所述离心分离：转速5000～10000转/分钟、分离5～15分钟。
步骤（5）中，所述过滤：过50～200目筛。
步骤（5）中，过反相碳18色谱柱的流动相为0～90%乙醇。
本发明通过优化中国被毛孢的培养方法，使培养物中免疫活性物质增加；通过提取和分离制备工艺优化，得到中国被毛孢中免疫活性物质的最佳提取工艺。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明前期研究发现中国被毛孢液体发酵菌丝的水提取物能明显提高小鼠巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的转录水平，表明它们具有免疫增强作用。通过培养方法改进，可增加中国被毛孢中免疫活性物质含量的提高。本发明用中国被毛孢菌培养物生产免疫增强剂，在得到免疫增强剂的同时还能得到中国被毛孢丝体；基于中国被毛孢菌的免疫增强剂可提高人体免疫，中国被毛孢丝体可代替野生冬虫夏草加工相关保健品，一举两得，经济效益高。
2.本发明前期研究通过改进中国被毛孢培养方法，可使免疫活性物质含量增加，通过进一步用活性指导下的分离方法，发现组分3和7（图略）具有较强免疫增强作用，并对该活性组分进行了提取方法优化，得到最佳提取和制备工艺。本发明的中国被毛孢菌免疫增强剂是由室内发酵生产，可工厂化全年生产，不受野生冬虫夏草的高原低温等恶劣环境影响。
本发明通过代谢组学（metabolomics）的方法比较不同培养的代谢组差异，首次发现硫酸锌、植物鞘胺醇、甘露糖、双氧水和亚硝基二磺酸钾等能明显改善中国被毛孢菌的代谢，使具有免疫增强作用的代谢物明显增加。通过提取和分离工艺优化，首次制备出小分子免疫调节剂。
3.本发明基于中国被毛孢菌的免疫增强剂是中国被毛孢中的天然成分，冬虫夏草及中国被毛孢菌在我国已被广泛用于保健食品，因此相关产品安全性高。采用人工发酵中国被毛孢菌生产免疫增强剂，而不用野生冬虫夏草，可保护野生冬虫夏草产地生态环境，避免过度采挖导致的资源枯竭和草场退化。目前世界免疫低下人群日益增多，包括大量免疫低下老年人，以及由于环境污染和工作压力大等原因导致的免疫低下人群，因此相关免疫增强剂具有广阔的市场。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1
一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）一级固体菌种制备
将分离纯化的斜面菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中，培养基为：马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、MgSO4 1.5 g、KH2PO4 3.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用1.0M的NaOH调pH到6.5；放入17℃培养箱，培养时间为20天，得到一级固体菌种。
）二级液体种子培养
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基；每1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将2个培养皿的固体菌种接种到500mL三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度17℃、160转/分钟的条件下培养10天，得到二级液体菌种。
）三级液体菌种培养
在1000mL三角瓶中装入400ml液体培养基；每1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将二级液体种子按5%比例接种到冷却的液体培养基中，温度17℃、160转/分钟的条件下培养10天，得到三级液体菌种。
）四级发酵和代谢调节
将三级液体菌种按5%体积比接入发酵罐中，发酵罐装液量50%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度17℃条件下，培养5天加入100 mg/L一号添加剂；继续培养10天加入1.0 mg/L二号添加剂剂，得到发酵物。
一号添加剂配方的重量比为 硫酸锌：植物鞘胺醇：甘露糖=0.1：0.01：0.1。二号添加剂配方的重量比为H2O2：K2NO(SO3)2=0.01：0.5。
）发酵物收获
将所述发酵物在通气量按体积比1:1（v/v）、压力0.1MP、温度17℃条件下，继续培养20天，加热到50.0℃保持5分钟；冷却后加发酵物体积的0.1倍体积的乙醇，0℃静置1小时；然后5000转/分钟离心5分钟，或过50目筛过滤；上清或滤液浓缩到原体积的1/10，然后过反相碳18色谱柱，流动相为0%乙醇，收集进样后2分钟的洗脱物，0.0001Mpa减压脱去溶剂，即得中国被毛孢中免疫增强剂。成分分析表明该免疫增强剂含糖类5%、氨基酸及其衍生物3%、核苷类1%。在得到免疫增强剂的同时，离心沉淀或过滤出的菌丝还可代替冬虫夏草加工相关保健品。
实施例2
一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）一级固体菌种制备
将分离纯化的菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中，培养基为：马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、MgSO4 1.5 g、KH2PO43.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用1.0M的NaOH调pH到6.5；放入20℃培养箱，培养时间为30天，得到一级固体菌种。
）二级液体摇瓶种子培养
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基，在1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5，得到液体培养基；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将2个培养皿的固体菌种接种到500mL三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度20℃、200转/分钟的条件下培养20天，得到二级液体菌种。
）制备三级液体菌种
将二级液体菌种按5%体积比接入发酵系统的种子罐中，发酵罐的液体培养基装液量为70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度20℃条件下，培养5天，得到三级液体菌种；
所述液体培养基配方与二级液体菌种所用的液体培养基相同。
）四级发酵和代谢调节
将三级液体菌种按10%体积比接入发酵系统的发酵罐中，发酵培养基的装液量70%，每升发酵培养基中含葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、MgSO4 0.5g、KH2PO41g，pH值为6.5。通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度20℃条件下，培养30天加入1000mg/L一号添加剂；继续培养40天，加入100.0 mg/L二号添加剂剂，继续培养40天，得到发酵物；
一号添加剂配方的重量比为 硫酸锌：植物鞘胺醇：甘露糖=0.9：0.2：0.5。二号添加剂配方的重量比为H2O2：K2NO(SO3)2=0.8：0.01。
）发酵物收获
将发酵物加热到99.9℃保持20分钟；冷却，加入发酵物体积的2.0倍体积的乙醇，20℃静置24小时；然后10000转/分钟离心15分钟，或过200目筛过滤；上清或滤液浓缩到原体积的1/2，然后过反相碳18色谱柱，流动相为90%乙醇，收集进样后50分钟的洗脱物，0.01Mpa脱去溶剂，即得中国被毛孢中免疫增强剂。成分分析表明该免疫增强剂含糖类50%、氨基酸及其衍生物30%、核苷类10%。在得到免疫增强剂的同时，离心沉淀或过滤出的菌丝还可代替冬虫夏草加工相关保健品。
实施例3
一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂的制备操作步骤如下：
1）菌种选择
从青海采集的冬虫夏草〔Ophiocordyceps sinensis〕 子座上分离出的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）；
2）菌株培养
培养方法为液固混合培养，具体工序如下：
2.1）一级固体菌种制备
将分离纯化的菌种接种于9 cm培养皿的固体培养基中（培养基为：马铃薯200.0 g煮汁、葡萄糖20.0 g、麦芽糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉10.0 g、MgSO4 1.5 g、KH2PO43.0 g、琼脂20.0 g、加水至1.0 L，用1.0M的NaOH调pH到6.5），放入18.5℃培养箱，培养时间为25天，得到一级固体菌种。
）二级液体摇瓶种子培养
在500mL三角瓶中装入200ml液体培养基，在1000mL培养基中含葡萄糖20.0 g、蚕蛹粉30.0 g、酵母粉20.0 g、MgSO4 0.5g、KH2PO41.0 g，各组分混合后加水补至1000mL，并用1.0 M的NaOH调pH值为6.5，得到液体培养基；用1.2 Kg/cm2高压灭菌30分钟，待冷却至室温时，将2个培养皿的固体菌种接种到500mL三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度18.5℃、180转/分钟的条件下培养15天，得到二级液体菌种。
）制备三级液体菌种
将二级液体菌种按5%体积比接入发酵系统的种子罐中，发酵罐的液体培养基装液量为70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP；培养温度为20℃，培养15天，得到三级液体菌种；
所述液体培养基配方与二级液体菌种所用的液体培养基相同。
2.4）四级发酵和代谢调节
将三级液体菌种按10%体积比接入发酵系统的发酵罐中，发酵培养基的装液量60%，每升发酵培养基中含葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、MgSO4 0.5g、KH2PO41g，pH值为6.5。通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，温度20℃条件下，培养30天加入500mg/L一号添加剂；继续培养40天加入50.0 mg/L二号添加剂剂；继续培养30天，得到发酵物。
一号添加剂配方的重量比为 硫酸锌：植物鞘胺醇：甘露糖=0.5：0.1：0.3。二号添加剂配方的重量比为H2O2：K2NO(SO3)2=0.4：0.2。
）发酵物收获
将所述发酵物加热到80.0℃保持10分钟；冷却，加入发酵物体积的1.0倍体积的乙醇，10℃静置12小时；然后7500转/分钟离心10分钟，或过100目筛过滤；上清或滤液浓缩到原体积的1/5，然后过反相碳18色谱柱，流动相为45%乙醇，收集进样后30分钟的洗脱物，0.001Mpa脱去溶剂，即得中国被毛孢中免疫增强剂。成分分析表明该免疫增强剂含糖类30%、氨基酸及其衍生物15%、核苷类5%。在得到免疫增强剂的同时，离心沉淀或过滤出的菌丝还可代替冬虫夏草加工相关保健品。
Claims (8)
1.一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂为白色干燥粉末；其中糖类含量为5～50%、氨基酸及其衍生物含量为3～30%、核苷类含量为1～10%；
免疫增强剂的制备操作步骤如下：
（1）制备一级固体菌种
将分离纯化的中国被毛孢（Hirsutella sinensis）斜面菌种接种于平板固体培养基，接种量为每支斜面接种2个9cm平皿；温度17～20℃、培养20～30天，得到一级固体菌种；
（2）制备二级液体菌种
将一级固体菌种接种于液体培养基中，接种量为每100mL液体培养基接种1平皿一级固体菌种；振荡培养：温度17～20℃、转速160～200转/分钟；培养10～20天，得到二级液体菌种；
（3）制备三级液体菌种
将二级液体菌种按5～20%体积比接入发酵系统的种子罐中，发酵罐的液体培养基装液量50～70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，在温度17～20℃条件下，培养5～15天，得到三级液体菌种；
所述液体培养基配方与二级液体菌种所用的液体培养基相同；
（4）制备发酵液
将三级液体菌种按5～10%体积比接入发酵系统的发酵罐中，发酵罐装液量50～70%；通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1MP，在温度17～20℃条件下，培养5～30天后加入100～1000mg/L一号添加剂；继续培养10～40天加入1.0～100.0 mg/L二号添加剂，继续培养20～40天；得到发酵液；
发酵培养基和液体培养基配方相同；
所述一号添加剂：由硫酸锌：植物鞘胺醇：甘露糖按重量比0.1～0.9：0.01～0.2：0.1～0.5配制得到；
所述二号添加剂：由双氧水（H2O2）：亚硝基二磺酸钾（K2NO(SO3)2）按重量比0.01～0.8：0.5～0.01配制得到；
（5）制备中国被毛孢免疫增强剂
将发酵液加热至50.0～99.9℃、保持5～20分钟；冷却至室温，加入发酵液体积0.1～2.0倍的乙醇，温度0～20℃、静置1～24小时；离心分离取上清或过滤取滤液；将上清或滤液浓缩到原体积的1/10～1/2，过反相碳18色谱柱，用0～90%乙醇洗脱，收集进样后2～50分钟的洗脱物，脱去洗脱物中的溶剂，回收乙醇，即得中国被毛孢免疫增强剂。
2.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（1）中，所述固体培养基：马铃薯煮汁200g、葡萄糖20g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、酵母粉10g、硫酸镁（MgSO4）1.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3g、琼脂20g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH到6.5。
3.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（2）和（3）中，所述液体培养基：葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5。
4.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（4）中，所述发酵培养基：葡萄糖20g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1g、加水至1L，用浓度1M的氢氧化钠（NaOH）调pH值为6.5。
5.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（5）中，将上清或滤液，在压力0.0001～0.01Mpa减压浓缩到原体积的1/10～1/2。
6.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（5）中，所述离心分离：转速5000～10000转/分钟、分离5～15分钟。
7.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（5）中，所述过滤：过50～200目筛。
8.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：在制备步骤（5）中，过反相碳18色谱柱的流动相为0～90%乙醇。
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| 5种发酵虫草制剂中核苷及碱基成分的分析;张萍 等;《药物分析杂志》;20091231;第29卷(第6期);第889-893页 * |
| 中国被毛孢发酵液的活性成分分析及清除自由基和抗白色假丝酵母活性的研究;丁婷 等;《菌物学报》;20071231;第26卷(第3期);第404-413页 * |
| 发酵虫草菌粉类产品质量标准研究进展;吴瑶 等;《中国实验方剂学杂志》;20171031;第23卷(第20期);第220-227页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109731015A (zh) | 2019-05-10 |
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