CN109055456B - 一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于藻类技术领域，公开了一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其包括如下步骤：步骤1）小球藻前培养，步骤2）小球藻后培养，步骤3）分离粗藻多糖，步骤4）纯化。本发明工艺提高了藻多糖的提取率和纯度。

Description

一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺

技术领域

本发明属于藻类技术领域，具体涉及一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺。

背景技术

微藻类是能够通过光合作用自发生长的自养性光合微生物。微藻类在海洋水介质中和淡水或微咸水中以及多种陆地栖息地中生长。在淡水或海洋中发现的大部分微藻类物种一般是自养性的，即它们只能通过光合作用来生长。对于这些物种来说，其环境中存在有机含碳基质或有机物质是不利的，且不促进生长。但是，发现某些微藻类物种不是严格自养性的。因此，这些物种中是异养性的一些物种能够在完全不存在光下通过发酵(即通过使用有机物质)进行生长。光合作用对于生长来说仍然是必不可少的其它微藻类物种能够从光合作用和微藻类环境中存在的有机物质获得双重益处。这些中间物种据说是兼养的，并且在光与有机物质存在下都可以培养。

多糖是广泛存在于动植物和微生物中由单糖组成的天然高分子化合物。一般而言，根据来源不同，自然界中的多糖可分为动物多糖、 植物多糖以及微生物多糖等。近年来， 随着多糖的各种功能如抗肿瘤、 抗癌等开始被研究发现，对多糖进行的研究也进行得越来越频繁。目前藻类功能性多糖的研究引起人们的高度关注。

小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞藻类，直径3～8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻借助阳光、水和二氧化碳，以每隔20小时分裂出4个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增殖中释放出大量的氧气；而它的光合能力高于其他植物10倍以上。小球藻不仅可以作为水生经济动物的优秀天然饵料，同时还可以吸收水中的氮、磷等元素，降低水体的富营养化水平，净化水质。

小球藻中富含多糖类成分，生物活性研究实验表明其具有多种生物学活性及药用价值，如降血脂、 抗血栓、 降血糖抗炎、 抗疲劳、 增强免疫、 抑制肿瘤生长等作用。因此在保健品和医药中具有广阔应用价值，成为人们研究的重点。中国专利“CN105713837A” 提供了一种分离高产多糖小球藻种的方法，该方法是在Basal培养液中加入甘油、鼠李糖和维生素C配制成高产多糖小球藻种的培养液HPSC-M；从野生铁皮石斛茎上分离附生藻，并经高温干燥环境下进行压力筛选，获得高产多糖的小球藻。中国专利“107880144A”公开了一种活性小球藻多糖的制备方法，其具体步骤为：将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，超声波破碎，离心，留下上清液；调节上清液的pH，提取后离心，上清液即为小球藻粗多糖溶液；采用酶解法-Sevage法除蛋白，然后将上清液干燥得到脱蛋白多糖；将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试反应，反应完成后离心，收集上清液，透析，浓缩，醇沉，离心，沉淀加水复溶，浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖。中国专利“CN107858291A”公开了一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括：培养、初筛、多糖提取、复筛，培养步骤中以氨苄青霉素筛分出小球藻，然后经扩大培养进行初筛，选取高产多糖的小球藻进行复筛，复筛分离出高产多糖小球藻种。现有技术的方法大多存在工艺复杂、产糖效率以及收率纯度低等缺陷，需要对工艺进行进一步地改进。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其包括如下步骤：步骤1）小球藻前培养，步骤2）小球藻后培养，步骤3）分离粗藻多糖，步骤4）纯化。

进一步地，

所述工艺包括如下步骤：

步骤1）小球藻前培养：将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5-7％的接种量接种到含有培养液的反应池中；

步骤2）小球藻后培养：培养72h小时后，添加葡萄糖和花生四烯酸，继续培养48-72h，将培养液进行离心收集藻泥；

步骤3）分离粗藻多糖：取藻泥，干燥，粉碎；取藻粉，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，然后加热至80℃，保温条件下水提4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清；絮凝沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积的95％乙醇，4000rpm离心20min，得到沉淀部分，进行干燥，得到粗藻多糖；

步骤4）纯化：采用DEAE-cellulose 52纤维素柱层析对粗藻多糖进行分离纯化，经收集、减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到藻多糖产品。

优选地，

所述培养液的组分为：葡萄糖5g/L，硝酸钾2g/L，氯化钠1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，七水硫酸镁50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L。

优选地，

所述步骤2）中，通过添加葡萄糖，使培养液中的葡萄糖浓度为3-5g/L。

优选地，

所述步骤2）中，通过添加花生四烯酸，使培养液中花生四烯酸浓度为100-200mg/L。

优选地，

所述超声波的条件为：超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为450W，超声波作用时间为30min。

优选地，

所述前培养和后培养的条件均为：光照强度5000-6000lux，22-25℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2-0.3vvm。

本发明还要求保护按照上述工艺获得的粗藻多糖和藻多糖产品。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：

本发明工艺简单可行，能够提高小球藻中藻多糖的含量，通过分离纯化工艺，藻多糖的收率和纯度也大大提高；

本发明成功解决了小球藻生物量与多糖不能同时积累的矛盾，实现了快速高效地生产富含藻多糖的小球藻，具有营养盐消耗少、生产成本低、多糖含量高等优点，有利于简化下游加工操作，促进藻多糖的产业化生产，可广泛应用于以藻多糖为原料的食品、医药、能源等相关领域。

本发明以硝酸钾为氮源，并且添加萘乙酸钠和赤霉素，培养前期可以有效维持小球藻的增殖，随着硝酸钾的消耗，对小球藻造成硝酸盐饥饿，藻生长量放缓，此时添加葡萄糖可以补充合成藻多糖的碳源，而由于硝酸盐氮源的减少，碳源较多流向合成藻多糖的途径；花生四烯酸是重要的细胞内第二信使，直接参与或影响细胞内信号转导，进而调控细胞内生物活动，本发明发现适量的花生四烯酸对藻多糖的产生起到正向反馈的调节。通过在培养中后期阶段添加葡萄糖和花生四烯酸两种物质，相互协同，对胞内藻多糖的生成起到正向调节。

附图说明：图1，葡萄糖添加量对藻多糖产量的影响；图2，花生四烯酸添加量对藻多糖产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其包括如下步骤：

将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5％的接种量接种到含有培养液的反应池中，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖5g/L，硝酸钾 2g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；

培养72h小时后，添加葡萄糖和花生四烯酸，使得培养液中的葡萄糖浓度为3g/L、花生四烯酸浓度为100mg/L，继续培养48h，将培养液进行离心收集藻泥；

取藻泥，干燥，粉碎；称取藻粉2000g，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为450W，超声波作用时间为30min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清；絮凝沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积95％乙醇，4000rpm离心20min，得到沉淀部分，最后直接进行干燥，得到粗藻多糖；

称取1000g粗藻多糖，加入10倍质量的水溶解，溶液过0.45μm的微孔滤膜，所得滤液上DEAE-cellulose 52纤维素层析柱，以蒸馏水及0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L Nacl溶液洗脱，流速设置为0.5ml/min，自动部分收集器收集，每10min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪监测多糖的流出；收集洗脱峰的多糖溶液，减压浓缩，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到精制藻多糖，称重产品重量为684.7g，纯度为95.8%。

实施例2

一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其包括如下步骤：

将处于对数生长期的普通小球藻液，按照7％的接种量接种到含有培养液的反应池中，光照强度6000lux，23℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.3vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖5g/L，硝酸钾 2g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；

培养72h小时后，添加葡萄糖和花生四烯酸，使得培养液中的葡萄糖浓度为4g/L、花生四烯酸浓度为200mg/L，继续培养72h，将培养液进行离心收集藻泥；

取藻泥，干燥，粉碎；称取藻粉2000g，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为450W，超声波作用时间为30min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清；絮凝沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积95％乙醇，4000rpm离心20min，得到沉淀部分，最后直接进行干燥，得到粗藻多糖；

称取1000g粗藻多糖，加入15倍质量的水溶解，溶液过0.45μm的微孔滤膜，所得滤液上DEAE-cellulose 52纤维素层析柱，以蒸馏水及0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L Nacl溶液洗脱，流速设置为0.6ml/min，自动部分收集器收集，每10min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪监测多糖的流出；收集洗脱峰的多糖溶液，减压浓缩，蒸馏水透析36h，冷冻干燥得到精制藻多糖，称重产品重量为663.2g，纯度为96.1%。

实施例3

一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其包括如下步骤：

将处于对数生长期的小球藻液，按照6％的接种量接种到含有培养液的反应池中，光照强度5500lux，24℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.3vvm；所述培养液的组分为：葡萄糖5g/L，硝酸钾 2g/L，氯化钠 1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，碳酸钙 0.1g/L，七水硫酸镁 50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L；

培养72h小时后，添加葡萄糖和花生四烯酸，使得培养液中的葡萄糖浓度为3g/L、花生四烯酸浓度为200mg/L，继续培养48h，将培养液进行离心收集藻泥；

取藻泥，干燥，粉碎；称取藻粉2000g，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为450W，超声波作用时间为30min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清；絮凝沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积95％乙醇，4000rpm离心20min，得到沉淀部分，最后直接进行干燥，得到粗藻多糖；

称取1000g粗藻多糖，加入20倍质量的水溶解，溶液过0.45μm的微孔滤膜，所得滤液上DEAE-cellulose 52纤维素层析柱，以蒸馏水及0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L Nacl溶液洗脱，流速设置为0.8ml/min，自动部分收集器收集，每10min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪监测多糖的流出；收集洗脱峰的多糖溶液，减压浓缩，蒸馏水透析24h，冷冻干燥得到精制藻多糖，称重产品重量为648.9g，纯度为95.5%。

实施例4

不同培养添加物对小球藻生物量的影响：

实验组为实施例1；对照组1：将培养液替换为BG-11,其余同实验组；

对照组2，不添加萘乙酸钠和赤霉素，其余同实施例1；对照组3，不补加葡萄糖，其余同实施例1；对照组4，不添加花生四烯酸，其余同实施例1。每隔天通过分光光度计来检测培养基中小球藻的细胞密度（OD560），其中第0h的密度为接种时的密度；为具体见表1：

表1

时间（h）	实验组	对照组1	对照组2	对照组3	对照组4
						0	0.21	0.21	0.21	0.21	0.21
24	0.58	0.44	0.49	0.58	0.58
						72	1.34	0.97	1.08	1.34	1.34
96	1.89	1.51	1.56	1.71	1.93
						120	2.28	1.99	2.07	2.12	2.25

结论：如表1所示，实验组与对照组1-4的接种量相同，培养步骤相同，不同之处在于培养基不同；对照组1采用常规的培养基进行培养，各阶段的生物量明显低于实验组；对照组2不添加萘乙酸钠和赤霉素，尽管相对于对照组1有所提升，但是比实验组差距较大，说明生长素和细胞分裂素配合能促进小球藻生物量的增加；对照组3在培养后期不添加葡萄糖，碳源减少，造成生物量有所降低；对照组4在培养后期不添加花生四烯酸，较实验组相比，生物量没有明显差异，说明花生四烯酸对小球藻增殖没有明显影响。

实施例5

葡萄糖和花生四烯酸对小球藻多糖含量的影响：

1、设置4个组别，其中，实验组为实施例1；对照组1不补加葡萄糖，其余同实施例1；对照组2不添加花生四烯酸，其余同实施例1；对照组3不添加葡萄糖和花生四烯酸，其余同实施例1。按照实施例1的工艺制备粗藻多糖；称重，并且采用硫酸-苯酚法分析藻多糖含量，计算粗藻多糖中纯品的含量以及提取率，具体如表2所示。

表2

组别	实验组	对照组1	对照组2	对照组3
					纯品含量（g）	78.1	60.2	69.4	56.5
提取率%	3.905	3.01	3.47	2.825

结论：如表2所示，在培养后期，实验组通过添加葡萄糖和花生四烯酸，能够明显提高藻多糖的含量，分别较对照组1、对照组2、对照组3提高了29.7%、12.5%和38.2%；说明通过添加葡萄糖可以补充合成藻多糖的碳源，而此时由于氮源的减少，碳源较多流向合成胞内藻多糖的途径，花生四烯酸是重要的细胞内第二信使，直接参与或影响细胞内信号转导，进而调控细胞内生物活动；本发明通过添加葡萄糖和花生四烯酸两种物质，相互协同，对胞内多糖的生成起到正向调节。

2、培养中后期葡萄糖添加量对藻多糖产量的影响：

分别设置葡萄糖的浓度为0,1,2,3,4,5,6（g/L），如图1所示，随着葡萄糖添加量的增加，藻多糖产量也相应增加，但是增加到3g/L时，明显放缓，增加到5g/L后，藻多糖的产量没有变化，兼考虑到成本，选择3-5g/L的添加量最为合适。

3、培养中后期花生四烯酸添加量对藻多糖产量的影响：

分别设置花生四烯酸的浓度为0,50,100,200,400,800（mg/L），如图2所示，随着花生四烯酸添加量的增加，藻多糖产量也相应增加，前期增幅明显，当花生四烯酸的浓度增大到100mg/L时，继续增加花生四烯酸的浓度，藻多糖产量增幅明显放缓，当花生四烯酸的浓度增大到200mg/L后，藻多糖的产量没有明显的变化。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种生产、分离以及纯化藻多糖的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）小球藻前培养：将处于对数生长期的普通小球藻液，按照5-7％的接种量接种到含有培养液的反应池中；

步骤2）小球藻后培养：培养72h小时后，添加葡萄糖和花生四烯酸，继续培养48-72h，将培养液进行离心收集藻泥；

步骤3）分离粗藻多糖：取藻泥，干燥，粉碎；取藻粉，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，然后加热至80℃，保温条件下水提4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清；絮凝沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积的95％乙醇，4000rpm离心20min，得到沉淀部分，进行干燥，得到粗藻多糖；

步骤4）纯化：采用DEAE-cellulose 52纤维素柱层析对粗藻多糖进行分离纯化，经收集、减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到藻多糖产品。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述培养液的组分为：葡萄糖5g/L，硝酸钾2g/L，氯化钠1g/L，硼砂0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，七水硫酸镁50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，萘乙酸钠10mg/L，赤霉素10mg/L。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）中，通过添加葡萄糖，使培养液中的葡萄糖浓度为3-5g/L。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）中，通过添加花生四烯酸，使培养液中花生四烯酸浓度为100-200mg/L。

5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超声波的条件为：超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为450W，超声波作用时间为30min。

6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述前培养和后培养的条件均为：光照强度5000-6000lux，22-25℃培养，光暗比为18:6。

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