CN109762366B

CN109762366B - 一种生产纯化藻红素的工艺

Info

Publication number: CN109762366B
Application number: CN201910121681.XA
Authority: CN
Inventors: 胡叶飞; 张菊萍; 董国强; 张宏杰; 金荣培
Original assignee: Jiangxi Fuzhou Xinxing Chemical Co ltd
Current assignee: JIANGXI FUZHOU XINXING CHEMICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109762366A

Abstract

本发明属于藻培养技术领域，公开了一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：步骤1）紫球藻种子液，步骤2）大规模培养，步骤3）分离纯化。本发明工艺不但提高了紫球藻中藻红蛋白的含量，而且分离纯化了藻红蛋白。

Description

一种生产纯化藻红素的工艺

技术领域

本发明属于藻培养技术领域，具体涉及提高一种生产纯化藻红素的工艺。

背景技术

藻红素（phycoerythrin），存在于红藻、蓝藻、隐甲藻的色素蛋白，开环的四吡咯藻红素作为色素部分与蛋白质共价键结合。其辅基是吡咯环所组成的链，分子中不含金属，与蛋白质结合在一起。藻红素在在可见光区480-570波段有较强的吸收，而且可以产生强烈的荧光。不论就藻红素、藻蓝素或其它天然蛋白质色素而言，通常具有实用安全性，对热、酸碱度等亦具有相当程度的稳定性，可应用于食品与化妆品上，同时亦可作为免疫学上抗体标志用的荧光色素，而应用于临床诊断及细胞生化学研究上。

目前市场已开发并应用的有藻蓝素(phycocyanin)与藻红素(phycoerythrin)，存在产量少及价格昂贵的缺陷，对全球每年数万磅食用红色色素的需求，必须开发一种天然、安全、稳定又具有特殊荧光释出的红色色素，预估大量生产后，将使价格下降，更会扩大其应用范围与市场供给。

目前藻红素大部分是分离自红藻的大型叶状体，如紫菜(Porphyra)或仙菜藻(Ceramium)等，以及紫球藻。如何提高藻类细胞的藻红素产量是研究人员密切关注的问题。环境因子对藻中藻红蛋白以及脂类的合成有着重要的影响。藻红蛋白对于藻类而言就是它的“内源氮库”，所以，营养盐尤其是N源对藻红蛋白的影响较为重要。文献“氮素营养对龙须菜生长及色素组成的影响，台湾海峡，2006年”在不同氮浓度及不同化合态氮条件下，探讨了龙须菜藻体的色素组成变化特性，结果为：不同化合态氮对龙须菜生长速率的影响差异不大，对藻体中藻红素含量的影响却差异显著；不同浓度氮对龙须菜生长率的影响与所添加的氮浓度成正比，试验前期藻红素含量变化也是如此，但藻体中色素含量积累到一定浓度时就不再增加。文献“氮浓度对紫球藻藻红素的影响，农业资讯”以NaNO3 作为氮源，设置不同的氮浓度，通过分光光度计法观测在不同氮浓度条件下紫球藻藻红素的含量变化。结果发现，在一定浓度范围内，藻红素含量随氮浓度的升高而增加；当氮浓度超过8mmol/L时，过高的氮浓度不能有效提高藻红素产量。可见，现有技术已经对藻红素的合成所需要适宜浓度的氮源进行了系统地研究。

此外，一些外源植物激素对藻类的生长影响也较大，但是植物激素类型较多，不同的植物激素对不同的藻类的影响区别较大，并没有统一的经验可以借鉴，不能根据其他藻类进行照搬。可见，外界因素的优化是提高紫球藻生长和增殖的主要因素，也是研究的难点。

申请人之前的专利技术“提高紫球藻中藻红素含量的方法”通过对培养过程进行了调整，提高了紫球藻的生长速率以及藻红素的含量，在此基础上，申请人继续对紫球藻中的藻红素进行了分离纯化。

发明内容

在申请人之前的专利的基础上，申请人继续对紫球藻中的藻红素进行了分离纯化，提供了一种生产纯化藻红素的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：步骤1）紫球藻种子液，步骤2）大规模培养，步骤3）分离纯化。

进一步地，所述步骤1）紫球藻种子液，包括：

将培养至对数生长期的紫球藻接种到含有f/2培养基的种子罐中，接种初始密度为2×10⁵个/ml，光照强度4000lux，23℃培养，光暗比为14:10，通入空气流量为0.4vvm，培养2d，收集紫球藻种子液。

进一步地，所述步骤2）大规模培养，包括：将紫球藻种子液接入到含有人工合成培养液的反应池中，控制光照强度为4000-6000Lux，通入空气流量为0.3-0.5vvm，22-25℃培养，光暗比为14:10，培养3d，然后添加0.01-0.05mg/L的芸苔素内酯和0.3-0.5g/L的生物氮素，继续培养3-5d，收集藻液。

进一步地，所述步骤3）分离纯化，包括：将藻液过滤，收集紫球藻，用PBS缓冲液悬浮藻细胞，再用超声细胞粉碎机破碎细胞，然后4000rpm离心10min，收集上清液，然后添加占上清液20%重量份的硫酸铵，搅拌均匀，然后静置12h；在4℃以6000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀加入10倍重量的水进行溶解，然后采用SephadexG-25层析柱进行脱盐，然后经过羟基磷石灰柱层析，收集目标洗脱液，浓缩，最后进行冷冻喷雾干燥，得到产品。

优选地，所述芸苔素内酯的添加量为0.01-0.05mg/L。

优选地，所述生物氮素的添加量为0.3-0.5g/L。

优选地，所述人工合成培养液的组分为：氯化钠12g/L，硝酸钠1g/L，碳酸钠0.5g/L，硼砂0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，柠檬酸铁铵20mg/L，吲哚乙酸1mg/L。

优选地，所述超声细胞粉碎机的功率100W，工作时间5s，间歇时间3s，循环60次。

本发明还要求保护上述任其一所述的工艺制备的藻红蛋白。

本发明还要求保护按照上述任其一所述的方法生产的藻红素。

本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明首先以硝酸钠为氮源，配以合适的盐度，并且添加吲哚乙酸用于促进细胞分离，培养前期可以高效地维持紫球藻的增殖，随着硝酸钠的消耗，紫球藻生长放缓，此时，藻细胞内合成藻红素的速率增加，为了平衡藻细胞增殖和藻红素合成之间的关系，选择生物氮素作为氮源，属于有机氮源的类型，藻细胞利用效率降低，但是可以提高藻红素的合成速率，因此，通过添加生物氮素作为氮源既可以合理控制紫球藻的增殖速率，避免藻细胞出现大量死亡，还能够提高藻红素的产量。本发明在培养中期添加适量的芸苔素内酯，无毒害，生物活性高，能够提高紫球藻的抗逆性，刺激叶绿体的生成，提高光合作用，促进藻红素的积累。

本发明对紫球藻进行进一步超声破碎，然后经过硫酸铵沉淀蛋白，再经过层析柱进行脱盐除杂，最后经过浓缩干燥，得到产品，经过检测（纯度标准为OD545/OD280大于等于4.5），藻红蛋白纯度可达到4%以上，总收率为50%以上

附图说明

图1：不同培养时间点的藻细胞密度；

图2：不同处理方式的藻红蛋白相对含量；

图3：不同的芸苔素内酯的添加量对藻红蛋白相对含量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：

将培养至对数生长期的紫球藻接种到含有f/2培养基的种子罐中，接种初始密度为2×10⁵个/ml，光照强度4000lux，23℃培养，光暗比为14:10，通入空气流量为0.4vvm，培养2d，收集紫球藻种子液；

将紫球藻种子液按照10%的接种量接入到含有人工合成培养液的反应池中，控制光照强度为5000Lux，通入空气流量为0.5vvm，25℃培养，光暗比为14:10，培养3d，然后添加0.02mg/L的芸苔素内酯和0.3g/L的生物氮素，继续培养5d，得到藻液；

所述培养液的组分为：氯化钠12g/L，硝酸钠1g/L，碳酸钠0.5g/L，硼砂0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，柠檬酸铁铵20mg/L，吲哚乙酸1mg/L；

将藻液过滤，收集紫球藻，用0.01mol/L，pH7.0的PBS缓冲液悬浮藻细胞，再用超声细胞粉碎机(功率100W，工作时间5s，间歇时间3s，循环60次)破碎细胞，然后4000rpm离心10min，收集上清液，然后添加占上清液20%重量份的硫酸铵，搅拌均匀，然后静置12h；在4℃以6000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀加入10倍重量的水进行溶解，然后采用SephadexG-25层析柱进行脱盐，然后经过羟基磷石灰柱层析，收集目标洗脱液，浓缩，最后进行冷冻喷雾干燥，得到产品。

实施例2

一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：

将紫球藻种子液按照10%的接种量接入到含有人工合成培养液的反应池中，控制光照强度为6000Lux，通入空气流量为0.3vvm，22℃培养，光暗比为14:10，培养3d，然后添加0.01mg/L的芸苔素内酯和0.4g/L的生物氮素，继续培养4d，得到藻液；

实施例3

一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：

将紫球藻种子液按照10%的接种量接入到含有人工合成培养液的反应池中，控制光照强度为6000Lux，通入空气流量为0.5vvm，24℃培养，光暗比为14:10，培养3d，然后添加0.04mg/L的芸苔素内酯和0.34g/L的生物氮素，继续培养5d，，得到藻液；

实施例4

藻细胞密度以及藻红素相对含量的检测方法。

培养过程中每天取100mL藻液（藻细胞含量采用计数法）作为样品，过滤，去上清，收集藻细胞，用50mL 0.01mol/L，pH7.0的PBS缓冲液悬浮藻细胞，用超声细胞粉碎机(功率100W，工作时间5s，间歇时间3s，循环60次)破碎细胞，然后4000rpm离心10min，收集上清液即为藻红蛋白测试液，然后于545nm处测其吸光度值。545nm为藻红蛋白的特征吸收峰，以每10⁷个细胞所对应的545nm处的吸光度值作为其相对含量的评定标准。

1、分别于第0，2,4,6,8,10天，检测藻液中藻细胞的密度，如图1所示，培养前期藻细胞增幅迅速，随着无机氮源的消耗，中期增殖放缓，添加生物氮素后，藻细胞继续增殖，但是增加到8d时，得到最大值，藻类生存环境变的恶劣，细胞出现大量的死亡，细胞密度降低。

2、分别于第0,1,2,3,4,5,6,7,8天，检测藻红蛋白的相对含量，设置两个平行对照组，分别为，对照1：只添加芸苔素内酯，其余同实施例1；对照2：只添加生物氮素，其余同实施例1；实验组为实施例1。具体的数据如图2所示。横向观察，三个组别在培养前期，藻红蛋白的相对含量均有一定的增幅，但是增幅并不显著，培养中期，通过添加芸苔素内酯或/和生物氮素，藻红蛋白的相对含量有一定的增幅，其中添加芸苔素内酯和生物氮素的实验组最高，可达到0.87；纵向观察，在培养中后期，实验组的藻红蛋白相对含量高于对照1-2，其中，对照1的最高值为0.71，对照2的最高值为0.78，可见，芸苔素内酯和生物氮素二者具备一定的协同提高藻红蛋白含量的作用。

3、本发明还检测了不同的芸苔素内酯的添加量对藻红蛋白相对含量的影响。设置浓度梯度为0,0.005,0.01,0.02,0.04,0.08,0.16（mg/L），如图3所示，随着芸苔素内酯的浓度的增加，对藻红蛋白的相对含量有明显的促进，当浓度达到0.01mg/L后，继续增加芸苔素内酯的浓度，对藻红蛋白相对含量的影响有限，考虑到成本等因素，选择0.01-0.04mg/L的浓度比较合适。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种生产纯化藻红素的工艺，其包括如下步骤：

步骤1）制备紫球藻种子液，包括：

步骤2）大规模培养，包括：将紫球藻种子液按10%的接种量接入到含有人工合成培养液的反应池中，控制光照强度为4000-6000Lux，通入空气流量为0.3-0.5vvm，22-25℃培养，光暗比为14:10，培养3d，然后添加芸苔素内酯和生物氮素，继续培养3-5d，得到藻液；

所述芸苔素内酯的添加量为0.01-0.05mg/L；

所述生物氮素的添加量为0.3-0.5g/L；

所述人工合成培养液的组分为：氯化钠12g/L，硝酸钠1g/L，碳酸钠0.5g/L，硼砂0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，柠檬酸铁铵20mg/L，吲哚乙酸1mg/L；

步骤3）分离纯化，包括：将藻液过滤，收集紫球藻，用PBS缓冲液悬浮藻细胞，再用超声细胞粉碎机破碎细胞，然后离心，收集上清液，再添加占上清液20%重量份的硫酸铵，搅拌均匀，然后静置12h；在4℃以6000rpm离心10min，收集沉淀，往沉淀中加入10倍重量的水进行溶解，然后采用SephadexG-25层析柱进行脱盐，再经过羟基磷石灰柱层析，收集目标洗脱液，浓缩，最后进行干燥，得到产品。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超声细胞粉碎机的功率100W，工作时间5s，间歇时间3s，循环60次。