MXNL06000062A - Recuperacion y purificacion de b-ficoeritrina producida por porphyridium cruentum utilizando sistemas de dos fases acuosas y precipitacion isoelectrica. - Google Patents

Abstract

Esta invención se enfoca en un proceso nuevo en el cual la biomasa de Porphyridium cruentum es primeramente sometida a una etapa de ruptura celular y posteriormente a etapas de recuperación y purificación para obtener el colorante proteico B-ficoeritrina (BFE) purificado utilizando sistemas de dos fases acuosas. Los pasos de recuperación preferentemente incluye una precipitación isoelectrica seguido de una etapa de extracción es sometido a una etapa de ultra filtración a fin de eliminar el polímero (PEG) y obtener un colorante con una pureza superior a 4.0 medida como la relación entre las absorbencias a 545 y 280nm (pureza de BFE= Abs545nm / Abs545nm ).

Description

RECUPERACION Y PURIFICACION DE B-FICOERITRINA PRODUCIDA POR Porphyrídium crueníum UTILIZANDO SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS Y PRECIPITACION ISOELECTRICA DESCRIPCIÓN OBJETO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el desarrollo de un proceso para la recuperación y purificación de B-ficoeritrina (BFE) producida por la microalga Porphyrídium cruentum, utilizando como etapas principales precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas con polietilénglicol y fosfato de potasio.

ANTECEDENTES En la actualidad el uso de pigmentos artificiales (particularmente en la industria alimentaria y cosmética) ha decaído considerablemente debido a los efectos adversos sobre la salud que algunos de estos han mostrado tener. Entre dichos efectos sobresalen el desarrollo de trastornos mentales (particularmente en niños), desarrollo de alergias e inclusive cáncer. Debido a esto y a la presión generada por el consumidor sobre las compañías que utilizan estos colorantes el uso de pigmentos de origen natural (proteicos y no proteicos) ha tomado auge. Adicionalmente los colorantes de origen natural han mostrado tener una gran versatilidad, encontrando uso no solo en la industria alimentaria y de cosméticos, sino también en aplicaciones relacionadas con investigación (en particular biología molecular).

Las ficobiliproteínas son colorantes proteicos encontrados en la naturaleza (cianobacterias, en algas eucarióticas monocelulares biflageladas, así como en rodófitas). Estos compuestos son considerados pigmentos accesorios, los cuales facilitan el proceso de fotosíntesis. Se encuentran embebidos dentro de los cloroplastos (membrana tilacoide). Las ficobiliproteínas tienen grupos prostéticos tetrapirrólicos lineales (bilinas), unidos covalentemente a residuos de cisteína específicos de las proteínas (Bermejo et al, 2002; Berns and MacColl, 1989; Ritter et al, 1999). Estos complejos absorben la luz dentro de un rango amplio de longitud de onda dentro del espectro visible, por lo cual abarcan una amplia gama de colores. La B-ficoeritrina (BFE) es una ficobiliproteína de color rosa intenso, con un peso molecular de 245 kDa, formada por tres subunidades (a, ß, y ? en una relación molar de 6:6: 1 ) de peso molecular igual a 1 8,000, 18,000 y 29,000 g/mol, respectivamente (Benavides y Rito-Palomares, 2004). El punto isoeléctrico de BFE se ha reportado alrededor de 4.2 - 4.4 (Koller et al, 1977). La microalga marina Porphyridium cruentum ha demostrado tener gran potencial para la producción de BFE.

Este pigmento proteico ha demostrado tener aplicación en la industria alimentaria, cosmética y de detergentes como colorante natural. De igual manera es utilizado ampliamente como pigmento fluorescente en biología molecular (Bermejo et al, 2002). El valor comercial de BFE altamente pura (definida como una relación de absorbancias a 545 y 280nm mayor a 4.0 (Abs 545nm/280nm > 4)) ha sido reportado en $50 dólares/mg (Martek Corporation, 2005; Haugland, 1996). Porphyridium cruentum produce adicionalmente otros dos pigmentos (ficobiliproteínas): aloficocianina (AFC) y R- ficocianina (RFC). Sin embargo, el valor comercial que alcanzan estos pigmentos no es tan elevado (comparado como el de BFE), y por lo tanto el desarrollo de un proceso para la recuperación y purificación de estos dos pigmentos no resulta tan atractivo. En contraste, el elevado valor comercial de la BFE justifica los intentos previos (Bermejo et al, 2002 y 2003; UNIV GRANADA Patente ES2197820-A 1 y ES2197820-B 1 ) por desarrollar procesos eficientes para la recuperación y purificación de BFE.

A pesar de su gran versatilidad el uso de pigmentos naturales ha sido frenado, al menos en cierto grado, por la complej idad de los procesos de recuperación y purificación necesarios para su obtención. Adicionalmente, los costos relacionados con dichos procesos generalmente son elevados, debido a la gran cantidad de operaciones involucradas. El uso a nivel industrial de técnicas difícilmente escalables genera elevados costos de operación y mantenimiento, lo cual hace menos atractiva desde un punto de vista económico la intención de producir y recuperar compuestos de esta naturaleza.

Protocolos para la recuperación y purificación de B-ficoeritrina producida por algas han sido reportados (para una amplia gama de aplicaciones). Chen et al (Patente CN 1587275-A) reporta un método de recuperación y purificación de ficoeritrina producida por microalgas que involucra lixiviación con agua destilada, precipitación escalonada con sulfato de amonio y cromatografía por intercambio iónico, obteniendo de esta forma una recuperación aproximada del 52%. Bermejo et al (UNIV GRANADA Patente ES2197820-A l y ES2197820-B 1) reportan haber purificado BFE producida por Porphyridium cruentum mediante ruptura celular por choque osmótico, seguida por una etapa cromatográfica de cama expandida con un soporte iónico, y por último una etapa cromatográfica iónica convencional, dando esto por resultado un producto altamente purificado (Abs 545nm/280nm > 4). Chiang et al (ZEN-U BIOTECHNOLOGY CO LTD Patente JP2004166704-A, US2004137583-A 1 , TW222463-B 1 , TW222999-B 1 , TW223000-B 1 , TW224135-B 1 , TW200408706-A, TW200408707-A, TW200408704-A y TW200408705-A) reportan un proceso de producción y recuperación de ficoeritrina producida por algas, el cual involucra el crecimiento del microorganismo utilizando dos tanques en serie, generación de una solución de cromoproteínas, para posteriormente sedimentar la ficoeritrina presente en la solución. ZH SAGAKEN CHIIKI SANGYO SHIEN CENT y SAGAKEN (Patente JP2003292815-A y JP2003231821-A) reportan un método para la recuperación de pigmentos producidos por algas el cual involucra el secado de la biomasa, su resuspensión en una solución de sulfato de amonio o algún otro buffer particular y posteriormente una etapa selectiva de separación. Jiang y Jou (Patente TW270146-A) lograron recuperar ficoeritrina producida por Bangia atropurpúrea and Porphyra angusta mediante un proceso que involucra la colección de gametofitos del alga madura, el cultivo de dichos gametofitos en un medio especial para la producción de esporas, el cultivo de las esporas bajo condiciones controladas de temperatura y luz, el cultivo de los cuerpos filamentosos formados por las esporas, recolección, secado y resuspendido de los mismos en una solución de fosfato en la cual ocurre la extracción de los pigmentos de interés y otros contaminantes, agregar sales para precipitar impurezas y por último el uso de cromatografía en gel para purificar la ficoeritrina. A pesar de que este método da como producto ficoeritrina altamente purificada es relativamente complicado y su aplicación industrial es limitada. NAT SCI COU CIL (Patente JP72861 12-A y JP2648088-B2), al igual que Chou y Chiang (Patente US5358858-A) reportan procesos similares a Jiang.

Como se puede observar en la actualidad existen algunos protocolos reportados para la recuperación y purificación de colorantes proteicos intracelulares producidos por algas. El protocolo completo en la mayoría de los casos es complicado debido a las numerosas etapas cromatográficas necesarias para obtener la proteína de interés con los niveles de pureza necesarios (Bermejo et al, 2002 y 2003). La necesidad del elevado número de etapas que demandan los protocolos convencionales comúnmente lleva a bajos rendimientos (pérdida del producto) y altos costos de procesos (Ranjitha y aushik, 2005). Consecuentemente, el escalamiento potencial de este tipo de procedimientos es percibido negativamente desde el punto de vista económico. Para minimizar las desventajas atribuidas a los protocolos de purificación establecidos para colorantes proteicos, se ha propuesto la reducción de etapas cromatográficas (Liu et al, 2005) y el uso de técnicas de recuperación alternativas, fácilmente escalables, tales como sistemas de dos fases acuosas (SDFA; Benavides y Rito-Palomares, 2005).

Ninguno de los procesos antes mencionados utiliza sistemas de dos fases acuosas para llevar a cabo la recuperación y purificación de B-ficoeritrina producida por microalgas. En el trabajo publicado por Hernández-Míreles y Rito-Palomares (2006), autores de la presente solicitud, se describe un proceso para la recuperación y purificación de BFE mediante precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas PEG - sal. De dicha investigación se deriva el proceso aquí propuesto. Los Sistemas de Dos Fases Acuosas (SDFA) es una técnica de recuperación y purificación primaria líquido-líquido, que ha demostrado ser eficiente en separar compuestos de naturaleza biológica (proteicos y no proteicos; Rito-Palomares, 2004, Rito Palomares, 2002; Shinomiya et al, 2003; epka et al, 2003; Cunha et al, 2003; Marcos et al, 2002; Reh et al, 2002). Los SDFA permiten la intensificación e integración de los procesos de recuperación, ya que son capaces de procesar grandes cantidades de sólidos suspendidos (incluyendo restos celulares) eliminando de esta forma etapas innecesarias, tales como centrifugaciones y precipitaciones, logrando de esta forma la integración de dos o más etapas en una sola. Adicionalmente los SDFA son relativamente económicos y fácilmente escalables, lo cual los hace candidatos ideales para formar parte de un proceso a nivel industrial.

Existen sistemas de dos fases acuosas polímero - polímero, los cuales están formados por dos polímeros diferentes (Polietilenglicol (PEG) - Dextrano, PEG - Polivinil alcohol, etc.). Sin embargo, el uso de estos sistemas esta de cierta forma limitado por los altos costos que algunos polímeros tienen. Muchos polímeros forman sistemas de dos fases acuosas cuando son combinados con ciertas sales, dando como resultado un sistema de dos fases acuosas polímero - sal (PEG - Fosfato de potasio, PEG - Sulfato de sodio, etc.) (Huddleston et al, 1991 ; Albertsson et al, 1990). Existen inclusive patentes relacionadas con la recuperación de productos biológicos de alto valor comercial mediante el uso de sistemas de dos fases acuosas (Penttilae et al, Patente WO200058342-A, EP1 163260-A, WO200058342-A 1 , AU200035621 -A, EP 1 163260-A 1 , NO200104534-A, KR2001 108400-A, CN 1357005-A, JP2002543766-W, NZ514891 -A, AU778477-B2, US2006084164-A 1 y US7060669-B 1 ; Guinn, Patente US5907035-A; Ageland et al, Patente W0981 1 127-A, EP954524-A, W0981 1 127-A 1 , AU9741430-A, NO9901208-A, EP954524-A 1 , US6107467-A, NZ334589-A, JP2001500154-W, AU729536-B, EP954524-B 1 , DE69720786-E, ES2197361 -T3, US6767994-B 1 y US2004225120-A 1). Debido a su bajo costo y al corto tiempo de separación, uno de los sistemas de dos fases acuosas más caracterizado y utilizado es el sistema polietilénglicol - fosfato de potasio.

La preferencia de una proteína por migrar a una fase en particular del sistema depende de varios factores, entre los cuales se encuentran: su peso molecular, carga electroquímica neta, punto isoeléctrico y contenido de residuos hidrofóbicos de aminoácidos. Sin embargo, no solo las características de la proteína a separar influyen en su comportamiento de partición. Los parámetros del sistema de dos fases acuosas juegan un papel de gran importancia durante la partición de la proteína de interés hacia una fase en particular. Entre estos parámetros se encuentran: tipo, peso molecular y concentración de polímero usado para construir el sistema, naturaleza y concentración de las sales utilizadas, diferencias de concentración de los componentes en cada una de las fases, pH del sistema, temperatura. (Sarubbo et al, 2000).

Otra técnica que se utiliza ampliamente para la recuperación y purificación de proteínas es la precipitación isoeléctrica. El punto isoeléctrico es el valor de pH en el cual la carga eléctrica superficial de cierta molécula (proteína) es igual a cero. La solubilidad de una proteína que se encuentra en su punto isoeléctrico es mínima, ya que al no existir carga eléctrica superficial, las fuerzas de repulsión entre las moléculas desaparecen, formándose agregados que precipitan fácilmente. A este fenómeno se le conoce como precipitación isoeléctrica. Esta técnica de recuperación y purificación de proteínas es ampliamente usada (Onsaard et al, 2006; Zhang et al, 2004) debido a que es económica y fácil de implementar a cualquier escala.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de flujo simplificado del proceso propuesto para la recuperación y purificación de BFE producida por Porphyridium cruentum.

Figura 2. Efecto del método mecánico de ruptura celular utilizado sobre la cantidad de B-ficoeritrina ( ? ), aloficocianina ( E3 ) y R-ficocianina ( )· Figura 3. Pureza del extracto resuspendido de B-ficoeritrina (BFE) proveniente del precipitado isoeléctrico a diferentes pH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención esta enfocada a un proceso novedoso para recuperar y purificar B-ficoeritrina producida por la microalga Porphyridium cruentum, utilizando sistemas de dos fases acuosas polímero - solución salina y precipitación isoeléctrica como etapas principales de proceso. La invención cuenta con tres etapas principales (posteriores al cultivo de la microalga). Los protocolos para el cultivo de microalgas están bien documentados y estandarizados (Cohén et al, 1991 ; Cohén y Arad, 1989), lo cual facilita su aplicación tanto a nivel laboratorio como industrial. En la primera etapa las células del alga, también conocida como biomasa, son recuperadas mediante etapas tradicionales de separación sólido líquido, tales como centrifugación o sedimentación. Posteriormente, debido a que la BFE es un producto intracelular, es necesario liberar el pigmento mediante una técnica de ruptura celular. Las técnicas de ruptura celular que pueden utilizarse son mecánicas (maceración o sonicación) o no-mecánicas (lisis química o enzimática), prefiriéndose las técnicas mecánicas por su eficiencia. De los métodos de ruptura celular mecánica se prefiere el uso de sonicación o sistemas de homogenización. En la segunda etapa de proceso, contempla la purificación inicial de la corriente proveniente de la etapa de ruptura celular, utilizando precipitación isoeléctrica. Para realizar esta etapa se ajusta el pH de la corriente mediante la adición de ácido clorhídrico (HCI), ácido acético, etc, a fin de eliminar proteínas con puntos isoeléctricos diferentes a la BFE. Por último en la tercera etapa se realiza la purificación final de la corriente obtenida de la precipitación isoeléctrica mediante el uso de sistemas de dos fases acuosas con polietilénglicol (PEG) - fosfato de potasio.

El cultivo de Porphyridium cruentum se realiza utilizando el medio de cultivo cuya composición se muestra en la Tabla 1 .

Tabla 1. composición del medio de cultivo de Porphyridium cruentum Nombre del compuesto Fórmula química Cantidad (por un litro) Cloruro de sodio NaCl 24.53 g Cloruro de magnesio MgCl2 5.20 g Sulfato de sodio Na2S04 4.09 g Cloruro de calcio CaCl2 1 - 16 g Cloruro de potasio KC1 0.70 g Bicarbonato de sodio NaHC03 0.20 g Nitrato de sodio NaN03 0.17 g Bromuro de potasio KBr 0.10 g Ácido bórico H3BO3 30 mg Fosfato monobásico de NaH2P04 14 mg sodio EDTA sal disódica Na2C,oH14N208 10 mg C ¡trato de fierro Fe3(C6H507)2 5 mg Molibdato de sodio Na2Mo04 0.24 mg Cloruro manganoso MnCl2 0.20 mg Cloruro de zinc ZnCl2 0.14 mg Sulfato de cobre CuS04 0.03 mg Cloruro de cobalto CoCl2 0.01 mg Tiamina C,2H17N4OS 35 µg Biotina C,0H 16N2O3S 5 V-% El cultivo del alga se lleva a cabo en una modalidad de lote o lote alimentado, a 20-25°C, bajo condiciones de luz natural o regulada (organismo fotosintético). Las paredes del bioreactor tienen que ser de un material transparente (vidrio o plástico) de tal forma que se permita el paso de la luz a través del mismo. Durante el cultivo se proporciona agitación y aireación al reactor, mediante un flujo de aire de 2-4 cm /seg por cada dm de caldo de cultivo. Es recomendable adicionar con dióxido de carbono (1 -5 % v/v) el flujo de aire alimentado al bioreactor con la finalidad de acelerar el crecimiento del alga, así como aumentar la densidad celular que puede ser alcanzada (en comparación a cuando se utiliza aire sin C02 suplementado). La adición de dióxido de carbono es opcional. El crecimiento de las células se mantiene preferentemente por un total de 30 días.

Posteriormente la biomasa (células del alga) producida en el bioreactor es recuperada utilizando una etapa de separación sólido líquido tal como sedimentación o centrifugación, preferentemente centrifugación. La cantidad de biomasa obtenida depende fuertemente de las condiciones de cultivo elegidas (medio utilizado, ciclo de luz natural o regulada, C02 suplementado y tiempo de cultivo). Dicha cantidad suele ir de 5 a 40 g de biomasa húmeda por litro de cultivo. Después de la recuperación de las células se realiza la ruptura celular del alga (ya que el pigmento de interés es intracelular) utilizando métodos mecánicos (maceración manual, molino de perlas, prensa francesa, sonicación). No todos los métodos de ruptura tienen la misma eficiencia, por ejemplo, el uso de sonicación permite liberar una mayor cantidad de BFE por gramo de biomasa húmeda procesada en comparación cuando se utiliza maceración. En el caso particular de la ruptura celular por sonicación, se puede realizar en un recipiente de vidrio, en el cual se agrega la biomasa húmeda y agua (en una relación de 4 cm3 de agua por gramo de biomasa húmeda). El recipiente se sumerge en la cámara de sonicación para dar inicio al rompimiento de la membrana celular. El tiempo de sonicación es de 10 minutos/g de biomasa húmeda. El rompimiento de la membrana celular (ruptura celular) de la alga puede ser verificada utilizando un microscopio óptico estándar (Microscopio Estándar 25 Cari Zeiss). Al extracto obtenido como resultado de la ruptura de las células de Porphyridium cruentum se le da el nombre de extracto crudo de BFE e incluye los fragmentos celulares generados. La sonicación no tan solo permite liberar mayor cantidad de BFE, sino que adicionalmente libera proporcionalmente una menor cantidad de aloficocianina (AFC) y R-ficocianina (RFC) en relación a BFE. La pureza de BFE con respecto a otras proteínas (definida como una relación de absorbancias a 545 y 280nm) en el extracto crudo obtenido por sonicación se encuentra generalmente entre 0.6 -0.8 (Abs 545nm/280nm ~ 0.6 - 0.8). Si bien la ruptura celular por sonicación es principalmente aplicada en procesos a nivel laboratorio y piloto, otros métodos mecánicos de ruptura tales como el molino de perlas o la prensa francesa pueden tomar su lugar a escala industrial sin comprometer (de una forma negativa) la cantidad de BFE liberada ni la pureza de la misma.

Si se desea obtener BFE con una pureza de grado analítico (Abs 545nm/280nm > 4) para aplicaciones en el área de biología molecular es necesario hacer una purificación previa al uso de sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio. Dicha purificación previa es lograda mediante la precipitación isoeléctrica de BFE. La precipitación isoeléctrica aplicada al extracto crudo de BFE obtenido de la ruptura celular de Porphyridium cruentum se logra ajustando el pH del extracto a 4 - 5 con HCl (0.1 - 1 N). De preferencia este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (5 - 15 °C) y protegiendo la suspensión de una exposición excesiva a la luz para evitar la degradación del producto de interés. El precipitado es recuperado mediante centrifugación (10 g por 20 min) y resuspendido utilizando buffer de fosfato (20 mM, pH 7.0). A la solución obtenida como resultado del proceso anterior se le da el nombre de extracto resuspendido de BFE. La máxima pureza de la proteína de interés se obtiene a pH 3.5 - 4.5 (valor cercano al punto isoeléctrico para BFE reportado por oller et al, 1977). A este valor de pH el extracto resuspendido tiene una pureza entre 1.6 y 2.0 (Abs 545nm/280nm ~ 1.6 - 2.0). Esto representa un aumento de 2.6 en la pureza del extracto crudo proveniente de la etapa de ruptura celular. Durante la etapa de precipitación isoeléctrica, aproximadamente de 70-80% de la BFE que se encuentra en el extracto crudo es recuperado en el precipitado, mientras que el resto permanece en el sobrenadante. La precipitación isoeléctrica da como resultado un precipitado (rico en BFE, restos celulares y otras proteínas que tienen con un punto isoeléctrico similar a BFE), el cual es recuperado, resuspendido y alimentado al sistema de dos fases acuosas.

Los sistemas de dos fases acuosas se preparan por conveniencia utilizando una base másica fija. A fin de lograr la formación de los sistemas de dos fases polietilénglicol (PEG) -fosfato de potasio se mezclan las cantidades adecuadas de PEG y fosfato de potasio con el extracto resuspendido de BFE (obtenido mediante la precipitación isoeléctrica del extracto crudo). En estudios previos realizados (Benavides y Rito-Palomares, 2004; Hernandez-Mireles y Rito-Palomares, 2006) se determinaron los parámetros de sistema bajo los cuales la partición de la BFE se ve favorecida hacia la fase superior del sistema (en otras palabras las condiciones bajo las cuales la recuperación de BFE en la fase polimérica del sistema es optimizada). Dichas condiciones son: peso molecular de polímero (PM PEG) entre 600 y 1500 g/gmol, longitud de línea de corte (LLC, la cual es función de la diferencia de concentración de PEG y sal en cada una de las fases del sistema) entre 30 y 50% p/p, relación de volumen (VR, la cual esta definida como la razón entre el volumen de la fase superior e inferior del sistema) mayor a 2, y por último el pH del sistema, el cual debe estar entre 7 y 8.

Los sistemas se forman mediante la mezcla de PEG en forma de una solución concentrada (50 - 80% p/p) y de fosfato de potasio en solución (30 - 40% p/p, compuesta de fosfato de potasio monobásico y dibásico en una proporción 7: 18). El pH de la solución de fosfato de potasio es ajustado a 7 - 8 mediante la adición de ácido orto-fosfórico o hidróxido de potasio, según se requiera. Una vez mezcladas las soluciones de PEG y fosfato de potasio se procede a agregar el extracto crudo o resuspendido de BFE cuya concentración puede variar del 10 al 40% p/p del sistema de extracción, prefiriéndose el 40% p/p (10-40% p/p). El peso total del sistema se alcanza mediante la adición de agua. El sistema es agitado de tal manera que se lleve a cabo la mezcla de los compuestos adicionados. La separación de las fases del sistema puede llevarse a cabo mediante dos métodos: sedimentación o centrifugación. En caso de hacerla por sedimentación el sistema se deja en reposo para que de esa forma ocurra la separación de las fases. La velocidad con la cual se separan las fases depende de varios parámetros, entre los cuales destacan la LLC, el peso molecular del polímero utilizado y la geometría del sistema. De manera alternativa es posible acelerar la formación de las fases del sistema mediante centrifugación. El uso de centrifugación agiliza enormemente el proceso de recuperación y purificación, al acelerar la formación y separación de las fases del sistema.

En los sistemas de dos fases acuosas, los compuestos y restos celulares provenientes de los extractos se concentran en la fase hacia la cual tienen mayor afinidad. En el caso de la BFE, esta proteína colorante muestra una obvia afinidad por la fase superior de sistemas formados con PEG y fosfato de potasio. Los restos celulares tienden a concentrarse en la interfase del sistema de dos fases acuosas, lo cual facilita la eliminación de estos contaminantes. Una vez que las dos fases del sistema se separan por completo, la fase superior (rica en polímero), donde se encuentra la BFE, es recuperada. Si el contenedor donde se encuentra el sistema tiene una válvula en el fondo del mismo es posible remover primero la fase inferior del sistema (la cual no contiene BFE), y una vez retirada la fase inferior es posible recuperar la fase polimérica (la cual contiene BFE). Una alternativa es recuperar la fase superior mediante bombeo.

Una vez recuperada la fase superior es posible remover el polímero mediante ultrafiltración (la cual es una técnica fácilmente implementable a nivel industrial). El peso molecular de BFE es de 245 kDa. Por otro lado el peso molecular de los polímeros utilizados para generar el sistema de fases acuosas se encuentra entre 600 y 1500 g/gmol. La amplia diferencia entre los pesos moleculares de la proteína y del polímero hacen de la ultrafiltración una técnica ideal para su separación. El peso molecular de corte (MWCO) de la membrana de ultrafiltración utilizada puede estar entre 10 y 100 kDa.

De esta manera el proceso de recuperación y purificación consiste en tres etapas: ruptura celular de Porphyridium cruentum mediante sonicación (o algún otro método de ruptura mecánica), precipitación isoeléctrica (pH 4 - 5) del extracto crudo de BFE mediante la adición de HCl, y por último sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio.

En cuanto a las técnicas analíticas utilizadas, la concentración de proteína total de las muestras se estima utilizando el método de Bradford (1976). La pureza de BFE se determina como la relación entre las absorbancias a 545 y 280nm (pureza de BFE = Abs5 5nm Abs280nm). Bermejo et al, (2002) reportaron el uso de la relación de las absorbancias a 545 y 280nm como una estimación de la pureza de BFE, debido a que el espectro de absorción de esta proteína exhibe un pico a 545nm. Bajo estas circunstancias una relación de estas absorbancias superior a 4.0 corresponde a BFE de alta pureza (definida como BFE comercialmente pura; Sigma Chemicals). La concentración de BFE y las proteínas intracelulares adicionales, R-ficocianina (RFC) y aloficocianina (AFC), producida por Porphyridium cruentum se estima mediante el uso de las absorbancias a 565, 620 y 650nm obtenidas y un sistema de ecuación previamente reportado (Bermejo et al, 2002; Bennet y Bogorad, 1973). El fundamento de estas ecuaciones se basa en el coeficiente de extinción constante que estas ficobiliproteinas (RFC, AFC y BFE) presentan en longitudes de onda de 565, 620 y 650, al encontrarse dentro de un rango de densidad óptica (OD) de 0.05-1 .0 (Bennet y Bogorad, 1973). Para las lecturas de absorbancia, se puede utilizar un espectrofotómetro con rango de operación en el espectro ultravioleta-visible.

Ejemplo 1: Proceso propuesto para la recuperación y purificación de BFE producida por Porphyridium cruentum En referencia a la Figura 1 , Porphyridium cruentum es cultivado en un bioreactor (1 ) bajo condiciones previamente reportadas. Mediante centrifugación la biomasa ( 101 ) es separada del medio de cultivo gastado (102). A la biomasa se le agrega agua destilada (201 ) y se lleva a cabo la ruptura celular mecánica (2) de la microalga. El pH del homogenizado resultante de la ruptura, el cual consiste en la proteína de interés (BFE) y contaminantes (incluyendo restos celulares), es ajustado a 3.5 - 4.5 mediante la adición de HC1 (0.1 - 1.0 N) para llevar a cabo la precipitación isoeléctrica (3). El precipitado resultante (301 , el cual consiste en BFE, restos celulares y otras proteínas con pl similar a BFE) es recuperado, mientras que el sobrenadante (302), pobre en BFE, es eliminado. El precipitado isoeléctrico es resuspendido en buffer de fosfatos (20 mM pH 7) y alimentado a los sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio (4). Una vez agregado el precipitado se mezcla el sistema y se lleva a cabo la separación de las fases mediante sedimentación o centrifugación. La fase superior (401 , conteniendo BFE) es recuperada, mientras que la fase inferior (402) es retirada. La fase superior recuperada (401 ) es ultrafiltrada (5) utilizando una membrana de 10 kilodaltones de tamaño de poro, para de dicha manera separar el polímero (501 , el cual pasa a través de la membrana de ultrafiltración) de la BFE (502, la cual es retenida en la membrana). La BFE obtenida mediante este proceso tiene pureza analítica.

Ejemplo 2: Ruptura celular para la liberación del colorante proteico En referencia particular a la Figura 2, las proteínas colorantes intracelulares (BFE, AFC y RFC) producidas por Porphyridium cruentum fueron liberadas por los métodos de ruptura celular por maceración manual y por sonicación. La biomasa producida por el cultivo de Porphyridium cruentum fue recuperada por centrifugación a 5 g por 5 min. La ruptura celular por maceración manual se realizó en un mortero cerámico pre-enfriado en un baño de hielo. El mortero fue adicionado con biomasa húmeda, y por cada gramo de biomasa utilizada, se agregaron 4 cm3 de agua bidestilada y 0.98 g de polvo de vidrio. El tiempo de maceración se estimó considerando la cantidad de biomasa húmeda utilizada, siendo este de 15 min por gramo. La ruptura celular por sonicación se realizó utilizando un sonicador Branson 1510. Se agregaron 5 gramos de biomasa húmeda en un tubo de vidrio con capacidad de 50 cm3. A la biomasa húmeda se le agregaron 20 cm3 de agua destilada. La mezcla se agitó para suspender las células. Se introdujo el tubo de vidrio en el sonicador. Se sometió la suspensión de células a sonicación por 50 minutos. El análisis del homogenizado celular resultante mostró una concentración de BFE liberada mediante sonicación fue 5.5 veces mayor a la obtenida mediante maceración manual. Considerando un volumen total de extracto crudo de 25 cm3 (con una densidad aproximada de 1.2 g/cm3), se logran obtener 5.5 mg de BFE. La pureza de BFE obtenida en el extracto crudo fue de 0.7 (Abs 545nm/280nm = 0.7). Las concentraciones de B-fícoeritrina (BFE), R-ficocianina (RFC) y aloficocianina (AFC) fueron estimadas utilizando el sistema de ecuaciones reportado por Bermejo et al, 2002.

Ejemplo 3: Precipitación isoeléctrica del extracto de BFE Se prepararon 50 cm3 de extracto crudo de BFE (con una concentración de 0.2 mg BFE/cm3) y se separaron en alícuotas de 1.5 cm3 en tubos para microcentrífuga. El contenido de diferentes tubos fue ajustado a diferente pH (1 .5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5) para determinar a que valor ocurría la precipitación isoeléctrica. El pH se ajustó utilizando HC1 (0.1 N). Cada tubo fue agitado y posteriormente se dejó reposar 10 min para que la aglomeración de BFE tomara lugar. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación a 10 g por 20 min. Una vez llevada a cabo la centrifugación el sobrenadante fue eliminado. El precipitado fue resuspendido en 1.5 cm3 de buffer de fosfatos (20 mM, pH 7.0). Se estimó la concentración de BFE en el extracto crudo resuspendido, así como la pureza de BFE (Abs 545nm/280nm) pará cada valor de pH. Se determinó que el extracto resuspendido logra una mayor pureza cuando se ajusta el pH entre 3.5 y 4.5 (ver Figura 3). El porcentaje de recuperación de BFE relacionado con la etapa de precipitación isoeléctrica es 78% aproximadamente.

Ejemplo 4: Purificación del precipitado de BPE utilizando sistemas de dos fases acuosas Para construir un sistema de dos fases acuosas de 50g de peso total (29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, 40% p/p precipitado resuspendido BFE) en un tubo de plástico cónico con capacidad de 50 cm3 se mezclaron 18.1 g de solución PEG 1000 g/gmol (80% p/p), 1 1.3 g de solución de fosfato de potasio (40% p/p), 20.0 g de extracto resuspendido (obtenido mediante precipitación isoeléctrica) y 0.6 g de agua destilada. El contenido del tubo se agitó enérgicamente por 10 minutos y posteriormente se llevó a cabo una centrifugación a 5 g por 5 min. Posteriormente la fase superior del sistema se recuperó (volumen total de fase superior recuperada de 39 cm3). La concentración de BFE en la fase superior del sistema fue de 0.055 mg/cm3, dando una masa total de BFE en fase superior de 2.14 mg. Debido a que se alimentaron 2.33 mg de BFE en el sistema se tuvo una recuperación del 92% de BFE en la fase superior del sistema de dos fases acuosas. La pureza de BFE en la fase superior del sistema fue de 4.1 (pureza grado analítico, aceptable para aplicaciones en biología molecular). La recuperación global de BFE del proceso (considerando las pérdidas durante la precipitación isoeléctrica y en el sistema de dos fases acuosas) es aproximadamente 72%. En la Tabla 2 se pueden observar los rendimientos de las etapas de ruptura celular, precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas, así como el rango de pureza de BFE obtenido en cada una de ellas.

Tabla 2. Rendimientos de las etapas de la ruptura celular Rendimiento Etap ra de p rroceso R (aA"bs 5"45 pnmu/A^bzs 2a8n0BnmF,)E Rendimiento etap ra acumulado Ruptura celular Q 6 _ Q 8 m% (sonicacion) Precipitación 1 6 _ 2 Q y8% 78% Isoeléctrica (pH 4) Sistemas de Dos 4.0 - 4.2 92% 72% Fases Acuosas

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas 1. Un método para recuperar y purificar B-ficoeritrina por Porphyridium cruentum que comprende los siguientes pasos: (a) someter el caldo de fermentación proveniente del cultivo de Porphyridium cruentum a centrifugación para remover el medio de cultivo liquido y por consiguiente producir biomasa húmeda. (b) someter la biomasa húmeda a ruptura celular mecánica para liberar el colorante intracelular B-ficoeritrina (BFE) y por consiguiente producir un extracto crudo de BFE. (c) someter el extracto crudo de BFE a recuperación primaria por precipitación isoeléctrica para de esa forma eliminar proteínas contaminantes cuyos puntos isoeléctricos sean diferentes al de BFE y por consiguiente producir un precipitado de BFE. (d) someter el precipitado BFE a una purificación utilizando sistemas de dos fases acuosas polietilénglicol - fosfato de potasio y por consiguiente producir BFE purificada (Abs 545nm/280nm > 4). (e) someter el purificado de BFE a ultrafiltración a fin de remover el polietilén glicol de la BFE y por consiguiente producir BFE purificada libre de polímero.
2. 2. El método de la reinvindicación 1 omitiendo el paso (c), (d) y (e) para de esa forma obtener B-ficoeritrina con una pureza menor a la analítica (Abs 545nm/280nm < 4), la cual puede ser utilizada en aplicaciones relacionadas con la industria alimentaria, cosmética y de detergentes.
3. 3. El método de la reinvindicación 1 donde el extracto crudo de BFE producido por el paso (b) es sujeto a una etapa de centrifugación previo al paso (c).
4. 4. El método de la reinvindicación 2 donde el extracto crudo de BFE producido por el paso (b) es sujeto a una etapa de centrifugación.
5. 5. El método de la reinvidicación 3 que además contempla los pasos (d) y (e).
6. 6. El método de la reinvindicación 1 donde el paso (b) es repetido cuando menos una vez antes de proceder al paso (c).
7. 7. El método de la reinvidicación 1 donde el paso (d) es repetido cuando menos una vez antes de proceder al paso (e).
8. 8. El método de la reinvidicación 6 que además contempla los pasos (d) y (e).
9. 9. El método de la reinvidicación 1 donde cuando menos uno de los pasos de (a) hasta (e) es llevado a cabo con operaciones unitarias continúas.
10. 10. El método de la reinvidicación 1 donde todos los pasos de (a) hasta (e) son llevados a cabo con operaciones unitarias continúas.