CN105859911B - 一种透明质酸分离纯化的方法 - Google Patents

一种透明质酸分离纯化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种透明质酸的分离纯化方法，该方法主要包括以下步骤：发酵液经预处理后进行乙醇沉淀、沉淀物溶解，溶解液进行乙醇分级沉淀除杂，再经活性炭脱色与乙醇沉淀，沉淀物干燥后即可得到透明质酸成品。该方法工艺简单，特别能有效去除易造成堵膜现象的菌体悬浮残渣、蛋白、粘稠的大分子颗粒等杂质，该工艺过程中无有毒害物引入，在透明质酸工业化生产中具有很强的可行性。

Description

一种透明质酸分离纯化的方法
技术领域
本发明涉及透明质酸的分离纯化的方法，尤其涉及乙醇分级沉淀纯化透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是一种线性大分子黏多糖，透明质酸广泛存在于各种组织细胞间质中，如皮肤，脐带，关节滑液，软骨，眼玻璃体，卵细胞，血管壁等。在不同的组织中的HA的生理作用也有所不同，在皮肤中主要表现为保水作用，在关节滑液中主要为润滑作用，在血管壁中主要调节通透性，在结缔组织中，透明质酸可以与蛋白结合成分子量更大的蛋白多糖分子，它是保持疏松结缔组中水分的重要成分。基于透明质酸具有良好的保湿性和增强皮肤组织弹性功能，在国际上被公认为是一种生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域(帕提古丽.透明质酸国内外生产现状及应用前景分析，新疆石油科技，2012，22：66-68)。
目前，透明质酸常用的制备技术主要有两种。一种是利用天然原料，即动物组织中提取，主要的原料是人的脐带，鸡冠和牛眼玻璃体等。用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水、风干后，用蒸馏水浸泡、过滤，再以氯化钠溶液和氯仿溶液处理，之后加以胰蛋白酶保温后得到混合液，最后以离子交换剂等方法进行精制纯化，得到精制透明质酸。该方法的提取率极低，仅为1％左右，另外，该方法利用动物原料提取透明质酸，由于原料资源有限，制备成本较高。另一种是利用生物发酵法制备。生物发酵法制备透明质酸具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等优点，目前已得到广泛使用，并已成为研究HA生产的主要方向，正逐步取代从动物组织中分离提取HA的传统方法。目前，应用于医药、化妆品等领域的透明质酸主要由微生物发酵生产。
从发酵液中分离纯化透明质酸是发酵法生产透明质酸的关键步骤之一。透明质酸发酵液中的菌体残渣、蛋白质、大分子悬浮物、小分子杂多糖等杂质的存在给透明质酸的提取和精制带来极大的困难，同时也降低了透明质酸的品质，限制了其应用范围。目前报道的去除HA发酵液中的菌体残渣、大分子悬浮物和蛋白质等杂质的方法有膜过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等。膜过滤法具有设备简单、操作方便、实验重复性好等优点，但提取效率相对较低，因为透明质酸发酵液通常比较粘稠，发酵液中悬浮杂质、菌体残渣等易造成堵膜现象，影响提取效率和工艺成本。凝胶层析是基于分离组分之间的分子量大小不同而起到分离效果，有利于分离去除发酵液中与透明质酸性质相似的小分子杂多糖、蛋白质等杂质，但凝胶层析方法成本较高，且分离纯化的透明质酸的提取率也较低。离子交换层析法存在操作不稳定的问题，不易实现工业化。因此，开发高效的、过程简单的、容易操作的透明质酸分离纯化方法十分必要。
乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色，从而提高HA产品品质。乙醇沉淀法工艺简单易于实现工业化生产，目前国内外大多数企业在透明质酸工业化生产工艺中均用到了乙醇沉淀方法。如公开号为CN 101633701A公开的《一种透明质酸的纯化方法》采用的2倍乙醇沉淀透明质酸，公开号为CN 101357955A公开的《一种发酵液中提取透明质酸的方法》采用的3倍乙醇沉淀透明质酸。然而，乙醇沉淀不仅能够沉淀透明质酸，也能够沉淀透明质酸发酵液中其他很多的杂质组分如蛋白、悬浮杂质、大分子颗粒，杂多糖等，盲目的向发酵液中加入乙醇沉淀透明质酸，只会使透明质酸分离效果很差，不能有效的分离发酵液中易堵膜的悬浮杂质、大分子颗粒、菌体残渣、蛋白等杂质，增加了后续透明质酸精制纯化的工艺操作。迄今为止，国内外文献与专利中报道的透明质酸纯化工艺在乙醇沉淀步骤中均未实现透明质酸与易堵膜的悬浮杂质、大分子颗粒、菌体残渣、蛋白等杂质很好的分离。
分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加入与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。在透明质酸发酵液中分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，可以达到逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽，通过合理的控制乙醇加入量，实现易堵膜的悬浮杂质、蛋白、粘稠的大分子颗粒、小分子杂多糖等杂质与透明质酸的有效分离。
发明内容
本发明根据上述技术背景的不足，提供了一种透明质酸的分离纯化工艺，该工艺方法简单、成本低廉，可以有效去除易造成堵膜现象的菌体悬浮残渣、大部分蛋白、粘稠的大分子颗粒等杂质。
本发明提供了一种透明质酸的纯化方法，包含以下步骤：
(1)发酵液中加入CaCl2进行絮凝预处理；
(2)乙醇沉淀、沉淀物溶解；
(3)乙醇对溶解液进行分级沉淀；
(4)活性炭脱色除杂；
(5)乙醇沉淀、干燥。
在一些实施方案中，向发酵液中加入0.1～0.5％(w/v)的CaCl2进行絮凝预处理。
在一些实施方案中，步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)中使用的乙醇为95％乙醇或无水乙醇。
在一些实施方案中，步骤(2)和步骤(5)加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％。
在一些实施方案中，使用乙醇进行分级沉淀，即先向预处理的发酵液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行醇沉除杂，离心或过滤弃除沉淀物杂质后，上清液或滤液中加入0.5～1.5％(w/v)的无机盐固体粉末，搅拌至溶解后，再向溶液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，收集透明质酸沉淀物。
在一些实施方案中，步骤(4)中使用1～10％(w/v)的活性炭脱色除杂。
在一些实施方案中，步骤(2)中沉淀物溶解，即用纯化水或无机盐溶液溶解沉淀，使溶解液的电导值为0～10mS/cm。
在一些实施方案中，无机盐为NaCl、KCl或MgCl2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种透明质酸的纯化方法，包含以下步骤：
(a)向发酵液中加入0.1～0.5％(w/v)的CaCl2进行絮凝预处理，弃除菌体残渣，得清液；
(b)向清液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，沉淀物使用纯化水溶解；
(c)向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行醇沉，离心或过滤弃除沉淀物杂质，上清液或滤液中加入0.5～1.5％(w/v)的无机盐固体粉末，搅拌至溶解后，再向溶液中加乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，收集透明质酸沉淀物，沉淀物使用纯化水进行溶解；
(d)沉淀溶解后，使用无机盐调节溶解液的电导至15～30mS/cm；
(e)使用1～10％(w/v)的活性炭对溶解液进行脱色，抽滤去除活性炭，得滤液；
(f)向滤液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行沉淀，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤；
(g)沉淀物在30～80℃条件下真空干燥即可。
在一些实施方案中，向发酵液中加入0.1～0.5％(w/v)的CaCl2进行絮凝预处理。
在一些实施方案中，步骤(b)、步骤(c)和步骤(f)使用的乙醇为95％乙醇或无水乙醇。
在一些实施方案中，步骤(b)、步骤(f)加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％。
在一些实施方案中，步骤(c)使用乙醇对溶解液进行乙醇分级沉淀，即先向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行醇沉除杂，离心或过滤弃除沉淀物杂质后，上清液或滤液中加入0.5～1.5％(w/v)的无机盐固体粉末，搅拌至溶解后，再向溶液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，收集透明质酸沉淀物，沉淀物使用纯化水进行溶解。
在一些实施方案中，步骤(c)和步骤(d)使用的无机盐为NaCl、KCl或MgCl2。
在一些实施方案中，步骤(d)使用无机盐调节溶液的电导至15～30mS/cm。
在一些实施方案中，步骤(e)使用1～10％(w/v)的活性炭进行脱色。
在一些实施方案中，步骤(g)的沉淀物在30～80℃条件下真空干燥。
本发明有益效果在于：
本发明提供的对透明质酸发酵液分离纯化方法，采用简单、易行的乙醇分级沉淀处理，可以有效去除易造成堵膜现象的菌体悬浮残渣、大部分蛋白、粘稠的大分子颗粒等杂质，同时，乙醇分级沉淀处理过程中通过调节发酵液的电导，又可保证较高的透明质酸的收率。
本发明提供的透明质酸发酵液分离纯化方法为清洁生产工艺，无添加任何毒害物质，生产的成品因此更加安全、环保。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。
本发明中使用的透明质酸发酵液由东阳光研究院采用以枯草芽孢杆菌为宿主菌构建的工程菌株发酵罐发酵提供。
实施例中透明质酸干燥物的纯度采用咔唑显色法测定(参考2015年玻璃酸钠药典)，蛋白含量照蛋白含量测定法(中国药典2010年版二部附录ⅦM第二法)，透明质酸的分子量采用凝胶色谱法测定(参考2015年玻璃酸钠药典)，纯化收率的计算公式为：
下面简写词的使用贯穿本发明：
CaCl2 氯化钙
NaCl 氯化钠
MgCl2 氯化镁
％ 百分比
w/v 质量/体积，或质量相对于体积的含量
℃ 摄氏度
g 克
L 升
mL 毫升
g/L 克/升
min 分钟
h 小时
rpm 转/分钟
实施例1.
(1)取透明质酸发酵液500mL，加0.5％(w/v)CaCl2，充分溶解后3900rpm、20min离心去除菌体残渣，得上清液；
(2)向上清液中加入无水乙醇至溶液的乙醇浓度为60％进行醇沉，沉淀物使用等体积纯化水溶解；
(3)先向溶解液中缓慢加入无水乙醇至溶液的乙醇浓度为25％，边加边搅拌，3900rpm、20min离心弃除沉淀物，上清液中加入1.5％(w/v)的NaCl固体粉末，搅拌至完全溶解；再缓慢加入无水乙醇至溶液的乙醇浓度为60％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，用等体积水溶解沉淀物；
(4)向溶解液中加NaCl调节溶解液电导至30mS/cm；
(5)再向溶解液中加入10％(w/v)303A活性炭搅拌10min，抽滤弃去活性炭；
(6)向滤液中缓慢加入无水乙醇至溶液的乙醇浓度为60％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，沉淀物加入100mL无水乙醇进行洗涤；
(7)在30℃下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
第(5)步抽滤过程中没有堵塞现象，得到的HA干燥物的纯度、蛋白含量、透明质酸分子量及工艺收率的测定与计算结果如表1所示。
实施例2.
(1)取透明质酸发酵液500mL，加0.1％(w/v)CaCl2，充分溶解后，抽滤去除菌体残渣，得滤液；
(2)向滤液中加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为70％进行醇沉，沉淀物使用等体积纯化水溶解；
(3)先向溶解液中缓慢加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为50％，边加边搅拌，抽滤去除沉淀物杂质，滤液中加入1.5％(w/v)的KCl固体粉末，搅拌至完全溶解；再加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为70％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，用等体积水溶解沉淀物；
(4)向溶解液中加KCl调节溶解液电导至15mS/cm；
(5)再向溶解液中加入1％(w/v)303A活性炭搅拌处理10min，抽滤弃去活性炭；
(6)向滤液中缓慢加入95％乙醇至溶液酒精度为70％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，沉淀物用100mL 95％乙醇进行洗涤；
(7)在80℃下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
得到的HA干燥物的纯度、蛋白含量、透明质酸分子量及工艺收率的测定与计算结果如表1所示。
实施例3.
(1)取透明质酸发酵液1L，加0.5％(w/v)CaCl2，充分溶解后，3900rpm、20min离心去除菌体残渣，得上清液；
(2)向上清液中加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为65％进行醇沉，沉淀物使用等体积纯化水溶解；
(3)先向溶解液中缓慢加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为40％，边加边搅拌，3900rpm、20min离心去除沉淀物杂质，上清液中加入1.5％(w/v)的MgCl2固体粉末，搅拌至完全溶解；再向过滤后的滤液中缓慢加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为65％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，用等体积水溶解沉淀物；
(4)向溶解液中加MgCl2调节溶解液电导至25mS/cm；
(5)再向溶解液中加入6％(w/v)303A活性炭搅拌处理10min，抽滤弃去活性炭；
(6)向滤液中缓慢加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为65％，边加边搅拌，4℃下静置2h后分离沉淀物，沉淀物用100mL 95％乙醇进行洗涤；
(7)在50℃下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
得到的HA干燥物的纯度、蛋白含量、透明质酸分子量及工艺收率的测定与计算结果如表1所示。
对比实施例1.
如实施例1所述透明质酸分离纯化方法，考察乙醇分级沉淀除杂时发酵液的电导对乙醇分级沉淀及终产品的影响，其区别在于加入乙醇进行分级沉淀前，分别用NaCl调节发酵液的电导至2mS/cm、5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm及25mS/cm。得到的干燥物的纯度、蛋白含量、透明质酸分子量及工艺收率的测定与计算结果如表2所示。
结果表明，发酵液的电导对透明质酸的收率有一定的影响。当加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行沉淀分离杂质时，如果发酵液电导过高，发酵液中部分的透明质酸也随大分子颗粒、杂多糖等悬浮杂质一起沉淀下来，造成收率下降，而发酵液低电导条件下，透明质酸不易沉淀下来，透明质酸保持较高的收率。
对比实施例2.
如实施例1所述透明质酸分离纯化方法，考察不使用乙醇分级沉淀对终产品品质的影响，其区别在于向第(2)步得到的溶解液中加入1.5％(w/v)的NaCl固体粉末，第(3)步的乙醇分级沉淀改为直接加入无水乙醇至溶液乙醇浓度为60％沉淀。得到的干燥物的纯度仅为56.32％、蛋白含量为0.67％、透明质酸分子量为1.3×106及工艺收率为70.86％。操作过程中第(5)步抽滤速度很慢，膜堵塞严重，主要原因是发酵液中未去除的悬浮杂质堵膜造成。
表1透明质酸纯度、分子量及蛋白含量测定结果
实施例 透明质酸含量(％) 蛋白含量(％) 分子量(Da) 收率(％)
实施例1 93.42 0.047 1.4×106 76.91
实施例2 92.35 0.052 1.3×106 72.76
实施例3 92.48 0.048 1.4×106 78.15
表2溶液的电导对乙醇分级沉淀效果影响
发酵液电导(mS/cm) 透明质酸含量(％) 蛋白含量(％) 分子量(Da) 收率(％)
2 90.42 0.046 1.5×106 76.89
5 92.35 0.037 1.4×106 76.67
10 93.36 0.042 1.4×106 74.27
15 95.21 0.061 1.6×106 65.45
25 92.15 0.023 1.3×106 63.56

Claims (6)

1.一种透明质酸的分离纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)发酵液中加入CaCl2进行絮凝预处理；
(2)乙醇沉淀、沉淀物溶解；
(3)乙醇对溶解液进行分级沉淀：先向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行醇沉除杂，离心或过滤弃除沉淀物杂质后，上清液或滤液中加入0.5～1.5％(w/v)的无机盐固体粉末，搅拌至溶解后，再加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，收集透明质酸沉淀物；
(4)活性炭脱色除杂；
(5)乙醇沉淀、干燥。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，向发酵液中加入0.1～0.5％(w/v)的CaCl2进行絮凝预处理。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(5)加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中使用1～10％(w/v)的活性炭脱色除杂。
5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：
(a)向发酵液中加入0.1～0.5％(w/v)的CaCl2进行絮凝预处理，弃除菌体残渣，得清液；
(b)向清液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，沉淀物使用纯化水溶解；
(c)向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇浓度为25％-50％进行醇沉，离心或过滤弃除沉淀物杂质后，上清液或滤液中加入0.5～1.5％(w/v)的无机盐固体粉末，搅拌至溶解后，再加入乙醇至溶液的乙醇浓度为60％-70％进行醇沉，收集透明质酸沉淀物，沉淀物使用纯化水进行溶解；
(d)沉淀溶解后，使用无机盐调节溶解液的电导至15～30mS/cm；
(e)使用1～10％(w/v)的活性炭对溶解液进行脱色，抽滤去除活性炭，得滤液；
(f)向滤液中加入乙醇至溶液乙醇浓度为60％-70％进行沉淀，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤；
(g)沉淀物在30～80℃条件下真空干燥即可。
6.根据权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(c)和步骤(d)中的无机盐为NaCl、KCl或MgCl2。
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