CN110577608B

CN110577608B - 分离纯化透明质酸的方法

Info

Publication number: CN110577608B
Application number: CN201910597789.6A
Authority: CN
Inventors: 石江水; 王海刚; 林桂梅; 黄小龙; 肖文龙; 马雷磊; 屈代鑫; 鲍素敏; 邹兵; 谢文平; 李文佳
Original assignee: Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yichang dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: CN110577608A

Abstract

本发明提出了一种分离纯化透明质酸的方法。该方法包括将待处理透明质酸样品进行硫酸铵分级沉淀处理，以便获得透明质酸。该方法彻底解决了小分子杂质问题，且制备的透明质酸成品的蛋白残留可降至0.025％以下，极大提高了产品质量与市场竞争力。

Description

分离纯化透明质酸的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及分离纯化透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸参与许多重要的生物学过程，可广泛应用于眼科学、整形手术和化妆品等领域。目前，工业上普遍采用弱化溶血性等毒性的C型链球菌来生产透明质酸。但由于其遗传不稳定性和复杂的处理手段，存在着很大的不确定性和潜在的未知因素等一系列问题，给C型链球菌发酵生产透明质酸带来不确定因素。以合成生物学的理论为基础，以遗传稳定、背景清晰、生物安全性高的微生物作为底盘细胞，利用基因工程方法，构建新的代谢途径，使其能够合成透明质酸，逐渐成为微生物法合成透明质酸的研究方向。枯草芽孢杆菌作为基因工程菌具有超强稳定性的重组表达质粒、不产致热致敏蛋白和毒素、超强的分泌系统合成产物可以通过特殊机制输送到胞外、不存在外源基因序列含有的稀有密码子而导致表达量低或提前终止翻译等情况、发酵条件简单等优势。因而得到普遍广泛的应用。

透明质酸含量与蛋白杂质残留是产品的关键指标，对产品的应用起非常关键的作用，特别是在医药及医美上的应用。对此，医用级透明质酸对含量与蛋白等杂质残留有明确严格的要求，如欧洲药典要求透明质酸含量应不低于95.0％，日本药典要求蛋白残留不超过0.05％。枯草芽孢杆菌在表达透明质酸的同时，相应的会产生与目标物性质相似的杂质，如发酵未反应完的残糖、小分子杂糖、蛋白质、核酸、细胞碎片等，这些杂质影响最终透明质酸含量与产品质量。目前针对枯草芽孢杆菌发酵液中分离纯化透明质酸相关报道较少。如专利CN1662656A公布的二价盐絮凝纯化枯草芽孢杆菌发酵液中透明质酸的方法，该方法叙述的是一种发酵液的预处理方法，可以有助于降低大分子颗粒及悬浮物含量，提高发酵液的后续精制纯化效率，但不能从根本上解决发酵液中小分子杂质及蛋白残留的问题。

因此，如何从根本上解决透明质酸中小分子杂质和蛋白残留的问题，是科研工作者拭待解决的关键问题。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人在分离纯化透明质酸的方法的开发过程中，意外地发现，采用硫酸铵对透明质酸溶液进行分级沉淀，可以大大降低透明质酸中的蛋白和小分子残留。一方面，针对水溶性较差的杂质，醇沉后的复溶液中加入硫酸铵至一定浓度，可使溶液中的这部分杂质如蛋白、核酸等溶解度降低而沉淀析出，沉淀析出后再通过过滤即可去除。另外一方面，水溶性较好的杂质，通过进一步加大硫酸铵浓度至透明质酸钠完全沉淀析出，而大部分杂质在此条件下存在于上清液中，从而实现与水溶性更大的杂质分离。通过硫酸铵分级沉淀处理枯草芽孢杆菌发酵液，可彻底解决小分子杂质问题，且制备的透明质酸成品的蛋白残留可降至0.025％以下，极大提高了产品质量与市场竞争力。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离纯化透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将待处理透明质酸样品进行硫酸铵分级沉淀处理，以便获得透明质酸。根据本发明实施例的方法，彻底解决了小分子杂质问题，且制备的透明质酸成品的蛋白残留可降至0.025％以下，极大提高了产品质量与市场竞争力。

根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述分级沉淀处理包括至少两级沉淀处理。进而可通过调节硫酸铵在分级沉淀体系中的浓度，实现溶解度较低的大分子杂质和溶解度较大的小分子杂质与透明质酸的分离。

根据本发明的实施例，包括两级沉淀处理。发明人发现，经过两级沉淀处理后，透明质酸的纯度已达到98.5％以上，且回收率与现在技术相当。因此，采用两级分级沉淀处理可在保证产品回收率的前提下，有效提高保证产品的纯度。

根据本发明的实施例，所述分级沉淀处理包括第一级沉淀处理和第二级沉淀处理，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的浓度为45～52％(质量体积比，g/mL)，优选45～50％，更优选50％，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的浓度为60～70％(质量体积比，g/mL)，优选62.5％～70％，更优选62.5％。

发明人发现，在第一级沉淀处理过程中，当硫酸铵浓度小于45％时，透明质酸产品中出现小分子杂质峰，当硫酸铵浓度在≥55％时，硫酸铵一级沉淀开始有透明质酸产物析出，透明质酸回收率出现急剧下降。在第二级沉淀处理过程中，当硫酸铵浓度达到70％时，硫酸铵溶解饱和，硫酸铵盐晶体析出；当硫酸铵浓度小于60％时，透明质酸的回收率降低。综合以上因素，一级沉淀硫酸铵的浓度控制在45～52％，二级沉淀硫酸铵的浓度适宜控制在60％～70％，可在保证透明质酸高回收率(≥80％)的前提下，最大限度地控制透明质酸产品中的蛋白残留，克服小分子残留问题。

根据本发明的实施例，所述第一级沉淀处理是通过如下方式进行的：将所述待处理透明质酸样品与所述硫酸铵进行第一接触，以便获得第一级沉淀处理体系；将所述第一级沉淀处理体系进行第一过滤处理，以便获得滤液。在第一级沉淀处理过程中，通过调整硫酸铵的浓度，可使溶解度较小的大分子杂质如蛋白、核酸沉淀出来，进而通过过滤，将溶解度较小的大分子杂质去除。

根据本发明的实施例，所述第二级沉淀处理是通过如下方式进行的：将第一级沉淀处理后所获得的滤液与所述硫酸铵进行第二接触，以便获得第二级沉淀处理体系；将所述第二级沉淀处理体系进行第二过滤处理，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述透明质酸。在第二级沉淀处理过程中，通过调整硫酸铵的浓度，可使透明质酸沉淀出来，而使溶解度较大的小分子杂质保留在上清液中，进而通过过滤，将溶解度较大的小分子杂质去除。

根据本发明的实施例，所述透明质酸样品是以透明质酸水溶液的形式提供的。

根据本发明的实施例，所述透明质酸样品是通过如下方式获得的：将透明质酸发酵液进行氯化钙絮凝预处理和过滤处理；将过滤处理后的滤液进行乙醇沉淀和水复溶处理，以便获得所述透明质酸样品。

根据本发明的实施例，所述透明质酸在水溶液中的浓度为1～8g/L，优选4～5g/L。

根据本发明的实施例，所述水溶液的pH为5.0～9.0，优选6.0～7.0。

根据本发明的实施例，所述分级沉淀处理是在10～40℃的条件下进行的，优选，20～30℃。

根据本发明的实施例，进一步包括将所述透明质酸进行复溶、活性炭除杂、超滤、醇沉、脱水和干燥处理，以便获得透明质酸成品。进而可进一步提高透明质酸成品的纯度。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离纯化透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将透明质酸发酵液进行氯化钙絮凝预处理和过滤处理；将过滤处理后的滤液进行乙醇沉淀和水复溶处理，以便获得所述透明质酸水溶液，透明质酸在水溶液中的浓度为1～8g/L，优选4～5g/L，水溶液的pH为5.0～9.0，优选6.0～7.0；将所述透明质酸水溶液与所述硫酸铵进行第一接触，以便获得第一级沉淀处理体系，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的浓度为45～52％，优选50％，将所述第一级沉淀处理体系进行第一过滤处理，以便获得滤液；将第一级沉淀处理后所获得的滤液与所述硫酸铵进行第二接触，以便获得第二级沉淀处理体系，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的浓度为60～70％，优选62.5％，将所述第二级沉淀处理体系进行第二过滤处理，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述透明质酸；其中，所述第一接触和第二接触是在10～40℃的条件下进行的，优选，20～30℃。根据本发明实施例的方法，通过硫酸铵分级沉淀处理枯草芽孢杆菌发酵液，彻底解决小分子杂质问题，且制备的透明质酸成品的蛋白残留可降至0.025％以下，极大提高了产品质量与市场竞争力。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括将所述透明质酸进行复溶、活性炭除杂、超滤、醇沉、脱水和干燥处理，以便获得透明质酸成品。进而可进一步提高透明质酸成品的纯度。

附图说明

图1为根据本发明实施例1的透明质酸产品的红外图谱；

图2为根据本发明实施例3的透明质酸产品的凝胶色谱(GPC)图谱；

图3为根据本发明对比实施例1的透明质酸产品的凝胶色谱(GPC)图谱；

图4为根据本发明对比实施例2的透明质酸产品的凝胶色谱(GPC)图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

1、发酵液预处理

取放罐发酵液10kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl₂(w/v，即100mL溶液中含有2g CaCl₂)，调节发酵稀释液pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为1g/L，用氢氧化钠和盐酸调节料液pH至5.0，并控制反应液的温度至10℃；

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为45％(w/v，即100mL溶液体系中含有45g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后，用0.45μm滤芯深层过滤，取滤液。

(2)硫酸铵二级沉淀：向上述滤液中继续加入硫酸铵固体至硫酸铵的终浓度为60％(w/v，即100mL溶液体系中含有60g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后静置沉淀。

(3)沉淀收集与溶解：收集上述步骤(2)的沉淀，加入上述步骤(1)中复溶液等体积的纯化水进行复溶。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品35.85g。

实施例1所制备的透明质酸产品的红外图谱如图1(下图)所示，相比于参比样本(福瑞达医用级透明质酸原料)的红外图谱(上图)，二者峰型一致。

实施例2

1、发酵液预处理

取放罐发酵液98kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl₂(w/v)，调节发酵稀释液pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为8g/L，用氢氧化钠和盐酸调节料液pH至9.0，并控制反应液的温度至40℃；

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为52％(w/v，即100mL溶液体系中含有52g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后，用板框压滤，取滤液。

(2)硫酸铵二级沉淀：向上述滤液中继续加入硫酸铵固体至硫酸铵的终浓度为70％(硫酸铵饱和浓度)(w/v，即100mL溶液体系中含有70g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后静置沉淀。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品369.78g。

实施例3

1、发酵液预处理

取放罐发酵液12kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl₂(w/v)，调节发酵稀释液pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为5.0g/L，用氢氧化钠和盐酸调节料液pH至6.0，并控制反应液的温度至25℃；

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为50％(w/v，即100mL溶液体系中含有50g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后，用0.45μm玻璃纤维滤芯过滤，取滤液。

(2)硫酸铵二级沉淀：向上述滤液中继续加入硫酸铵固体至硫酸铵的终浓度为62.5％(w/v，即100mL溶液体系中含有62.5g硫酸铵)，搅拌至完全溶解后静置沉淀。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品44.89g。

实施例3所制备的产品的凝胶色谱(GPC)图谱如图2所示。

对比实施例1(去掉硫酸铵分级沉淀步骤)

取实施例4同批次发酵液12kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl₂(w/v)，调节发酵稀释液pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为4.5g/L，经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得干燥产品52.78.g。

对比例1所制备的产品的凝胶色谱(GPC)图谱如图3所示(小分子杂质峰明显)。

对比实施例2(降低硫酸铵一级沉淀浓度)

1、发酵液预处理

取实施例3同批次发酵液12kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl₂(w/v)，调节发酵稀释液的pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为5.0g/L，用氢氧化钠和盐酸调节料液pH至6.0，并控制反应液的温度至25℃；

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为20％(w/v)，搅拌至完全溶解后，用0.45μm玻璃纤维滤芯过滤，取滤液。

(2)硫酸铵二级沉淀：向上述滤液中继续加入硫酸铵固体至硫酸铵的终浓度为62.5％(w/v)，搅拌至完全溶解后静置沉淀。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品48.20g。

对比例2所制备的产品的凝胶色谱(GPC)图谱如图4所示(有小分子杂质峰)。

对比实施例3(升高硫酸铵一级沉淀浓度)

1、发酵液预处理

取实施例3同批次发酵液12kg，加适量纯化水进行稀释，加入2％CaCl2(w/v)，调节发酵稀释液的pH 10，搅拌絮凝，离心，过滤，滤液乙醇沉淀，加入纯化水复溶至透明质酸浓度为5.0g/L，用氢氧化钠和盐酸调节料液pH至6.0，并控制反应液的温度至25℃；

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为55％(w/v)，搅拌至完全溶解后，用0.45μm玻璃纤维滤芯过滤，取滤液。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品37.79g。

对比实施例4(降低硫酸铵二级沉淀浓度)

1、发酵液预处理

2、硫酸铵分级沉淀

(1)硫酸铵一级沉淀：向上述溶液中加入硫酸铵固体至硫酸铵的浓度为50％(w/v)，搅拌至完全溶解后，用0.45μm玻璃纤维滤芯过滤，取滤液。

(2)硫酸铵二级沉淀：向上述滤液中继续加入硫酸铵固体至硫酸铵的终浓度为57.5％(w/v)，搅拌至完全溶解后静置沉淀。

3、上述步骤2的溶液经活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥，得产品39.21g。

实施例1～3和对比例1～4产品中透明质酸含量(％，质量分数)、回收率、蛋白残留(％，质量分数)和小分子杂质残留如下表1所示。

表1：实验检测的结果对比

可见，实施例1～3中所获得的透明质酸产品的纯度均达到98％以上，蛋白残留小于0.025，且没有小分子杂峰。而对比例1和2相比于实施例1～3，透明质酸纯度明显较低，且蛋白残留明显较多，依然具有小分子杂质，对比例3和4相比于实施例1～3，透明质酸回收率降低。同时对比例2～4相对于对比例1，透明质酸的纯度相对较高、蛋白残留较少。由此，可以看出，采用硫酸铵分级沉淀透明质酸，对去除透明质酸产品中的杂质如蛋白残留、提高透明质酸的纯度具有重要影响。而采用合适的硫酸铵浓度实现透明质酸的分级纯化，对提高透明质酸产品的纯度、去除透明质酸产品中的杂质、相对提高透明质酸的回收率，具有进一步的优化效果。

实施例和/或对比例中步骤3提到了后续步骤如活性炭除杂、过滤、超滤、醇沉、脱水、干燥等是目前现有技术中所公知的步骤，可根据现有技术进行操作，具体的可以如CN105859911中描述的方式操作。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种分离纯化透明质酸的方法，其特征在于，将待处理透明质酸样品进行硫酸铵分级沉淀处理，以便获得透明质酸；

所述分级沉淀处理包括第一级沉淀处理和第二级沉淀处理，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为45~52%，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为60~70%；

所述第一级沉淀处理是通过如下方式进行的：将所述待处理透明质酸样品与所述硫酸铵进行第一接触，以便获得第一级沉淀处理体系；将所述第一级沉淀处理体系进行第一过滤处理，以便获得滤液；

所述第二级沉淀处理是通过如下方式进行的：将第一级沉淀处理后所获得的滤液与所述硫酸铵进行第二接触，以便获得第二级沉淀处理体系；将所述第二级沉淀处理体系进行第二过滤处理，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述透明质酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为45~50%，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为62.5%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为50%，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为62.5%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸样品是以透明质酸水溶液的形式提供的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述透明质酸样品是通过如下方式获得的：

将透明质酸发酵液进行氯化钙絮凝预处理和过滤处理；

将过滤处理后的滤液进行乙醇沉淀和水复溶处理，以便获得所述透明质酸样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸发酵液为枯草芽孢杆菌发酵液。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述透明质酸样品在水溶液中的浓度为1~8 g/L；

所述水溶液的pH为5.0~9.0；

所述分级沉淀处理是在10~40℃的条件下进行的。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述透明质酸样品在水溶液中的浓度为4~5 g/L；

所述水溶液的pH为6.0~7.0；

所述分级沉淀处理是在20~30℃的条件下进行的。

9.一种分离纯化透明质酸的方法，其特征在于，包括：

将透明质酸发酵液进行氯化钙絮凝预处理和过滤处理；

将过滤处理后的滤液进行乙醇沉淀和水复溶处理，以便获得透明质酸样品水溶液，透明质酸样品在水溶液中的浓度为1~8 g/L，水溶液的pH为5.0~9.0；

将所述透明质酸样品水溶液与硫酸铵进行第一接触，以便获得第一级沉淀处理体系，硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为45~52%，将所述第一级沉淀处理体系进行第一过滤处理，以便获得滤液；

将第一级沉淀处理后所获得的滤液与所述硫酸铵进行第二接触，以便获得第二级沉淀处理体系，硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为60~70%，将所述第二级沉淀处理体系进行第二过滤处理，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述透明质酸；

其中，所述第一接触和第二接触是在10~40℃的条件下进行的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述透明质酸样品在水溶液中的浓度为4~5 g/L，水溶液的pH为6.0~7.0；

所述硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为45~50%；

所述硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为62.5%~70%；

所述第一接触和第二接触是在20~30℃的条件下进行的。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵在第一级沉淀处理体系中的质量体积比为50%；

所述硫酸铵在第二级沉淀处理体系中的质量体积比为62.5%。

12.根据权利要求1~11任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述透明质酸进行复溶、活性炭除杂、超滤、醇沉、脱水和干燥处理，以便获得透明质酸成品。