CN110396145A - 一种制备特定分子量透明质酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及透明质酸领域，具体涉及一种制备特定分子量透明质酸的方法。该方法首先将透明质酸发酵液在碱性溶液中进行控温降解，酸回调发酵液pH值终止降解，然后经过乙醇沉淀，洗涤，得到不同范围的特定分子量的透明质酸。本发明的方法不仅可制备得到不同范围(10～2000KD)的特定分子量的透明质酸，而且操作工艺简单，成本低，有机溶剂用量少，杂质去除效果好等优点，为不同范围的特定分子量的透明质酸的制备提供了一种新的思路。

Description

一种制备特定分子量透明质酸的方法

技术领域

本发明涉及透明质酸领域，具体涉及一种制备特定分子量透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan，HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。目前透明质酸在化妆品、保健食品和医药领域应用广泛，是良好的保湿剂、粘弹剂以及药物缓释剂。

透明质酸制备方法主要包括动物组织提取与微生物发酵提取，目前大多都采用兽疫链球菌发酵来生产制备透明质酸，它具有成本较低、提取步骤简单和产量高等优点。兽疫链球菌表达的透明质酸分子量从几十万到几百万不等，透明质酸的生物活性和使用效果与其相对分子量直接相关，当分子量大于2000KD时，透明质酸具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可用于眼科手术粘弹剂和关节腔内注射治疗；分子量在1000～2000KD的透明质酸具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连；分子量小于1000KD的透明质酸有抗肿瘤、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用；因此，根据使用目的的不同需选择合适分子量的透明质酸，制备特定分子量的透明质酸显得尤为重要(黄岳山等，不同相对分子量透明质酸功能及应用研究[J],透析与人工器官，2011,2(22):10-13)。从发酵上游来控制分子量制备指定分子量的透明质酸难度大，因此，生产上一般都从下游来控制透明质酸分子量。目前现有技术中降解透明质酸方法主要包括酶降解、酸性处理、碱性处理、物理处理等。如专利CN102876748A公布的酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用，采用透明质酸酶降解高分子量透明质酸制备寡聚透明质酸，由于透明质酸酶价格昂贵，且无法回收，不适合大规模工艺生产。又如专利CN 102648214A公开的纯化透明质酸类的制造方法，采用酸降解方法制备，将原料透明质酸溶液调节pH至3.0以下，降解透明质酸至指定分子量后，再添加水溶性有机溶剂沉淀。上述方法均是针对成品透明质酸进行降解，工艺较为繁琐，制备成本较高。

相比透明质酸成品环节控制透明质酸分子量，从发酵液提取环节进行控制透明质酸分子量的工艺相对简单，工艺成本更为低廉。如专利CN 104059166A一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法，将发酵液经醇沉、脱水、复溶、过滤后，滤液进行碱降解至一定分子量，该方法很好的将透明质酸纯化工艺与碱降解制备寡聚透明质酸方法结合一起，简化了工艺流程，但该方法不适合高粘度、高分子量与表达量的透明质酸发酵液，因高分子量与表达量高的透明质酸发酵液粘度高，对透明质酸发酵液直接醇沉，首先需要对发酵液进行稀释，醇沉的乙醇浓度高，所需乙醇用量大，极大的影响了醇沉分离杂质效果，不利于后续除杂与过滤操作。又如专利CN 105777937A一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法，将发酵液直接进行碱水解，再加入聚合物聚醚L44进行双水相萃取等分离纯化操作，可以减少乙醇用量和增加除杂效果，但该方法碱降解采用加热碱降解，没有对分子量降解进行精确的终点控制，因在降温过程15～20℃条件下，透明质酸还会持续降解，在生产上得到的通常都是小于几百KD的低分子量的透明质酸，很难精准控制得到不同范围的特定的分子量的透明质酸，另外，该方法后续的工艺过程繁琐，引用温敏性聚合物聚醚双水相萃取体系及活性炭除杂等操作，操作复杂，工艺成本高。目前现有技术中仍未有较好的方法来有效控制透明质酸降解终点用来制备不同特定分子量的透明质酸。

基于目前在制备特定分子量的透明质酸过程中存在的问题，诸如降解终点没有有效控制，无法得到不同范围的低中高特定分子量的透明质酸，工艺过程复杂、成本高等等问题，急需开发一种操作简单，有机溶剂用量小，成本低、可以有效地控制透明质酸降解的终点，并且得到不同范围的特定分子量的透明质酸的制备方法。

发明内容

本发明提供了一种制备特定分子量透明质酸的方法。该方法可任意得到低、中、高不同分子量的透明质酸，操作工艺简单，成本低，有机溶剂用量少，杂质去除效果好。本发明的上述技术目的是通过下述技术方案实现：

将透明质酸发酵液在碱性溶液中进行控温降解，待发酵液透明质酸分子量降至特定分子量后，酸回调发酵液pH值，终止降解，然后经过乙醇沉淀，洗涤，得到不同范围的特定分子量的透明质酸。

在本发明的一些实施方案中，所述的控温降解的温度为30～40℃；在本发明的一些实施方案中，所述的控温降解的温度为35℃，在本发明的一些实施方案中，所述的控温降解的温度为40℃。

在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液终浓度为0.25～0.55mol/L；在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液终浓度为0.3mol/L；在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液终浓度为0.4mol/L；在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液终浓度为0.5mol/L。

在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液包括但不限于氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液；在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液；在本发明的一些实施方案中，所述的碱性溶液为氢氧化钾溶液。

在本发明的一些实施方案中，所述的酸回调发酵液pH值至9.0～11.5；在本发明的一些实施方案中，所述的酸回调发酵液pH值至10；在本发明的一些实施方案中，所述的酸回调发酵液pH值至10.2；在本发明的一些实施方案中，所述的酸回调发酵液pH值至10.5；在本发明的一些实施方案中，所述的酸回调发酵液pH值至11。

在本发明的一些实施方案中，所述的酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、磷酸；在本发明的一些实施方案中，所述的酸是盐酸；在本发明的一些实施方案中，所述的酸是硫酸；在本发明的一些实施方案中，所述的酸是乙酸；在本发明的一些实施方案中，所述的酸是磷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇沉淀的乙醇终浓度为40～50％；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇沉淀的乙醇终浓度为45％；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇沉淀的乙醇终浓度为50％。

在本发明的一些实施方案中，一种制备特定分子量透明质酸的方法具体包括如下步骤：

(1)发酵液进行碱降解：发酵液放罐后，控制料液温度至30～40℃，向发酵液中加入碱溶液至发酵液的碱浓度为0.25～0.55mol/L；

(2)酸回调：待透明质酸分子量降至特定分子量后，向料液中加入酸回调pH至9.0～11.5，终止降解；

(3)乙醇沉淀：向步骤(2)得到的特定分子量的透明质酸发酵液中缓慢加入乙醇，至料液中乙醇浓度为40～50％(v/v)，得到含透明质酸的沉淀物，将沉淀用乙醇的盐溶液洗涤2次及以上；

(4)沉淀经复溶、板框压滤、复滤、醇沉、脱水、干燥即得成品。

在本发明的一些实施方案中，步骤(3)所述的乙醇的盐溶液为乙醇氯化钠溶液或乙醇氯化钾溶液，且盐浓度为1.5～5％(m/v)；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇的盐溶液为2％氯化钠和45％乙醇的混合洗涤溶液；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇的盐溶液为3％氯化钾和50％乙醇的混合洗涤溶液；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇的盐溶液为2.5％氯化钠和45％乙醇的混合洗涤溶液；在本发明的一些实施方案中，所述的乙醇的盐溶液为3％氯化钠和50％乙醇的混合洗涤溶液。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

1)本发明的方法在透明质酸发酵液进行碱降解后，通过酸回调至一定的pH值，对透明质酸发酵液的降解终点进行控制，相比传统的不控制或者降温控制降解终点，可准确的制备得到不同范围(10～2000KD)的特定分子量的透明质酸；

2)醇沉后的沉淀采用乙醇盐溶液进行洗涤，该方法在保证透明质酸不被损失的情况下，既分离去除更多的醇沉上清液杂质，增加了杂质去除效果，又解决了后续过滤杂质时堵膜的问题，提高了过滤的效率，相比传统的活性炭除杂操作更简单、成本更低。

附图说明

图1透明质酸标准红外图谱

图2实施例1制备得到的透明质酸的红外图谱

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1制备1400～1500KD分子量透明质酸

1)发酵液碱降解：取一批分子量为2550KD，表达量为8.0g/L的发酵液500kg转移至预处理罐，并控制料液温度至35℃，向发酵液中加入氢氧化钠溶液至料液中的碱浓度为0.3mol/L，保温降解2h，加入盐酸回调料液pH至10，终止透明质酸分子量降解。取终止降解后的料液，GPC检测分子量为1460KD；

2)乙醇沉淀及沉淀洗涤：向碱降解后的料液中缓慢加入乙醇，至料液的乙醇浓度为45％，静置沉淀，上清液抽除后，向罐内打入100L的2％氯化钠+45％乙醇的混合洗涤溶液，进行搅拌洗涤，抽除上清液后，向罐内继续打入等体积的上述洗涤液进行重复洗涤1次；

3)沉淀复溶、板框压滤、复滤、精过滤、醇沉、脱水、干燥，得到3.48kg透明质酸产品。红外图谱见图2，与图1中的透明质酸标准品红外图谱一致。

实施例2制备500～600KD分子量透明质酸

1)发酵液碱降解：取一批分子量为2630KD，表达量为7.8g/L的发酵液530kg转移至预处理罐，并控制料液温度至40℃，向发酵液中加入氢氧化钾溶液至料液中的碱浓度为0.3mol/L，保温降解4h，加入醋酸回调料液pH至11，终止透明质酸分子量降解。取终止降解后的料液，GPC检测分子量为570KD；

2)沉淀及沉淀洗涤：碱降解后的料液中缓慢加入乙醇，至料液的乙醇浓度为50％，静置沉淀，上清液抽除后，向罐内打入100L的3％氯化钾+50％乙醇的混合洗涤溶液，进行搅拌洗涤，抽除上清液后，再用等体积的上述洗涤液重复洗涤2次；

3)沉淀复溶、板框压滤、复滤、精过滤、醇沉、脱水、干燥，得到3.67kg透明质酸产品。

实施例3制备10～400KD分子量透明质酸

1)发酵液碱降解

取一批分子量为2560KD，表达量为7.8g/L的透明质酸发酵液520kg转移至预处理罐，并控制料液温度至40℃，向发酵液中加入氢氧化钠溶液至料液中的碱浓度为0.5mol/L，保温降解3h，加入磷酸回调料液pH至10.2，终止透明质酸分子量降解。取终止降解后的料液，GPC检测分子量为269KD。

2)乙醇沉淀及沉淀洗涤

向碱降解后的料液中缓慢加入乙醇，至料液的乙醇浓度为45％，静置沉淀，上清液抽除后，向罐内打入100L的3％氯化钠+50％乙醇的混合洗涤溶液，进行搅拌洗涤，抽除上清液后，再用等体积的上述洗涤液重复洗涤2次。

3)沉淀复溶、板框压滤、复滤、精过滤、醇沉、脱水、干燥，得到3.46kg透明质酸产品。

实施例4制备1400～1500KD分子量透明质酸

1)发酵液碱降解：取一批分子量为2800KD，表达量为7.2g/L的透明质酸发酵液570kg转移至预处理罐，并控制料液温度至40℃，向发酵液中加入氢氧化钠溶液至料液中的碱浓度为0.4mol/L，保温降解2.5h，加入硫酸回调料液pH至10.5，终止透明质酸分子量降解。取终止降解后的料液，GPC检测分子量为1450KD；

2)乙醇沉淀及沉淀洗涤：碱降解后的料液中缓慢加入乙醇，至料液的乙醇浓度为45％，静置沉淀，上清液抽除后，向罐内打入100L的2.5％氯化钠+45％乙醇的混合洗涤溶液，进行搅拌洗涤，抽除上清液后，再用等体积的上述洗涤液重复洗涤2次；

3)沉淀复溶、板框压滤、复滤、精过滤、醇沉、脱水、干燥，得到3.56kg透明质酸产品。

对比实施例1：制备1200KD～1500KD透明质酸，碱降解后通过降温终止降解过程

取实施例1中分子量为2550KD，表达量为8.0g/L的同批次发酵液500kg打入至预处理罐中，并控制料液温度至35℃，向发酵液中加入氢氧化钠溶液至料液中的碱浓度为0.3mol/L，保温降解2h后，降温至15℃，不采用酸回调，其他操作同实施例1。最终得到的透明质酸分子量为770KD，因在降温过程中降解过程仍在持续，故无法得到特定分子量的透明质酸，且实验过程中发现降温后料液粘度增大，醇沉时结块严重，醇沉效果很差。

对比实施例2：制备1200KD～1500KD透明质酸，碱降解后不回调pH

取实施例1中分子量为2550KD，表达量为8.0g/L的同批次发酵液500kg，碱降解后不加酸回调pH直接加乙醇沉淀，其他操作同实施例1，得到2.17kg透明质酸产品。取成品透明质酸GPC检测分子量仅为570KD。因此，如果碱降解后不回调料液pH进行透明质酸降解终点的控制，则无法得到目标分子量的透明质酸。

对比实施例3：醇沉后沉淀不洗涤

取实施例1中分子量为2550KD，表达量为8.0g/L的同批次发酵液500kg，碱降解、酸回调pH、料液经醇沉后的沉淀不洗涤，其他操作同实施例1，后续在过滤时速度较慢。得到3.45kg透明质酸产品。

对比实施例4：制备1200～1500KDa透明质酸，碱降解后酸回调pH至9以下

分别取实施例1中分子量为2550KDa，表达量为8.0g/L的同批次发酵液，碱降解后分别用酸回调pH至6与8终止降解。结果发现，料液回调后的pH越小，料液粘度越大，后续醇沉出现沉淀聚集成团现象，沉淀复溶液出现过滤操作困难。

下表是本发明及对比实施例得到的成品检测结果：

表1产品检测的结果对比

结论：透明质酸发酵液经过控温碱降解后，通过酸回调至一定的pH值，终止降解过程，然后醇沉，洗涤等步骤可得到不同分子量范围的透明质酸。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种制备特定分子量透明质酸的方法，其特征在于，将透明质酸发酵液在碱性溶液中进行控温降解，待发酵液透明质酸分子量降至特定分子量后，酸回调发酵液pH值，终止降解，然后经过乙醇沉淀，得到不同范围的特定分子量的透明质酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸回调发酵液pH值至9～11.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性溶液终浓度为0.25～0.55mol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的控温降解的温度为30～40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸包含盐酸、硫酸、乙酸、磷酸溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性溶液包含氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乙醇沉淀的乙醇终浓度为40～50％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)发酵液进行碱降解：发酵液放罐后，控制料液温度至30～40℃，向发酵液中加入高浓度碱溶液至发酵液的碱浓度为0.25～0.55mol/L；

(2)酸回调：待透明质酸分子量降至特定分子量后，向料液中加入酸回调pH至9.0～11.5，终止降解；

(3)乙醇沉淀：向步骤(2)得到的特定分子量的透明质酸发酵液中缓慢加入乙醇，至料液中乙醇浓度为40～50％，得到含透明质酸的沉淀物，将沉淀用乙醇的盐溶液洗涤2次及以上；

(4)沉淀经复溶、板框压滤、复滤、醇沉、脱水、干燥即得成品。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的乙醇的盐溶液为乙醇氯化钠溶液或乙醇氯化钾溶液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的乙醇的盐溶液，其中盐浓度为1.5～5％。