CN109970882A - 一种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，它包括多硫酸化硫酸软骨素制备、分离纯化、去甲酰胺、脱色、沉淀、冻干等步骤，本发明采用氯磺酸‑甲酰胺混合液对硫酸软骨素进行磺化、加热降解，之后醇沉、过滤、脱色等操作，进一步纯化得到可改善骨关节功能的多硫酸化硫酸软骨素。本发明将磺化和降解反应分开，先加入氯磺酸和甲酰胺进行磺化，后加热进行降解，且经过多步的醇沉和过滤，得到符合分子量、硫羧比、葡萄糖醛酸、游离硫酸盐含量等关键质量指标的多硫酸化硫酸软骨素，高度磺化的多硫酸软骨素含量高于70%，硫酸软骨素硫酸化程度高，性质稳定，不易被天然的硫酸软骨素酶降解，重均分子量Mw为7300～9300Da，具有良好的关节功能改善作用，可用于维持人和动物关节软骨完整性。

Description

一种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法

技术领域

本发明涉及多硫酸化硫酸软骨素的制备方法。

背景技术

随着世界人口进入老龄化，骨关节炎疾病，包括（Osteoarthritis, OA）的患病率不断上升，患病人群日益增多。OA会导致疼痛、疾病，严重影响患者的劳动能力。对OA的治疗目前常用非甾体类抗炎药和多硫酸类软骨保护剂。多糖类软骨保护剂一般都是肝素类药物，如多硫酸氨基聚糖、多硫酸戊糖钠、多硫酸化硫酸软骨素等。

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate, CS）是关节软骨的重要成分。OA发生时，软骨受到损害，CS含量下降。补充CS能有效缓解症状，减轻炎症区域的肿胀度减轻OA对软骨的损害；还可能降低发病率、关节温度、痛感。临床上已有CS的复方口服药物或膳食补充剂，用于骨关节炎患者的治疗和保健。但是硫酸软骨素可被天然的硫酸软骨素酶降解，如果对硫酸软骨素进行磺化，得到多硫酸化硫酸软骨素，后者不易被天然的硫酸软骨素酶所降解，性质相对稳定很多。

Petitou等人在美国专利“硫酸软骨素和硫酸皮肤素类硫酸化的硫酸软骨素类衍生物的制备”（Sulfated glycosaminoglycanoid derivatives of the dermatan sulfateand chondroitin sulfate type, 专利号US5382570）曾经公开了硫酸化硫酸软骨素的制备方法，但是该方法具有工艺复杂、试剂成本高、不利于工业化生产以及所得产物具有不同的结构和活性等特征，从而限制了其应用。

CN1789287A公开了一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法，其中公开了使用氯磺酸、浓硫酸制备多硫酸化硫酸软骨素的方法，但是由于浓硫酸具有高度危险性，操作有难度，工业生产中对设备要求高，因而应用受到限制。

在2008年山东大学袁实的硕士论文《多硫酸化硫酸软骨素的制备、性质及其口服制剂对兔膝骨关节炎的关节保护作用》中有使用氯磺酸-甲酰胺制备硫酸化硫酸软骨素的方法，但是根据实验证明，所公示的方法是磺化反应和降解反应同时进行，无法得到高度硫酸化的多硫酸化硫酸软骨素能够同时满足重均分子量Mw 7300～9300Da、游离硫酸盐含量不高于10%、硫羧比高于3且含有高度磺化的多硫酸软骨素含量高于70%。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法。

为实现本发明目的，这种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法其特征在于包括以下步骤：

a. 制备多硫酸化硫酸软骨素

在搅拌状态下，将15%～30%质量百分比浓度的硫酸软骨素甲酰胺溶液与氯磺酸和甲酰胺混合液混合后，在20～30℃下搅拌5小时，再升温至60～70℃降解后搅拌3～5小时，然后加入反应液4体积倍量的95%乙醇搅拌后静置，经固液分离后得到多硫酸化硫酸软骨素沉淀，所述氯磺酸和甲酰胺混合液中氯磺酸与硫酸软骨素的质量比为1.5～1.7:1，甲酰胺与硫酸软骨素的质量比为3～4:1；

b. 分离纯化多硫酸化软骨素

1、去甲酰胺和沉淀

将多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5～9.0，再加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置12小时后沉淀，再将固液分离后的沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5～9.0后加热至60～65℃，保温3小时后经0.45μm滤膜过滤，再将滤液加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，再静置12小时后固液分离得到去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

2、脱色

将去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀溶于10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水中后加入1%溶液量NaCl搅拌溶解，再持续加入30%过氧化氢溶液，当溶液中过氧化氢浓度为0.5%时，用20%氢氧化钠溶液调整溶液pH值为10，然后在30℃、持续搅拌下将溶液在0.05～0.10MPa的真空度下抽真空脱色12小时，过程中保持pH值10，然后再将溶液恢复常压后在20～30℃下继续静置氧化脱色12小时，得到脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液；

3、沉淀

将上述脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液经0.45µm的膜过滤后，用3M盐酸调pH值至8.0，再加入步骤a中所述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置沉淀12小时后固液分离，再将得到的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，然后加入溶液量的1%NaCl搅拌溶解后，调节溶液pH值为6.0～7.0，经0.45µm或0.22µm的膜过滤得到过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

4、冻干

将上述过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量的纯化水溶解，调节pH值6.0～7.0后经0.45µm的膜过滤后冻干，得到多硫酸化硫酸软骨素冻干品。

本发明取得的技术进步：

本发明采用氯磺酸-甲酰胺混合液对硫酸软骨素进行磺化，进而加热降解，之后进行醇沉、过滤、脱色等操作，进一步纯化得到符合质量标准的可改善骨关节功能的硫酸化硫酸软骨素。本发明使用氯磺酸和甲酰胺，相对于US5382570来说本发明所述制备方法简单、所使用的试剂成本低、可以进行工业化生产；而与CN1789287A中所述方法相比，用氯磺酸和甲酰胺替代了氯磺酸和浓硫酸，而相对具有高度危险性的浓硫酸，本发明所使用的磺化试剂氯磺酸和甲酰胺更加安全，对设备要求相对浓硫酸较低，可以在工业化生产中进行应用；而相对于《多硫酸化硫酸软骨素的制备、性质及其口服制剂对兔膝骨关节炎的关节保护作用》硕士论文中的方法，本发明将磺化反应和降解反应分开，先加入氯磺酸和甲酰胺进行磺化，后加热至60～70℃进行降解，且经过多步的醇沉和过滤步骤，能够得到符合关键质量指标（即分子量Mw在7300～9300之间、硫羧比大于3、葡萄糖醛酸含量18%～25%、游离硫酸盐含量低于10%、含量在90%～110%之间等）的纯度较高的多硫酸化硫酸软骨素，由于其高度硫酸化的多硫酸软骨素含量高于70%，硫酸软骨素硫酸化程度高，因而性质稳定，不易被天然的硫酸软骨素酶降解，且相对市场上已经销售的原研产品而言，本发明所述方法制备的产品杂质含量更低，纯度更高。总体而言，本发明具有成本低、操作性强、安全性较高、所得产品纯度高、杂质少的优势。

附图说明

图1为原研对照品的GPC检测图谱。

图2为本发明实施例1的GPC检测图谱。

图3为本发明实施例2的GPC检测图谱。

图4为本发明实施例3的GPC检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：

a. 制备多硫酸化硫酸软骨素

在装有硫酸软骨素的罐中加入甲酰胺溶液，制成含硫酸软骨素质量百分比浓度为20%的硫酸软骨素的甲酰胺溶液，向另一罐中加入1.5倍硫酸软骨素质量的氯磺酸和3倍硫酸软骨素质量的甲酰胺溶液，将氯磺酸和甲酰胺混合液混匀后，在搅拌条件下，将所得硫酸软骨素的甲酰胺溶液缓慢加入到氯磺酸和甲酰胺混和液中；然后，将反应液在30℃条件下搅拌5小时，后升温至60℃后搅拌4小时，然后加入反应液4倍体积倍量的95%乙醇搅拌后静置，静置液经固液分离后得到多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

b. 分离纯化多硫酸化软骨素

1、去甲酰胺和沉淀

将上述多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水搅拌溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至9.0，再加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置12小时后沉淀，再将固液分离后的沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至9.0后加热至60℃，保温3小时后经0.45μm滤膜过滤，再将滤液加入上述反应液4倍体积量的95%乙醇，再静置12小时后固液分离得到去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

2、脱色

将去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀溶于10倍硫酸软骨投料素质量倍量的纯化水中后，加入溶液量1%NaCl搅拌溶解，再持续加入30%过氧化氢溶液，当溶液中过氧化氢浓度为0.5%时，用20%氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为10，然后在30℃、持续搅拌下将溶液在0.05～0.10MPa的真空度下抽真空脱色12小时，过程中保持pH值10，然后再将溶液恢复常压后在25℃下继续静置氧化脱色12小时，得到脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液；

3、沉淀

将上述脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液经0.45µm的膜过滤后，用3M盐酸调pH值至8.0，再加入步骤a中所述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置沉淀12小时后固液分离，再将得到的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，然后加入溶液量的1%NaCl搅拌溶解后，调节溶液pH值为7.0，经0.45µm的膜过滤得到过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

4、冻干

将上述过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，调节pH值6.0～7.0后经0.45µm的膜过滤后冻干，冻干品取样进行溶剂残留检测，当溶剂残留低于5000ppm时得到合格的多硫酸化硫酸软骨素冻干品。

本发明多硫酸化硫酸软骨素冻干品对比检测结果：

本发明多硫酸化硫酸软骨素冻干品（批号20141202）和Luitpold Pharmaceuticals,Inc.生产的原研对照品（Adequan）（批号7127）的GPC检测图谱见图1和图2，从图1和图2的图谱分别可以看出，原研产品和按照本发明方法制得的多硫酸化硫酸软骨素冻干品（批号20141202）具有相似的峰形和面积，都在18min左右出峰。其它具体指标的检测结果见表1。从表1结果可以看出，原研产品和按照本发明方法制得的多硫酸化硫酸软骨素冻干品（批号20141202）的各项检测指标结果都符合质量标准，且本发明方法制得的冻干品硫羧比为3.4，高于原研产品结果3.2，游离硫酸盐的结果为2.5%低于原研产品结果3.2%，含量结果89.79%高于原研产品86.83%，因此本发明冻干品相对原研产品硫酸化程度更高，性质更加稳定，不易被硫酸软骨素酶降解；同时在含量、游离硫酸盐结果可以看出，本发明多硫酸化硫酸软骨素冻干品杂质更低，纯度更高。

表 1 检测结果

实施例2：

a. 制备多硫酸化的硫酸软骨素

在装有硫酸软骨素的罐中加入甲酰胺溶液，制成含硫酸软骨素质量百分比浓度为30%的硫酸软骨素的甲酰胺溶液，向另一罐中加入1.5倍硫酸软骨素质量的氯磺酸和3倍硫酸软骨素质量的甲酰胺溶液，将氯磺酸和甲酰胺混合液混匀后，在搅拌条件下，将所得硫酸软骨素的甲酰胺溶液缓慢加入到氯磺酸和甲酰胺混和液中；然后，将反应液在20℃条件下搅拌5小时，后升温至70℃后搅拌3小时，然后加入反应液4体积倍量的95%乙醇搅拌后静置，静置液经固液分离后得到多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

b. 分离纯化多硫酸化软骨素

1、去甲酰胺和沉淀

将上述多硫酸化硫酸软骨素沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水搅拌溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至8.5，再加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置12小时后沉淀，再将固液分离后的沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至8.5后加热至60℃，保温3小时后经0.45μm滤膜过滤，再将滤液加入上述反应液4倍体积量的95%乙醇，再静置12小时后固液分离得到去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

2、脱色

将去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀溶于10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水中后，加入溶液量1%NaCl搅拌溶解，再持续加入30%过氧化氢溶液，当溶液中过氧化氢浓度为0.5%时，用20%氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为10，然后在30℃、持续搅拌下将溶液在0.05～0.10MPa的真空度下抽真空脱色12小时，过程中保持pH值10，然后再将溶液恢复常压后在20℃下继续静置氧化脱色12小时，得到脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液；

3、沉淀

将上述脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液经0.45µm的膜过滤后，用3M盐酸调pH值至8.0，再加入步骤a中所述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置沉淀12小时后固液分离，再将得到的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，然后加入溶液量的1%NaCl搅拌溶解后，调节溶液pH值为6.5，经0.45µm的膜过滤得到过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

4、冻干

将上述过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，调节pH值6.0～7.0后经0.45µm的膜过滤后冻干，冻干品取样进行溶剂残留检测，当溶剂残留低于5000ppm时得到合格的多硫酸化硫酸软骨素冻干品。

本实施例多硫酸化硫酸软骨素冻干品（批号20141201）的GPC检测图谱见图3，从图3可看出，本产品在18min左右出峰。

实施例3：

a. 制备多硫酸化硫酸软骨素

在装有硫酸软骨素的罐中加入甲酰胺溶液，制成含硫酸软骨素质量百分比浓度为15%的硫酸软骨素的甲酰胺溶液，向另一罐中加入1.5倍硫酸软骨素质量的氯磺酸和3倍硫酸软骨素质量的甲酰胺溶液，将氯磺酸和甲酰胺混合液混匀后，在搅拌条件下，将所得硫酸软骨素的甲酰胺溶液缓慢加入到氯磺酸和甲酰胺混和液中；然后，将反应液在25℃条件下搅拌5小时，后升温至65℃后搅拌5小时，然后加入反应液4体积倍量的95%乙醇搅拌后静置，静置液经固液分离后得到多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

b. 分离纯化多硫酸化软骨素

1、去甲酰胺和沉淀

将上述多硫酸化硫酸软骨素沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水搅拌溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5，再加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置12小时后沉淀，再将固液分离后的沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5后加热至60℃，保温3小时后经0.45μm滤膜过滤，再将滤液加入上述反应液4倍体积量的95%乙醇，再静置12小时后固液分离得到去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

2、脱色

将去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀溶于10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水中后，加入溶液量1%NaCl搅拌溶解，再持续加入30%过氧化氢溶液，当溶液中过氧化氢浓度为0.5%时，用20%氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为10，然后在30℃、持续搅拌下将溶液在0.05～0.10MPa的真空度下抽真空脱色12小时，过程中保持pH值10，然后再将溶液恢复常压后在30℃下继续静置氧化脱色12小时，得到脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液；

3、沉淀

将上述脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液经0.45µm的膜过滤后，用3M盐酸调pH值至8.0，再加入步骤a中所述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置沉淀12小时后固液分离，再将得到的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，然后加入溶液量的1%NaCl搅拌溶解后，调节溶液pH值为6.0，经0.22µm的膜过滤得到过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

4、冻干

将上述过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，调节pH值6.0～7.0后经0.45µm的膜过滤后冻干，冻干品取样进行溶剂残留检测，当溶剂残留低于5000ppm时得到合格的多硫酸化硫酸软骨素冻干品。

本实施例多硫酸化硫酸软骨素冻干品（批号20140501）的GPC检测图谱见图4，从图4可看出，所得产品在18min左右出峰。

Claims (1)

1.一种多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a. 制备多硫酸化硫酸软骨素

在搅拌状态下，将15%～30%质量百分比浓度的硫酸软骨素甲酰胺溶液与氯磺酸和甲酰胺混合液混合后，在20～30℃下搅拌5小时，再升温至60～70℃降解后搅拌3～5小时，然后加入反应液4体积倍量的95%乙醇搅拌后静置，经固液分离后得到多硫酸化硫酸软骨素沉淀，所述氯磺酸和甲酰胺混合液中氯磺酸与硫酸软骨素的质量比为1.5～1.7:1，甲酰胺与硫酸软骨素的质量比为3～4:1；

b. 分离纯化多硫酸化软骨素

1、去甲酰胺和沉淀

将多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5～9.0，再加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置12小时后沉淀，再将固液分离后的沉淀加10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5～9.0后加热至60～65℃，保温3小时后经0.45μm滤膜过滤，再将滤液加入上述反应液4体积倍量的95%乙醇，再静置12小时后固液分离得到去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

2、脱色

将去甲酰胺的多硫酸化硫酸软骨素沉淀溶于10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水中后加入1%溶液量NaCl搅拌溶解，再持续加入30%过氧化氢溶液，当溶液中过氧化氢浓度为0.5%时，用20%氢氧化钠溶液调整溶液pH值为10，然后在30℃、持续搅拌下将溶液在0.05～0.10MPa的真空度下抽真空脱色12小时，过程中保持pH值10，然后再将溶液恢复常压后在20～30℃下继续静置氧化脱色12小时，得到脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液；

3、沉淀

将上述脱色的多硫酸化硫酸软骨素溶液经0.45µm的膜过滤后，用3M盐酸调pH值至8.0，再加入步骤a中所述反应液4体积倍量的95%乙醇，静置沉淀12小时后固液分离，再将得到的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量倍量的纯化水溶解，然后加入溶液量的1%NaCl搅拌溶解后，调节溶液pH值为6.0～7.0，经0.45µm或0.22µm的膜过滤得到过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀；

4、冻干

将上述过滤后的多硫酸化硫酸软骨素沉淀加入10倍硫酸软骨素投料质量的纯化水溶解，调节pH值6.0～7.0后经0.45µm的膜过滤后冻干，得到多硫酸化硫酸软骨素冻干品。