CN105820271A - 一种规模化小分子透明质酸钠的制备和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种规模化小分子透明质酸钠的制备和纯化方法，将大分子透明质酸钠溶解在碱性水溶液中，高温降解获得小分子透明质酸钠降解液；然后超滤获得目的分子量范围的小分子透明质酸钠。本发明的方法不仅可以严格控制透明质酸在降解后生成稳定的透明质酸盐，使得透明质酸更加稳定，而且可以严格控制透明质酸分子量的范围。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体地说，本发明涉及一种规模化小分子透明质酸钠的制备和纯化方法。
背景技术
透明质酸及其盐(hyaluronateacid，简称HA),在自然界中广泛存在，是人和动物皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要组成部分，是由(1-β-4)D-葡萄糖醛酸(1-β-3)N乙酰氨基葡萄糖的双塘单位重复连接组成，是一种链状聚阴离子大分子黏多糖。广泛应用于医疗、日化、食品领域。HA具有良好的生物相容性，极少有副作用，研究表明，HA的生物活性具有明显的Mr(相对分子量)依懒性。
根据文献研究表明，透明质酸钠的生物活性与分子量的大小有关，分子量越小聚合度越小，生物活性就会越高。比如，有文献报道，在抗肿瘤作用方面，LMWHA(透明质酸)有很好的生物活性，低Mr的HA((1～3)×105)比高Mr的HA((1.5～1.8)×106)更能显著增加CT26细胞凋亡(约50％)；促炎症反应生物活性研究表明Mr为2×104的HA能够显著正调节肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF-α)的表达。LMWHA具有免疫调节、促进血管形成、抗肿瘤、创伤愈合等活性，皮肤对小分子透明质酸钠有极强的吸收性，在美容修复中具有不可替代作用。
目前本领域中，仍然缺乏小分子透明质酸钠的工业化生产方法，因此本领域技术人员致力于开发简单方面、成本交底、适合工业化生产的小分子透明质酸钠的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种规模化小分子透明质酸钠的制备和纯化方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种制备小分子透明质酸钠的方法，包括步骤：
(1)降解
将大分子透明质酸钠溶解在碱性水溶液中，高温降解获得小分子透明质酸钠降解液；和
(2)纯化
超滤获得目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
在另一优选例中，所述大分子透明质酸钠的平均分子量约在800kDa～1100kDa。
在另一优选例中，所述目的分子量范围的下限约为5kDa～500kDa，目的分子量范围的上限约为100kDa～800kDa。
在另一优选例中，所述碱性水溶液的pH约为9.0-13.0；优选地pH约为10.0-12.0；
在另一优选例中，所述高温降解的温度约为100℃～130℃；优选地降解温度约为105℃～125℃；更优选地降解温度121℃。
在另一优选例中，所述高温降解的时间约为2h～10h。
在另一优选例中，所述步骤(2)中使用中空纤维柱或膜包超滤。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，包括步骤：
(a)一级超滤纯化
使用截留分子量小于目的分子量范围下限的超滤装置，去除小分子透明质酸钠降解液中的无机盐离子；
(b)二级超滤纯化
使用截留分子量大于或等于目的分子量范围上限的超滤装置，对步骤(a)获得的溶液进行超滤，收集分离液；
(c)三级超滤纯化
使用截留分子量小于目的分子量范围下限的超滤装置，对步骤(b)获得分离液进行超滤浓缩，获得浓缩液，所述浓缩液中含有目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，还包括步骤：
(d)醇沉
将步骤(c)中获得的浓缩液加入95％药用乙醇溶液中，静置，从而获得固态目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
在另一优选例中，所述方法中：
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解2.5h～3.5h，超滤后获得目的分子量范围约为200kDa-400kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解4.5h～5.5h，超滤后获得目的分子量范围约为100kDa-200kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解6.5h～7.5h，超滤后获得目的分子量范围约为50kDa-100kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解7.5h～8.5h，超滤后获得目的分子量范围约为5kDa-50kDa的小分子透明质酸钠。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了降解3小时透明质酸钠分子量图谱。
图2显示了降解5小时透明质酸钠分子量图谱。
图3显示了降解7小时透明质酸钠分子量图谱。
图4显示了降解8小时透明质酸钠分子量图谱。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种规模化小分子透明质酸钠的制备和提纯方法。通过在碱性条件下高温降解大分子透明质酸钠溶液，然后通过分子排阻工艺分离、纯化，严格制备不同大小分子量透明质酸。不仅可以严格控制透明质酸在降解后生成稳定的透明质酸盐，使得透明质酸更加稳定，而且可以严格控制透明质酸分子量的范围，通过药用乙醇沉淀、脱水、45℃真空干燥，实现药用级小分子透明质酸纳(玻璃酸钠)的工业化生产。
通过单一的降解方法，对降解透明质酸钠有一定的局限性。本发明通过化学和物理的方法共同作用降解，同时通过分子排阻法纯化分离工艺进行分离纯化，最后通过乙醇沉淀干燥。实现高纯度的小分子透明质酸钠的工业化生产。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明公开了一种大规模小分子透明质酸钠的制备和提纯方法。
在本发明一个优选地实施方式中，采用pH9.0-13.0的NaOH溶液作为媒介，溶解大分子透明质酸钠，通过100℃以上高温降解3-8个小时，降解得到不同分子量的透明质酸及其盐，通过分子排阻法工艺条件分离纯化不同分子量透明质酸，再透过浓缩制备高浓度的透明质酸酸溶液，浓缩液通过药用乙醇沉淀干燥作用机理，实现小分子透明质酸钠工业化制备。在整个生产工艺中过程中，分子排阻法制备的透明质酸钠的分子量通过物理方法控制。整个工艺提高的小分子透明质酸的纯度。
在本发明的一个优选地实施方式中，将大分子透明质酸钠溶解于pH9.0-13.0的NaOH溶液中，其玻璃酸钠溶液浓度为50-60g/L，在通过100℃以上高温降解，控制降解时间，来控制降解后透明质酸钠的分子量。
然后，通过一级超滤纯化，去除降解溶液中的无机盐离子，同时进一步将溶液浓缩，收集超纯的透明质酸钠溶液。
二级超滤，将浓缩液加入3-6倍注射用水，搅拌混匀，利用剪切力的作用使用中空纤维柱或膜包超滤、分离特定分子量范围的小分子透明质酸钠。
三级超滤，即为浓缩，将二级超滤液进行浓缩，最后的浓缩液即为高浓度小分子透明质酸钠溶液，然后称取0.5％-2％的NaCl溶解于5-20ml注射用水中，然后将溶解后的NaCl溶液加入浓缩后的透明质酸钠溶液中，静置。
一次醇沉，量取3-6倍体积的95％的药用乙醇，将静置后的浓缩液缓慢加入乙醇溶液中，以搅拌桨10-15rpm/min速度搅拌，出现白色颗粒状透明质酸钠，控制搅拌速度，免于形成絮状沉淀，在0-4℃的冰箱中，静置10-300min分钟，去除上清液。
二次醇沉，量取3-6倍体积的95％的药用乙醇，加入一次醇沉的透明质酸钠中，放在0-4℃的冰箱中，静置10-300分钟，去除上清液。
三次醇沉，即脱水，量取3-6倍体积的95％的药用乙醇，加入二次醇沉的透明质酸钠中，放在0-4℃的冰箱中，静置10-300min分钟，去除上清液。将三次醇沉透明质酸通过8号筛网，过滤去除多余的乙醇溶液，放入30-50℃，真空度0.08MPa的恒温真空干燥箱中，干燥10小时以上。
检测干燥后透明质酸钠干粉水分，应低于8％。
超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。
超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。
本发明的主要优点在于：
(1)在整个制备过程中没有引进其他的化学物质，保证小分子透明质酸钠产品没有化学残留，刺激性小。
(2)在整个过程分子量可以明确表示，通过物理作用分离，能更准确确认透明质酸分子量的范围。
(3)实现小分子玻璃酸钠制备工业化生产，整个生产工艺简单，易于操作，易于控制，降低生产成本。
(4)在制备过程中碱性条件优于酸性条件，透明质酸的保存以钠盐形式保存，易于保存；酸性条件如果采用盐酸，其具有挥发性，制备过程中存在严重的安全；采用硫酸，带入了新的硫酸根离子；同时在超滤过程中，膜包在碱性条件下不会受到损害。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
将50g高分子透明质酸钠加入到1000mlpH11.0NaOH注射用水溶液中，完全溶解，溶解液分装两个玻璃容器内，在121℃高温条件下，进行高温降解反应，高温降解3个小时，冷却，加入4倍注射水稀释。
一级超滤、纯化，将稀释后的玻璃酸钠溶液通过膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)超滤纯化，超滤纯化5倍注射水，去除溶液中的NaOH离子，浓缩致1500ml溶液。
将浓缩液加入5倍注射水稀释，通过(MicrozaPALLAHP2013-200K)200KDa的膜包超滤，收集部分超滤液进行醇沉，没有透明质酸钠白色颗粒析出，说明降解分子量在200KDa以上，再次将溶液浓缩至1500ml。
二级超滤分离，将浓缩液加入5倍注射水稀释，更换400KDa膜包(MicrozaPALLAHP2013-400K)超滤分离，超滤分离电机控制在低速转运状态，分离10倍注射水溶液，收集分离液体进行三级浓缩。
浓缩(MicrozaPALLAHP2013-400K)膜包内剩余溶液(分子量在400KDa以上)至500ml，收集，称取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，获得第一份浓缩液，留待醇沉。
三级浓缩，利用一级超滤纯化膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)对二级分离液进行超滤浓缩，将溶液浓缩致1000ml。收集，称取0.45gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，收集获得第二份浓缩液进行下一步醇沉工艺。
将第一份浓缩液缓慢加入到2000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在10rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有少量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
将第二份浓缩液缓慢加入到4000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在15rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有大量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到4000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到4000ml的乙醇溶液，进行脱水，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
同时将第一份和第二份醇沉后的透明质酸钠放入在30℃，0.08MPa恒温真空干燥箱中，干燥16-19小时，检测水分，水分含量在7.8％，分别称重为1.1g和47.6g。
实施列2
将60g高分子透明质酸钠加入到1000mlpH9.0NaOH注射用水溶液中，完全溶解，溶解液分装两个玻璃容器内，在121℃高温条件下，进行高温降解反应，高温降解5个小时，冷却，加入4倍注射水稀释。
一级超滤纯化，将稀释后的玻璃酸钠溶液通过柱式膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)超滤纯化，超滤纯化5倍注射水，去除溶液中的NaOH离子，浓缩致1500ml溶液。
将浓缩液加入5倍注射水稀释，通过100kDa的膜包超滤，收集部分超滤液进行醇沉，没有透明质酸钠白色颗粒析出，说明降解分子量在100kDa以上，再次将溶液浓缩至1500ml。
二级超滤分离，将浓缩液加入5倍注射水稀释，更换200kDa膜包(MicrozaPALLAHP2013-200K)超滤分离，超滤分离电机控制在低速转运状态，分离10倍注射水溶液，收集分离液体进行三级浓缩工艺。
浓缩(MicrozaPALLAHP2013-200K)膜包内剩余溶液(分子量在200KDa以上)至500ml，收集，称取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，获得第一份浓缩液，留待醇沉。
三级浓缩，利用一级超滤纯化膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)对二级分离液进行浓缩，将溶液浓缩致1000ml。收集，称取0.55gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，收集获得第二份浓缩液进行下一步醇沉工艺。
将第一份浓缩液缓慢加入到2000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在10rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有少量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
将第二份浓缩液缓慢加入到4000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在15rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有大量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到4000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到4000ml的乙醇溶液，进行脱水，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
同时将第一份和第二份醇沉后的透明质酸钠放入在30℃，0.08MPa恒温真空干燥箱中，干燥16-19小时，检测水分，水分含量在8.0％，分别称重为1.4g和57.4g。
实施例3：
将55g高分子透明质酸钠加入到1000mlpH13.0NaOH注射用水溶液中，完全溶解，溶解液分装两个玻璃容器内，在121℃高温条件下，进行高温降解反应，高温降解7个小时，冷却，加入4倍注射水稀释。
一级超滤纯化，将稀释后的玻璃酸钠溶液通过柱式膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)超滤纯化，超滤纯化5倍注射水，去除溶液中的NaOH离子，浓缩致1500ml溶液。
将浓缩液加入5倍注射水稀释，通过10kDa的膜包超滤，收集部分超滤液进行醇沉，没有透明质酸钠白色颗粒析出，说明降解分子量在10kDa以上，再次将溶液浓缩至1500ml。
二级超滤分离，将浓缩液加入5倍注射水稀释，更换100kDa膜包(MicrozaPALLAHP2013-100K)超滤分离，超滤分离电机控制在低速转运状态，超滤10倍注射水溶液，收集分离液体进行三级浓缩工艺。
浓缩(MicrozaPALLAHP2013-100K)膜包内剩余溶液(分子量在100KDa以上)至500ml，收集，称取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，获得第一份浓缩液，留待醇沉。
三级浓缩，利用一级超滤纯化膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)对二级分离液进行浓缩，将溶液浓缩致1000ml。收集，称取0.55gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，收集获得第二份浓缩液进行下一步醇沉工艺。
将第一份浓缩液缓慢加入到2000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在10rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有少量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
将第二份浓缩液缓慢加入到4000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在15rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有大量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到4000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到4000ml的乙醇溶液，进行脱水，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
同时将第一份和第二份醇沉后的透明质酸钠放入在30℃，0.08MPa恒温真空干燥箱中，干燥16-19小时，检测水分，水分含量在7.0％，分别称重为1.0g和53.0g。
实施例4：
将55g高分子透明质酸钠加入到1000mlpH13.0NaOH注射用水溶液中，完全溶解，溶解液分装两个玻璃容器内，在121℃高温条件下，进行高温降解反应，高温降解8个小时，冷却，加入4倍注射水稀释。
一级超滤纯化，将稀释后的玻璃酸钠溶液通过柱式膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)超超滤纯化，超滤纯化5倍注射水，去除溶液中的NaOH离子，浓缩致1500ml溶液。
收集前期部分超滤液进行醇沉，没有透明质酸钠白色颗粒析出，说明降解分子量6000Da在以上。
二级超滤分离，将浓缩液加入5倍注射水稀释，更换10kDa膜包(MicrozaPALLACP3013)超滤分离，超滤分离电机控制在低速转运状态，分离10倍注射水溶液，收集分离液体进行三级浓缩工艺。
浓缩(MicrozaPALLACP3013)膜包内剩余溶液(分子量在10KDa以上)至500ml，收集，称取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，获得第一份浓缩液，留待醇沉。
三级超滤，利用一级超滤纯化膜包(MicrozaPALLAIP2013-6K)对二级分离液进行浓缩，将溶液浓缩至1000ml。收集，称取0.55gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到浓缩液中，静置5min，收集获得第二份浓缩液进行下一步醇沉工艺。
将第一份浓缩液缓慢加入到2000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在10rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有少量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到2000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
将第二份浓缩液缓慢加入到4000ml95％药用乙醇溶液中，搅拌速度在15rpm/min，放入0-4℃冰箱中静置30min，有大量的透明质酸钠沉淀析出，去除上清液；继续加入到4000ml的乙醇溶液，放入0-4℃冰箱中静置60min，去除上清液；再次加入到4000ml的乙醇溶液，进行脱水，放入0-4℃冰箱中静置240min，去除上清液，通过8号筛网，过滤多余的乙醇。
同时将第一份和第二份醇沉后的透明质酸钠放入在30℃，0.08MPa恒温真空干燥箱中，干燥16-19小时，检测水分，水分含量在7.5％，分别称重为1.2g和52.6g。
通过实施例4，可以证实，在分子量降到100kDa后，在碱性容易中更容易降解，所需要时间更短时间更短。
通过以上四个案例总结整个工艺控制参数以及分子量的范围如下表：
表1小分子透明质酸钠降解时间及降解重量比
实施例5：
将58g高分子透明质酸钠加入到1000mlpH13.0NaOH注射用水溶液中，完全溶解，将溶解后的液体平均分装于4个玻璃容器内，在121℃高温条件下，进行降解反应，在3、5、7、8四个时间点，每个时间点取出一个样品。3小时取出的实验样品按照实施例1工艺要求进行纯化；5小时取出的实验样品按照实施例2的工艺要求进行纯化；7小时取出的实验样品按照实施例3的工艺要求进行纯化；8小时取出的样品按照实施例4的工艺要求进行纯化。
纯化后产品通过0.08MPa恒温真空干燥箱中，干燥16-19小时，检测水分，水分含量在7.5％以下，既可。
实施例5所制备的透明质酸钠符合实验要求，通过实施例5，可以控制在制备不同分子量产品的配方要求中更具有针对性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备小分子透明质酸钠的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)降解
将大分子透明质酸钠溶解在碱性水溶液中，高温降解获得小分子透明质酸钠降解液；和
(2)纯化
超滤获得目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述大分子透明质酸钠的平均分子量约在800kDa～1100kDa。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述目的分子量范围的下限约为5kDa～500kDa，目的分子量范围的上限约为100kDa～800kDa。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述碱性水溶液的pH约为9.0-13.0。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述碱性水溶液的pH约为10.0-12.0。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述高温降解的温度约为100℃～130℃；优选地降解温度约为105℃～125℃；更优选地降解温度121℃。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述高温降解的时间约为2h～10h。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中，包括步骤：
(a)一级超滤纯化
使用截留分子量小于目的分子量范围下限的超滤装置，去除小分子透明质酸钠降解液中的无机盐离子；
(b)二级超滤纯化
使用截留分子量大于或等于目的分子量范围上限的超滤装置，对步骤(a)获得的溶液进行超滤，收集分离液；
(c)三级超滤纯化
使用截留分子量小于目的分子量范围下限的超滤装置，对步骤(b)获得分离液进行超滤浓缩，获得浓缩液，所述浓缩液中含有目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述步骤(2)中，还包括步骤：
(d)醇沉
将步骤(c)中获得的浓缩液加入95％药用乙醇溶液中，静置，从而获得固态目的分子量范围的小分子透明质酸钠。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法中：
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解2.5h～3.5h，超滤后获得目的分子量范围约为200kDa-400kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解4.5h～5.5h，超滤后获得目的分子量范围约为100kDa-200kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解6.5h～7.5h，超滤后获得目的分子量范围约为50kDa-100kDa的小分子透明质酸钠；或者
将大分子透明质酸钠溶解在pH约为9～13的碱性水溶液中，100～130℃降解7.5h～8.5h，超滤后获得目的分子量范围约为5kDa-50kDa的小分子透明质酸钠。
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