CN110856744B - 一种石斛多肽的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种石斛多肽在抗氧化和提高免疫力方面的用途。本发明方法充分利用了石斛在实际生产中剩余的药渣，制备出活性良好的石斛多肽，提高了鼓槌石斛的附加利用率。

Description

一种石斛多肽的新用途
技术领域
本发明涉及一种石斛多肽的新用途，属于中医药领域。
背景技术
对中药的研究，过去很长时间主要集中在次生代谢产物上，而对于蛋白质可能的药效作用几乎不被知晓。随着生物科学技术的发展与成熟，中药蛋白质及其多肽的研究也逐渐受到重视，并将可能成为中药和新药研究的新方向。传统理论认为，人体对蛋白质的吸收主要是以氨基酸形式被吸收。最新研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后，主要以小分子多肽的形式被吸收，且比游离氨基酸更易于被机体吸收和利用。因此，生物活性肽(Biological active peptides，BAP)的研究逐渐引起了各方面研究人员的重视。研究者们发现蛋白质经过水解后得到的多肽具有更好的营养特性；特别是Mattews等人的研究结果告诉人们，蛋白质经消化道酶作用后并不一定以完全游离氨基酸的形式吸收，且主要被吸收是以低肽(尤其是二肽、三肽)的形式。通过生物代谢实验也证实了低肽的吸收率比游离氨基酸要多，且比氨基酸更容易通过小肠黏膜而被肌体吸收利用。此外，因低肽结构的多样性和复杂性决定了他在细胞生理和调节代谢具有活性作用的功能，大量的研究也证明了有些低肽具有增强免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、降低胆固醇和降血压、促进矿物质吸收、激素调节、酶调节等作用。一些研究人员成功的利用动植物蛋白制备了降血压肽、免疫调节功能肽、抗氧化活性肽等。
早期石斛的应用品种主要集中在铁皮石斛、金钗石斛上，其药用和保健价值应用广泛。而鼓槌石斛作为2010版药典新晋品种，药用价值开发较少，只出现在少数几种中成药的原料中，被利用的成分主要集中在多糖和酚类成分。在实际生产过程中，鼓槌石斛一般经过乙醇提取后剩余的药渣都不再利用。研究发现，鼓槌石斛中含有5.5％的蛋白质成分。近年来栽培量再逐渐增加，云南地区已经一定规模的栽培产量。如何合理有效的开发鼓槌石斛中的蛋白质成分，提高鼓槌石斛的附加利用率，值得进一步研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种石斛多肽在抗氧化和提高免疫力方面的用途。本发明方法充分利用了石斛在实际生产中剩余的药渣，制备出活性良好的石斛多肽，提高了石斛的附加利用率。
作为本发明的第一个方面，本发明提供一种石斛多肽在制备具有抗氧化活性的药品、保健品或化妆品中的应用。
作为本发明的第二个方面，本发明提供一种石斛多肽在制备提高机体免疫力的药品或保健品中的应用。
所述鼓槌石斛多肽是从石斛药渣中提取获得的多肽；进一步，所述石斛多肽的制备包括依次进行的从鼓槌石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程。
本发明所述“石斛药渣”是石斛经乙醇提取后剩余的药材部分，在实际生产过程中，鼓槌石斛一般经过乙醇提取获得有效成分后剩余的药渣都不再利用，而本发明以乙醇提取后的药渣作为原料，进一步制备具有活性的多肽成分。
在具体的实施方式中，所述蛋白质提取过程以稀碱溶液作为提取溶剂，所述蛋白质与稀碱溶液的比例(m/V)为1：(20～45)，提取时间为90～180min，提取次数为2～3次。
在具体的实施方式中，所述酶解过程采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意一种或几种进行酶解。优选的，以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解；进一步优选的，所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为(0.25～4)：1；更进一步优选的，所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为(0.6～1.5)：1；最优选的，所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为1:1。
在具体的实施方式中，所述酶解过程中，加酶量为3800U/g～8000U/g，酶解温度为40℃～60℃，pH为5.5～7.0；优选的，加酶量为5000U/g～7000U/g，酶解温度为50℃～55℃，pH为6～7.0。
本发明碱法提取得到的蛋白液会伴随着植物体内的多种粘液质、色素等成分，成分复杂且溶液颜色深。因此，本发明制备方法在提取蛋白质的步骤之后，还包括对蛋白质进行脱色的步骤，所述脱色可选用本领域任何常规的脱色方法。作为优选的，本发明选择活性炭进行脱色；进一步优选的，所述活性炭用量为0.6～1.2g/100ml蛋白液，脱色温度为35～45℃。
作为本发明的第三个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含活性成分鼓槌石斛多肽以及药学上可接受的辅料。
所述鼓槌石斛多肽是从鼓槌石斛药渣中提取获得的多肽；进一步，所述鼓槌石斛多肽的制备包括依次进行的从鼓槌石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程。
所述药学可接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
作为本发明的第四个方面，本发明提供一种具有保湿、美白作用的化妆品，其包含活性成分鼓槌石斛多肽以及常规辅料。
所述石斛优选鼓槌石斛。
本发明的有益效果：本发明以鼓槌石斛药渣作为原料提取多肽成分，提高了鼓槌石斛的附加利用率；本发明制备的鼓槌石斛多肽，对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有很好的清除作用，可用于制备具有保湿、美白功效的药品、保健品或化妆品。此外，鼓槌石斛多肽能够显著提高小鼠的非特异性免疫功能(P<0.05)，能够增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高小鼠的非特异性免疫功能。
具体实施方式
实施例1蛋白质的提取
将25g石斛粉末与蒸馏水混匀，室温下在磁力搅拌器上浸提3h，纱布初滤后于3000r/min条件下离心5min，取上清液，透析，冷冻干燥，得到水溶性蛋白；
将蒸馏水提取后的石斛药渣加入0.1mol/L氯化钠溶液，混匀，室温下搅拌提取3h，纱布初滤后于3000r/min条件下离心5min，取上清液，透析至一定体积，冷冻干燥，得到盐溶性蛋白；
将25g石斛粉末与75％的乙醇液混匀，室温下在磁力搅拌器上浸提3h，纱布初滤后于3000r/min条件下离心5min，取上清液，冷冻干燥，得到醇溶性蛋白；
将乙醇溶液提取后的石斛药渣加入0.3％氢氧化钠溶液，混匀，室温下搅拌提取3h，纱布初滤后于3000r/min条件下离心5min，取上清液，透析至一定体积，冷冻干燥，得到碱溶性蛋白。
通过测定，四种蛋白质类型在总蛋白质中所占的比例分别为：15.47％，5.03％，17.47％，33.62％。即水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量很低，而经过乙醇提取后的药渣中的碱溶性蛋白含量达到33.62％。在实际生产过程中，鼓槌石斛一般经过乙醇提取获得有效成分后剩余的药渣都不再利用，而本发明发现乙醇提取后的药渣中蛋白质含量很高，因此，以乙醇提取后的药渣作为原料，进一步制备石斛多肽。
实施例2-5蛋白质的提取
取过40目鼓槌石斛药渣粉末(经75％乙醇提取后)，按照一定的料液比、以不同的氢氧化钠溶液浓度浸提不同的时间和次数，然后3000r/min离心15min，取上清液，透析，得蛋白质沉淀，透析，真空干燥，得蛋白质干粉。提取参数和提取得率见表1。
表1不同参数的提取得率
Figure BDA0001776488320000041
实施例6-10活性炭脱色
取实施例5制备的蛋白质溶液100ml，加入不同量的活性炭进行脱色，并控制温度、pH和时间，测定脱色率和蛋白质损失率。见表2。
由表2可见，实施例8设定活性炭的用量和温度为1.2g和45℃，pH和脱色时间设定为7.0和30min，脱色率高且蛋白质损失少。
表2活性炭脱色
Figure BDA0001776488320000051
实施例10-18蛋白液的酶解
取实施例5制备的4％的蛋白质溶液，并按照实施例8的方法进行脱色，用Tris-HCl调节蛋白液的pH值，加入不同类型的蛋白酶，放入振荡水浴锅中，在适合的温度和pH下反应。酶解完后，90℃下水浴15min，灭活酶，冷却至室温，4000r/min下离心15min，取上清液，测定水解度。不同处理方式和测定结果见表3。结果表明，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照1:1的比例，其水解度最高。
表3不同酶解条件的水解度
Figure BDA0001776488320000052
Figure BDA0001776488320000061
实施例19酶解液的体外抗氧化实验
取实施例18制备的鼓槌石斛多肽液，采用3kDa的超滤管在冷冻离心机中分离出分子量分别为大于3kDa、小于3kDa的酶解物。
1实验方法
1.1羟基自由基清除能力测定
实验原理：硫酸亚铁与双氧水混合会产生羟基自由基，它能够氧化水杨酸，得到的产物在510nm处会有吸光度，吸光度越大，证明羟基自由基越多，样品抗氧化能力越强，则产生的羟基自由基越少，吸光度则越少。实验方法采用文献(《分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基》，颜军，等，成都大学学报(自然科学版)，2009，28(2):91-93)。各组加样量见表4。
表4测定酶解物对羟基自由基的清除能力
Figure BDA0001776488320000062
清除率(％)计算公式：羟基清除率(％)＝[A空白-(A样-A对照)]/A空白×100％
1.2超氧阴离子的清除能力的测定
碱性条件下(pH＝8.34)，邻苯三酚会发生自氧化反应生成超氧阴离子和有色的中间产物，该有色中间产物在325nm处有一特征吸收峰。当加入超氧阴离子清除物质时，超氧阴离子的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，溶液在325nm处吸收减弱，故通过测定在325波长处的值，可以推断清除剂的清除作用，并能比较不同清除剂该作用的相对大小。具体操作为：向试管中加入50mM Tris-HCI(pH＝8.34)缓冲液、1mM EDTA溶液各1mL，然后再加入样品溶液0.4mL及0.4mM邻苯三酚lmL，混合均匀。计时10min后，加入100mM二硫苏糖醇溶液30μL终止反应，1h内测定325nm处的吸光值。对照为样品和溶液的吸光度；空白为邻苯三酚和溶液的吸光度。
样品的清除能力(scavenging activity,SA)：清除率(％)＝[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100％
1.3总抗氧化清除能力的测定
采用总抗氧化试剂盒(DTAC-048)。
2实验结果
2.1羟基自由基清除能力的测定结果
由于物理化学等因素的影响均会促使机体羟基自由基的产生，而羟基自由基是目前公认的毒性最强的活性氧自由基。配置不同浓度大小的多肽样品液和Vc溶液，分别测定在510nm处的吸光度，计算其清除能力，结果见表5。
表5对羟基自由基的清除能力
浓度(mg/mL) 维生素C/％ 大于3kDa/％ 小于3kDa/％
0.2 20.00±0.06 11.45±0.06 11.34±2.00
0.4 33.83±1.41 23.74±1.41 23.74±1.91
0.6 74.00±0.04 33.83±0.04 33.83±1.00
0.8 95.50±2.12 63.08±2.12 63.08±1.80
1.0 100±0.02 78.23±0.02 78.23±0.66
从表5中可以看出，维生素C、大于3kDa的多肽液和小于3kDa的多肽液对羟基自由基均有不同程度清除效果，清除能力为：维生素C>大于3kDa的多肽液>小于3kDa的多肽液。整体看来，多肽液的清除能力比维生素C弱，清除能力随浓度的增大而增强，当浓度为1mg/mL时多肽液的清除能力能达到78.23％和65.92％。
2.2超氧阴离子清除能力的测定
超氧阴离子本身不太活泼，且毒性作用一般，但其衍生物毒性很大，可对DNA及细胞产生损伤和毒性。不同浓度的多肽液和Vc对超氧阴离子的清除能力见表6。
表6对超氧阴离子的清除能力
浓度(mg/mL) 维生素C/％ 大于3kDa/％ 小于3kDa/％
0.2 20.0±2.00 15.14±1.50 11.34±0.28
0.4 43.52±1.91 28.38±0.52 22.45±2.62
0.6 85.50±0.12 51.53±1.47 34.21±0.96
0.8 100±1.79 71.32±0.89 61.23±1.13
1.0 100±0.66 93.57±1.94 75.78±3.02
从表6中可以看出，3者对超氧阴离子也有不同程度清除效果，清除能力为：维生素C>大于3kDa的多肽液>小于3kDa的多肽液。整体看来，维生素C对其的清除能力最强；多肽液的清除能力整体都稍弱，当浓度为1mg/mL时多肽液的清除能力能达到93.57％和75.78％。
2.3总抗氧化能力的测定
清除自由基能力的清除取决于其还原力的大小，其还原性越强，其给电子能力越强，自由基则更容易以稳定的形态存在，这样就可以达到抗氧化的目的。不同浓度的多肽液和Vc总抗氧化能力见表7。
表7总抗氧化能力的测定
浓度(mg/mL) 维生素C/％ 大于3kDa/％ 小于3kDa/％
0.2 7.95±9.28 8.86±3.61 0.95±0.59
0.4 17.27±2.61 13.64±1.15 5.91±1.86
0.6 36.14±6.96 22.35±1.07 16.14±7.53
0.8 67.27±1.13 33.41±1.25 33.41±3.15
1.0 85.45±2.60 36.14±7.10 70.45±8.64
从表7中可以看出，3者的总抗氧化能力大小不一，总抗氧化能力大小为：维生素C>大于3kDa的多肽液>小于3kDa的多肽液。维生素C的总抗氧化能力是最强的，为85.45±2.6％；小分子的多肽液的总抗氧化能力最弱。
实施例20酶解液的免疫活性实验
1试验材料与方法
1.1试验动物
SPF级昆明种小鼠，雄性，体重20±2g(北京维通利华实验动物技术有限公司，批号:0354701)。
1.2实验试剂与仪器
Insulin Syringe一次性使用无菌胰岛素注射器(碧迪医疗器械有限公司)、香菇菌多糖片(湖北广仁药业有限公司，批号：20131207)、Solarbio印度墨汁(北京百诺威生物科技有限公司)、Gene-bio肝素钠(北京百诺威生物科技有限公司)、氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，批号：20130203)、滤纸、其余试剂等均为分析纯；鼓槌石斛多肽液按实施例18制备。
2测试项目和方法
小白鼠随分成4组，每组12只。实验组(鼓槌石斛多肽组)分高、低2个剂量组(2.4g/kg、4.8g/kg)。阳性组用香菇菌多糖片处理，空白组用生理盐水处理。每天灌胃一次，连续灌胃七天，进行指标测试。
2.1小鼠免疫器官指数的测定
连续7天喂食药品后，称重，取血后脱颈椎法处死，分离肝脏、脾脏、胸腺，于滤纸上称重，计算免疫器官指数。
免疫器官指数＝免疫器官重量/体重
2.2小鼠炭粒廓清实验
连续7天喂食药品后，经尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释5倍的印度墨汁，每10g体质量注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从摘眼球取血20μL。加入2mL 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照，在600nm波长下测定吸光度A(λ)值。按下式计算吞噬指数α和廓清指数K：
α＝K1/3×体质量/(肝质量+脾质量)，K＝[lgA(λ1)-lgA(λ2)]/﹙t2-t1﹚
3数据处理
实验数据采用均数±标准差表示，统计学分析采用spss 17.0软件分析。
4结果与分析
4.1对小鼠免疫器官指数的影响
表8小鼠免疫器官指数的测定结果
Figure BDA0001776488320000101
(n＝12)
组别 剂量(g/kg) 脾脏指数(mg/g) 胸腺指数(mg/g)
空白组 —— 4.95±1.85 1.24±0.60
阳性组 0.1 5.63±0.69* 2.13±1.22*
低剂量组 2.4 5.39±1.09* 1.58±0.32*
高剂量组 4.8 5.55±0.46* 1.68±0.19*
*表示具有显著差异，P<0.05
不同的给药剂量组对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响，由表8可以看出，与空白组比较，阳性组和石斛多肽各剂量组有显著差异(P<0.05)。且不同剂量组间脾脏指数和胸腺指数呈现一定的量效关系。
4.2对小鼠内皮网状系统的吞噬功能的影响
表9小鼠廓清指数和吞噬指数的测定结果
Figure BDA0001776488320000102
(n＝12)
组别 剂量(g/kg) 廓清指数K 吞噬指数α
空白组 —— 0.0250±0.0024 6.5326±1.5327
阳性组 0.1 0.0518±0.0070* 8.7248±0.1218*
低剂量组 2.4 0.0387±0.0483* 7.6302±0.2014*
高剂量组 4.8 0.0662±0.0106* 9.4728±0.0367*
*表示具有显著差异，P<0.05
由表9可以看出，与空白组比较，阳性组和石斛多肽各剂量组有显著差异(P<0.05)，廓清指数和吞噬指数均有显著增高。
胸腺和脾脏是机体的主要免疫器官，T细胞在胸腺里分化成熟；脾脏含有B、T淋巴免疫细胞等是其主要反应产所。增强免疫力的制剂可以使胸腺、脾脏增重，是免疫能力强弱的直观反映。免疫器官指数的高低能够客观的反应非特异性免疫的能力大小。因此，器官指数可作为对免疫影响的初步探究。本研究灌胃给药小鼠7天，测定体重和器官指数，主要是衡量内皮网状系统吞噬功能的强弱、非特异性免疫的功能强弱。实验中，不同给药组的胸腺指数和脾脏指数均高于空白组，而石斛多肽剂量组具有显著的差异(P<0.05)，说明酶解制备的多肽液对免疫系统具有一定的作用。
当碳粒通过尾静脉进入小鼠体内血循环时，单核巨噬细胞则会通过吞噬而清除碳粒，其主要部位为肝、脾。这样血液中碳颗粒浓度即会降低，吸光度即会减少。而单核巨噬细胞的吞唆能力是机体非特异性免疫功能的重要指标之一。所以测定对血中异物的清除能力可反映机体网状内皮系统的吞噬功能状况。小鼠碳廓清实验中，廓清指数可以反映网状内皮系统的吞噬功能，吞噬指数可以反映单核巨噬细胞的吞嚼能力。本实验的结果显示，酶解后的多肽液能够显著提高小鼠的非特异性免疫功能(P<0.05)，说明此酶解液能够增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高小鼠的非特异性免疫功能。

Claims (6)

1.一种石斛多肽在制备具有抗氧化活性的药品或化妆品中的应用；其特征在于，所述石斛多肽的制备包括依次进行的从石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程；
其中，所述石斛药渣是石斛经乙醇提取后剩余的药材部分；
所述蛋白质提取过程以稀碱溶液作为提取溶剂；蛋白质与稀碱溶液的比例m/V为1：20~45，提取时间为90~180min，提取次数为2~3次；
所述酶解过程采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为0.25~4：1；所述酶解过程中，加酶量为3800 U/g ~8000 U/g，酶解温度为40℃~60℃，pH为5.5~7.0；
所述石斛多肽的分子量大于3kDa。
2.一种石斛多肽在制备提高机体免疫力的药品中的应用；其特征在于，所述石斛多肽的制备包括依次进行的从石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程；
其中，所述石斛药渣是石斛经乙醇提取后剩余的药材部分；
所述蛋白质提取过程以稀碱溶液作为提取溶剂；蛋白质与稀碱溶液的比例m/V为1：20~45，提取时间为90~180min，提取次数为2~3次；
所述酶解过程采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为0.25~4：1；所述酶解过程中，加酶量为3800 U/g ~8000 U/g，酶解温度为40℃~60℃，pH为5.5~7.0。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在提取蛋白质的过程之后包括采用活性炭进行脱色。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，石斛多肽在制备提高机体非特异性免疫力的药品中的应用。
5.一种具有抗氧化活性的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括活性成分鼓槌石斛多肽以及药学上可接受的辅料；
其中，所述鼓槌石斛多肽的制备包括依次进行的从石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程；
所述石斛药渣是石斛经乙醇提取后剩余的药材部分；
所述蛋白质提取过程以稀碱溶液作为提取溶剂；蛋白质与稀碱溶液的比例m/V为1：20~45，提取时间为90~180min，提取次数为2~3次；
所述酶解过程采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为0.25~4：1；所述酶解过程中，加酶量为3800 U/g ~8000 U/g，酶解温度为40℃~60℃，pH为5.5~7.0；
所述石斛多肽的分子量大于3kDa。
6.一种提高机体免疫力的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括活性成分鼓槌石斛多肽以及药学上可接受的辅料；
其中，所述鼓槌石斛多肽的制备包括依次进行的从石斛药渣中提取蛋白质的过程和对蛋白质进行酶解的过程；
所述石斛药渣是石斛经乙醇提取后剩余的药材部分；
所述蛋白质提取过程以稀碱溶液作为提取溶剂；蛋白质与稀碱溶液的比例m/V为1：20~45，提取时间为90~180min，提取次数为2~3次；
所述酶解过程采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解；所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为0.25~4：1；所述酶解过程中，加酶量为3800 U/g ~8000 U/g，酶解温度为40℃~60℃，pH为5.5~7.0。
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