CN105713944A - 铁皮石斛小分子肽组合物、其提取方法及应用 - Google Patents

铁皮石斛小分子肽组合物、其提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，包括以下步骤：(1)原料预处理；(2)铁皮石斛蛋白的变性；(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解；(4)过滤除杂；(5)脱水干燥。本发明铁皮石斛小分子肽组合物中含有铁皮石斛蛋白水解得到的分子量主要分布在100-700D之间的小分子肽，还包括多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物、维生素及微量物质，可用于医药原料、保健食品、美容化妆品中。本发明所得产品的分子量主要分布在100-700D之间，所得的小分子肽多为二肽、三肽、四肽等极易被人体吸收利用的小分子结构，分子量分布于60-700的小分子肽占蛋白总量的90％以上。

Description

铁皮石斛小分子肽组合物、其提取方法及应用
技术领域
本发明涉及一种食品加工技术领域，具体涉及一种从铁皮石斛中提取小分子肽组合物的方法、通过该方法提取得到的小分子肽组合物以及该小分子肽组合物在医药原料、保健食品、美容化妆品中的应用。
背景技术
铁皮石斛(拉丁学名：DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，又名黑节草、云南铁皮、铁皮斗。为兰科石斛属植物铁皮石斛的干燥茎，富含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分，何铁光等研究发现铁皮石斛含有17种氨基酸，铁皮石斛野生品氨基酸含量分别达到133.1mg/g，其中，谷氨酸、天冬氨酸等必需氨基酸含量的含量占总量的37.9％，铁皮石斛还含有大量人体所需的金属元素，如Ca、K、Na、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Sr等。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，其可以促进腺体分泌和脏器运动；降低链脲霉素诱发糖尿血糖值；促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强T淋巴细胞的增殖和分化及NK细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，无论是对非特异性免疫功能，或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能，均有一定的提高作用。
在保健品和化妆品行业，对铁皮石斛进行提取处理获得更高纯度的有效成分是常用的手段。目前比较流行的铁皮石斛营养制剂的提取方法是粗加工的方式，主要有溶剂提取法、微波法、超临界流体萃取法等。微波提取法是利用磁控管所产生的超高频率的快速震动，使植物内分子间相互碰撞、挤压，从而使其有效成分浸出的一种提取方法；超临界流体萃取方法利用超临界流体作为萃取剂从液体和固体中提取某种成分，达到分离或提纯的目的；溶剂提取法是常规提取方法，常用的提取溶剂包括热水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及其水溶液等；微波法和超临界流体萃取法提取率较高，节省溶剂，溶剂提取法对设备要求低，容易操作，成本低。但这些方法获得的铁皮石斛制剂中含有大量不需要的物质，甚至还有特殊的异味，另外，其有效成分物质的纯度仍然不够，特别是蛋白质通常还保留几乎完整的大分子形式。大分子形式的蛋白质生物利用度一般比较低，在保健品和化妆品行业中是不利的。
因此，人们需要通过各种水解方法把蛋白水解变成在人体内不需消化，即可直接吸收的肽，以提高其生物利用度，蛋白水解的方法主要有酸法、碱法和酶法，其中酸法和碱法都有成本高、工艺复杂、水解程度不易控制、对环境污染严重等缺点，而且在高碱或高酸的情况下，蛋白与糖和油脂等杂质发生反应，产生褐色物质，甚至产生有害物质，它们都会影响最终多肽产品的品质。酶法水解蛋白反应较温和，无不良副反应发生，但酶作用的单一性使得通过一种酶很难达到理想的水解效果，所得产品存在分子量分布较宽、活性肽所占比例低等缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从铁皮石斛果实中提取可直接被人体吸收的铁皮石斛小分子肽组合物、其提取方法及应用，采用本提取方法得到的铁皮石斛小分子肽组合物分子量分布集中、活性肽所占比例高。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将铁皮石斛烘干破碎为铁皮石斛粉以备用；
(2)铁皮石斛蛋白的变性：将所述铁皮石斛粉加入到去离子水中，加热保温至蛋白质变性，保温结束后降温得料液；
(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解：
用NaOH溶液调节所述料液的pH至8-8.5，加入碱性蛋白酶保温酶解3-4h，得第一次蛋白酶解液；
用HC1溶液调节所述第一次蛋白酶解液的pH至7.3-7.6，加入中性蛋白酶保温酶解3-4h，得第二次蛋白酶解液；
用HC1溶液调节所述第二次蛋白酶解液的pH至3.5-3.7，加入胃蛋白酶保温酶解3-4h，灭活，得第三次蛋白酶解液；
(4)过滤除杂：
将第三次蛋白酶解液粗过滤、脱色处理后用硅藻土过滤机过滤，得铁皮石斛小分子肽液体；
(5)脱水干燥：
将所述铁皮石斛小分子肽液体进行喷雾干燥或冷冻干燥得粉末状的铁皮石斛小分子肽组合物。
优选地：所述烘干为将铁皮石斛果实置于50-55℃的干燥箱中烘14-15h，所述铁皮石斛粉的细度为100-120目。
将铁皮石斛果实于55-60℃的真空干燥箱中干燥的原因为铁皮石斛中含有多种不稳定的活性物质，温度太高则会至活性物质失活。干燥后粉碎为100-120目铁皮石斛粉是为了将铁皮石斛蛋白的凝聚包裹结构打破，使包裹在其中的杂质释放出来，以便去除其杂质。若颗粒细度大于100目，则凝聚包裹结构破碎不佳导致杂质无法完全释放；若颗粒细度小于120目，则蛋白颗粒太小导致分离洗涤时随杂质一同洗出，影响蛋白质提取率。
优选地：步骤(2)中所述铁皮石斛粉与去离子水的质量比为1:8-10。
将铁皮石斛粉与去离子水混合便于后续步骤输送及反应，若水量过多则增加了最后脱水干燥的时间，若水量不足则浓度过高，不利于后续酶解反应。
优选地：步骤(2)中所述加热后为加热至95-100℃，所述保温时间为14-18min，所述降温速率为45-50℃/min，降温至45-50℃。
铁皮石斛蛋白经加热变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。将铁皮石斛蛋白质变性的作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。由于天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构(但一级结构并未改变)。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。
而先加热至95-100℃是为了使蛋白质变性，降温降温至45-50℃是为了避免铁皮石斛蛋白中的其他活性物质失活。
优选地：步骤(3)中所述的碱性蛋白酶的酶活为50万u/g，所述中性蛋白酶的酶活为15万u/g，所述胃蛋白酶的酶活为5万u/g，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶及胃蛋白酶的添加量均为所述铁皮石斛粉重量的1％。
本发明中蛋白酶的添加顺序为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，其主要原因为此添加顺序能够大大地改进本发明方法的工艺，减少工艺步骤，节省操作的时间，以及节约原料和中间材料。更重要的，采用以上加入酶的顺序，能够更有效地得到需要的小分子肽提取物，即所述组合物中小分子肽提取物分子量主要分布在100-700D之间，多为二肽到四肽的小分子肽。
优选地：步骤(3)中所述NaOH溶液及所述HC1溶液的摩尔浓度均为10％mol/L。
优选地：步骤(3)中所述灭活为将所述第三次蛋白酶解液升温至95℃以上，保温灭活18-20min。
优选地：步骤(4)中所述粗过滤为用300目以上粗砂布或中速滤纸过滤，所述脱色为添加相对于所述第三次蛋白酶解液液重2％的活性炭，加热至70-75℃，搅拌条件下脱色0.5-1h。
使用300目以上的粗砂布或中速滤纸过滤可去除较多的杂质，提高产品的纯度。
优选地：步骤(5)中进行喷雾干燥或冷冻干燥之前，先将步骤(4)中所述的铁皮石斛小分子肽液于50-55℃的温度下真空浓缩至其重量的20％。
先采用真空浓缩的方法可有效缩短喷雾干燥或者冷冻干燥的时间。
一种采用上述方法得到的铁皮石斛小分子肽组合物，所述铁皮石斛小分子肽组合物中含有铁皮石斛蛋白水解得到的分子量主要分布在100-700D之间的小分子肽。
优选地：所述铁皮石斛小分子肽组合物中还包括多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物、维生素及微量物质。
上述铁皮石斛小分子肽组合物在医药原料、保健食品、美容化妆品中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明利用复合生物酶酶解技术，并通过调节酶解参数，最大程度的发挥了各种酶制剂的作用，从而大大降低了酶制剂的用量，节约了生产成本，而且所得产品的分子量主要分布在100-700D之间，所得的小分子肽多为二肽、三肽、四肽等极易被人体吸收利用的小分子结构，分子量分布于60-700D的小分子肽占蛋白总量的90％以上；
2、本发明提供的铁皮石斛小分子肽组合物中不仅含有能提供人体生长发育所需要的营养物质，还含有大量的其它有益营养成分，包括多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物、维生素及微量物质；
3、本发明提供的铁皮石斛小分子肽组合物可以可以促进腺体分泌和脏器运动；降低链脲霉素诱发糖尿血糖值；促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强T淋巴细胞的增殖和分化及NK细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，无论是对非特异性免疫功能，或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能，均有一定的提高作用，可以广泛的应用于医药原料、保健食品、美容化妆品中。
具体实施方式
下面通过3个具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述，在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将铁皮石斛果实置于50℃的干燥箱中烘14h，破碎为100目的铁皮石斛粉以备用；
(2)铁皮石斛蛋白的变性：将所述铁皮石斛粉与去离子水按1:8的比重混合，然后加热至95℃后保温14min至铁皮石斛蛋白变性，保温结束后按45℃/min的速率降温至45℃，得料液；
(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解：
用摩尔浓度均为10％mol/L的NaOH溶液调节所述料液的pH至8，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为50万u/g的碱性蛋白酶，保温酶解3h，得第一次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第一次蛋白酶解液的pH至7.3，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为15万u/g的中性蛋白酶保温酶解3h，得第二次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第二次蛋白酶解液的pH至3.5，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为5万u/g的胃蛋白酶保温酶解3h，然后升温至95℃，保温灭活15min，得第三次蛋白酶解液；
(4)过滤除杂：
将第三次蛋白酶解液用300目粗砂布或中速滤纸进行粗过滤、然后添加相对于所述第三次蛋白酶解液液重2％的活性炭，加热至70℃脱色0.5h，再用硅藻土过滤机过滤，得铁皮石斛小分子肽液体；
(5)脱水干燥：
先将步骤(4)中所述的铁皮石斛小分子肽液于50℃的温度下真空浓缩至其重量的20％，然后在进风温度174℃，出风温度82℃的条件进行喷雾干燥得粉末状的铁皮石斛小分子肽组合物。
实施例2
一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将铁皮石斛果实置于53℃的干燥箱中烘14.5h，破碎为100目的铁皮石斛粉以备用；
(2)铁皮石斛蛋白的变性：将所述铁皮石斛粉与去离子水按1:9的比重混合，然后加热至97℃后保温16min至铁皮石斛蛋白变性，保温结束后按48℃/min的速率降温至48℃，得料液；
(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解：
用摩尔浓度均为10％mol/L的NaOH溶液调节所述料液的pH至8.3，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为50万u/g的碱性蛋白酶，保温酶解3.5h，得第一次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第一次蛋白酶解液的pH至7.4，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为15万u/g的中性蛋白酶保温酶解3.5h，得第二次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第二次蛋白酶解液的pH至3.6，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为5万u/g的胃蛋白酶保温酶解3.5h，然后升温至95℃，保温灭活15min，得第三次蛋白酶解液；
(4)过滤除杂：
将第三次蛋白酶解液用300目粗砂布或中速滤纸进行粗过滤、然后添加相对于所述第三次蛋白酶解液液重2％的活性炭，加热至73℃脱色0.8h，再用硅藻土过滤机过滤，得铁皮石斛小分子肽液体；
(5)脱水干燥：
先将步骤(4)中所述的铁皮石斛小分子肽液于52℃的温度下真空浓缩至其重量的20％，然后在进风温度176℃，出风温度85℃的条件进行喷雾干燥得粉末状的铁皮石斛小分子肽组合物。
实施例3
一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将铁皮石斛果实置于55℃的干燥箱中烘15h，破碎为120目的铁皮石斛粉以备用；
(2)铁皮石斛蛋白的变性：将所述铁皮石斛粉与去离子水按1:10的比重混合，然后加热至100℃后保温18min至铁皮石斛蛋白变性，保温结束后按50℃/min的速率降温至50℃，得料液；
(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解：
用摩尔浓度均为10％mol/L的NaOH溶液调节所述料液的pH至8.5，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为50万u/g的碱性蛋白酶，保温酶解4h，得第一次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第一次蛋白酶解液的pH至7.6，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为15万u/g的中性蛋白酶保温酶解4h，得第二次蛋白酶解液；
用摩尔浓度均为10％mol/L的HC1溶液调节所述第二次蛋白酶解液的pH至3.7，加入相对于所述铁皮石斛粉重量1％、酶活为5万u/g的胃蛋白酶保温酶解4h，然后升温至95℃，保温灭活15min，得第三次蛋白酶解液；
(4)过滤除杂：
将第三次蛋白酶解液用300目粗砂布或中速滤纸进行粗过滤、然后添加相对于所述第三次蛋白酶解液液重2％的活性炭，加热至75℃脱色1.0h，再用硅藻土过滤机过滤，得铁皮石斛小分子肽液体；
(5)脱水干燥：
先将步骤(4)中所述的铁皮石斛小分子肽液于55℃的温度下真空浓缩至其重量的20％，然后进行冷冻干燥得粉末状的铁皮石斛小分子肽组合物。
下面对本发明实施例2中得到的铁皮石斛小分子肽组合物进行测量，其测量方法根据本行业内常用的高效液相分析方法检测小分子肽的分子量分布的JY/T024-1996，QB/T2879-2007标准对提取物的肽分子量分布做测定，其结果如下表所示：
由上表可以看出，本发明利用复合生物酶酶解技术得到的铁皮石斛小分子肽组合物，其分子量主要分布在100-700D之间，分子量分布于60-700D的小分子肽占蛋白总量的90％以上，这些分子量的小分子肽多为二肽、三肽、四肽等小分子肽，属于极易被人体吸收利用的小分子结构。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛小分子肽组合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将铁皮石斛果实烘干破碎为铁皮石斛粉以备用；
(2)铁皮石斛蛋白的变性与去杂：将所述铁皮石斛粉加入到去离子水中，加热保温至蛋白质变性，保温结束后降温得料液；
(3)铁皮石斛蛋白的复合酶解：
用NaOH溶液调节所述料液的pH至8-8.5，加入碱性蛋白酶保温酶解3-4h，得第一次蛋白酶解液；
用HC1溶液调节所述第一次蛋白酶解液的pH至7.3-7.6，加入中性蛋白酶保温酶解3-4h，得第二次蛋白酶解液；
用HC1溶液调节所述第二次蛋白酶解液的pH至3.5-3.7，加入胃蛋白酶保温酶解3-4h，灭活，得第三次蛋白酶解液；
(4)过滤除杂：将第三次蛋白酶解液经粗过滤、脱色处理后用硅藻土过滤机过滤，得铁皮石斛小分子肽液体；
(5)脱水干燥：将所述铁皮石斛小分子肽液体进行喷雾干燥或冷冻干燥得粉末状的铁皮石斛小分子肽组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烘干为将铁皮石斛果实置于50-55℃的干燥箱中烘14-15h，所述铁皮石斛粉的细度为100-120目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述铁皮石斛粉与去离子水的质比为1:8-10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述加热后保温提取为加热至95-100℃，保温14-18min，所述降温速率为45-50℃/min，降温至45-50℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的碱性蛋白酶的酶活为50万u/g，所述中性蛋白酶的酶活为15万u/g，所述胃蛋白酶的酶活为5万u/g，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶及胃蛋白酶的添加量均为所述铁皮石斛粉重量的1％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述粗过滤为用300目以上粗砂布或中速滤纸过滤。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述脱色为添加相对于所述第三次蛋白酶解液液重2％的活性炭，加热至70-75℃，搅拌条件下脱色0.5-1.0h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中进行喷雾干燥或冷冻干燥前，先将步骤(4)中所述的铁皮石斛小分子肽液于50-55℃的温度下真空浓缩至其重量的20％。
9.一种采用如权利要求1-8任一项所述方法得到的铁皮石斛小分子肽组合物，其特征在于，所述铁皮石斛小分子肽组合物中含有铁皮石斛蛋白水解得到的分子量主要分布在100-700D之间的小分子肽。
10.一种如权利要求9所述铁皮石斛小分子肽组合物在医药原料、保健食品、美容化妆品中的应用。
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