CN107674902B - 一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法。该方法以骆驼血为原料，经酶解和过滤，得到骆驼血酶解液。利用离子交换树脂柱进行吸附，0.1～5％氨水进行洗脱，进而使用色谱柱分离，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽。制备得到的驼血多肽产品含量＞90％，回收率＞70％。与现有技术相比，本发明的特点在于提供了一种用骆驼血制备具有降血糖功能驼血多肽的制备工艺；整个生产过程中使用绿色溶剂，具有成本低、效率高、环境友好、工艺路线简单等优势。本发明可为药物、保健品或食品等提供高纯度的具有降血糖作用的驼血多肽，可进一步促进骆驼的产业化开发。

Description

一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于天然产物分离提取技术领域，具体涉及一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法。

背景技术

我国是世界上骆驼养殖量较多的国家之一，根据中国统计年鉴2015资料统计，2014年全国约有骆驼33.4万峰，其中，新疆16.0万峰，内蒙古13.8万峰。按类型划分，我国的双峰驼大致分为三个驼系：新疆驼(Xinjiang camel)、苏尼特驼(Sunite camel)、阿拉善双峰驼(Alxa Bactrian camel)。目前，骆驼相关的产品主要是骆驼奶、骆驼绒、骆驼肉，以及骆驼骨工艺品、骆驼掌食品等，而骆驼血则未进行开发，除少量用于食品外，大部分被废弃，造成了资源的极大浪费。由于骆驼生存在严酷的恶劣环境条件下，与其它动物的血液相比，特殊的环境使其蛋白质类型、分子量、含量等有显著差异，具有特殊的生理、营养功能。骆驼血的蛋白质含量为20.75％，除此之外还富含钙、磷、铁及维生素A、维生素B1、维生素B2和烟酸等营养成分。

现代研究表明，人类对蛋白质的利用是将蛋白质酶解成小分子多肽或低聚肽吸收利用。小分子多肽或低聚肽具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、吸收速度快、优先吸收、在人体中合成蛋白质的速率较氨基酸快等诸多优点。因此，利用现代分离分析技术从骆驼血中制备具有特殊功能的肽，可以提高驼血中蛋白质的利用率。同时，可以促进骆驼养殖业的发展，具有较好的应用前景。骆驼血所富含的蛋白质，是制备多肽的理想原料。但是，目前市场上尚未见到骆驼血液肽的产品，其市场尚未进行开发。

目前，我国正在逐步进入老龄化社会，糖尿病是老年人群的高发病和常发病，并且有着向低龄化迈进的趋势，因此对于降低血糖类食品的研发刻不容缓。生物产业的蓬勃发展，对于具有降血糖作用的驼血多肽的推广有很好的促进作用，后续可加工制成胶囊、片剂或者饮料、饮品类等食品、保健品或药品。随着相关产品的市场开发，驼血多肽具有较好的消费上升潜力。同时，随着人民生活水平的提高，国内大中城市的高端消费群体对功能多肽产品的需求还在不断增加，多肽产品市场短期内尚供不应求。

目前，多肽的制备工艺已经进行了很多相关的研究，并取得了一定的研究成果。现阶段而言，制备工艺主要通过酶解和膜过滤法。该方法基本工艺为：原料预处理后，加入适量的酶进行酶解，酶解液进行膜过滤，得到一定分子量范围的物质。该方法优点是工艺简单，得到的多肽分子量区间相对集中，缺点是产品中含杂质太多，纯度不高，而且对滤膜的消耗量太大，成本较高，得到的多肽功能性不强。多肽纯度高低，直接决定了产品的功能、品质和用途。因此，制备高纯度的具有特定功能的驼血多肽成为本领域目前迫切需要解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有降血糖功能的驼血多肽及其制备方法，针对现有技术中存在的缺陷和不足，结合酶切技术、离子交换树脂技术和制备色谱技术，制备高纯度驼血多肽，从而弥补现有技术的不足。

本发明制备降血糖功能的驼血多肽的方法，包括以下步骤：

1)向处理后的新鲜骆驼血或冷冻后的骆驼血中加入纯水，粉碎，搅拌均匀后置于发酵罐中，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶切，酶切后进行高温灭酶灭菌；冷却至室温后，板框过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液。

2)将骆驼血酶解液直接加入离子交换树脂柱进行吸附，流速为3～15BV/h(柱体积，简称BV)，弃去残液；吸附结束后，用5～20BV的纯水进行冲洗除杂，流速为3～15BV/h，弃去水洗液；然后，用2～40BV的氨水进行洗脱，流速为3～15BV/h，收集洗脱液，得到骆驼血多肽溶液；

3)将得到的驼血多肽溶液使用色谱柱分离，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽。

步骤1)中的蛋白酶为Alcalase酶和/或动物蛋白水解酶；

步骤1)中的酶切条件为：pH为5～9，温度为45～55℃；

步骤2)中的离子交换树脂为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂或两性离子交换树脂。优选地，采用110×4型阳离子交换树脂吸附率最高，效果最好。

步骤2)中的洗脱液为0.1～5％氨水，流速为3～15BV/h。

步骤3)中的色谱填料为C8、C18或C32。

步骤3)中的色谱柱分离所用的流动相为流动相A(纯水:三氟乙酸＝99～99.95:0.05～1，v/v)，流动相B为95％乙醇，流动相C为乙酸乙酯。流动相A:B:C＝70～90:20～5:10～1(v/v/v)，流动相使用前均使用0.45μm滤膜过滤，流速为3～15BV/h，在检测波长220nm下进行检测并收集。

本发明提出了上述的具有降血糖功能的驼血多肽，可用于汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂等食品、保健食品、药品等的原料。

利用本发明方法，制备得到具有降血糖作用驼血多肽的纯度均达到90％以上，提取率大于70％。同时，除了上述离子交换树脂具有的巨大优势，洗脱剂为绿色溶剂，环境友好，可以回收多次利用。采用制备色谱技术可得到较高纯度的驼血多肽，有利于相关产品的进一步开发。与已有技术方法相比，本发明的特点在于提供了一种用骆驼血制备具有降血糖功能肽的制备工艺；整个生产过程中使用绿色溶剂，具有成本低、效率高、环境友好、工艺路线简单等优势。本发明可为药物、保健品或食品等提供高纯度的具有降血糖作用的驼血多肽，可进一步促进驼血多肽的产业化开发。

具体实施方式

申请人通过提取条件的优化，获得了具有降血糖效果的驼血多肽，从而促成了本发明。

实施例1

先将新鲜骆驼血100g置于发酵罐中，用HCl和NaOH调pH值为5，搅拌均匀，控制体系温度为46℃，然后向发酵罐中加入Alcalase酶，浓度为0.2g/L，进行酶切，酶切4h后，再将发酵罐温度升至86℃，保温20分钟，进行灭酶灭菌，冷却至室温后，板框过滤，收集滤液，得到驼血多肽酶解液。

称取200g 110×4型阳离子交换树脂，湿法装入一根内径2cm、柱高30cm的玻璃柱中，利用输液泵将驼血多肽酶解液由上端泵入树脂柱中进行吸附，流速为3BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用5BV的纯水进行冲洗，流速为3BV/h，弃去水洗液；然后用10BV的0.2％氨水进行洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，得到骆驼血多肽溶液。

将得到的骆驼血多肽溶液使用C8色谱柱分离，流动相的配制方法如下：流动相A(纯水:三氟乙酸＝99.95:0.05，v/v)，流动相B为95％乙醇，流动相C为乙酸乙酯。流动相A:B:C＝80:15:5(v/v/v)，流动相使用前均使用0.45μm滤膜过滤，流速为4BV/h，在检测波长220nm下进行检测并收集，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为91.8％，驼血多肽的提取率为72.5％。

上述的液相色谱法的测定条件如下：

色谱柱：TSK gel G2000 SWXL(300mm I.D.×7.8mm)。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.03(体积比)。

流速：0.5mL/min。

检测波长：214nm。

进样量：10μL。

实施例2

先将冷冻骆驼血500g置于发酵罐中，加入纯水500g，用HCl和NaOH调pH值为6.5，搅拌均匀，控制体系温度为50℃，然后向发酵罐中加入动物蛋白水解酶，浓度为0.5g/L，进行酶切，酶切3h后，再将发酵罐温度升至91℃，保温15分钟，进行灭酶灭菌，冷却至室温后，板框过滤，收集滤液，得到驼血多肽酶解液。

称取600g 201×4型阴离子交换树脂，湿法装入一根内径4cm、柱高60cm的层析柱中，利用输液泵将驼血多肽酶解液由上端泵入树脂柱中进行吸附，流速为8BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用7BV的纯水进行冲洗，流速为8BV/h，弃去水洗液；然后用15BV的0.3％氨水进行洗脱，流速为8BV/h，收集洗脱液，得到骆驼血多肽溶液。

将得到的骆驼血多肽溶液使用C18色谱柱分离，流动相的配制方法如下：流动相A(纯水:三氟乙酸＝99.8:0.2，v/v)，流动相B为95％乙醇，流动相C为乙酸乙酯。流动相A:B:C＝75:18:7(v/v/v)，流动相使用前均使用0.45μm滤膜过滤，流速为8BV/h，在检测波长220nm下进行检测并收集，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为93.5％，驼血多肽的提取率为70.8％。

实施例3

先将新鲜骆驼血3000g置于发酵罐中，加入纯水6000g，用HCl和NaOH调pH值为8，搅拌均匀，控制体系温度为53℃，然后向发酵罐中加入Alcalase酶和动物蛋白水解酶(1:1)，浓度为6g/L，进行酶切，酶切2.5h后，再将发酵罐温度升至95℃，保温12分钟，进行灭酶灭菌，冷却至室温后，板框过滤，收集滤液，得到驼血多肽酶解液。

称取4500g 001×7型离子交换树脂，湿法装入一根内径8cm、柱高120cm的层析柱中，利用输液泵将驼血多肽酶解液由上端泵入树脂柱中进行吸附，流速为12BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用10BV的纯水进行冲洗，流速为12BV/h，弃去水洗液；然后用20BV的1％氨水进行洗脱，流速为12BV/h，收集洗脱液，得到骆驼血多肽溶液。

将得到的骆驼血多肽溶液使用C32色谱柱分离，流动相的配制方法如下：流动相A(纯水:三氟乙酸＝99.2:0.8，v/v)，流动相B为95％乙醇，流动相C为乙酸乙酯。流动相A:B:C＝72:19:9(v/v/v)，流动相使用前均使用0.45μm滤膜过滤，流速为11BV/h，在检测波长220nm下进行检测并收集，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为90.6％，驼血多肽的提取率为71.8％。

以上实施例表明，使用的洗脱液能够满足提取率和纯度两方面的要求。

以下通过试验例进一步阐述本发明制备的驼血多肽的效果。

实施例4

一、本发明驼血多肽辅助降血糖功能检验：

1.试验目的及方法

根据国家食品药品监督管理局以国食药监保化(2012)107号印发的《辅助降血糖功能评价方法》，评价本发明制备的驼血多肽辅助降血糖的功能。受试样品为本发明实施例1、2和3制备的驼血多肽。

2.试验方法

2.1试验动物：健康昆明种成年小鼠，购自兰州大学医学实验动物中心，SPF级，雌雄各半，26±2g。

2.2高血糖小鼠建模：将四氧嘧啶用生理盐水配成溶液，取小鼠，雌雄各半，禁食3～5h后测定空腹血糖，作为其基础血糖值。然后禁食不禁水24h后腹腔注射四氧嘧啶溶液，注射剂量130mg·kg^-1每只，6天后小鼠禁食不禁水5h，测其空腹血糖值，血糖值10-25mmol·L^-1为构建的成功高血糖模型小鼠，分别用于降糖试验和糖耐量试验。

2.3试验方法

2.3.1本发明制备的驼血多肽对正常小鼠血糖的影响

取50只小鼠禁食不禁水5h后测其空腹血糖值，按其空腹血糖值随机分为空白对照组、实施例1、2、3组、阳性对照组，每组10只。阳性对照组所用食品保健品为同仁堂蜂牌胶软胶囊(北京同仁堂健康药业股份有限公司；国食健字G20060790)，去除外壳后取内容物加水制成溶液，灌胃剂量为260mg·kg^-1。将本发明实施例1、2、3制备得到的驼血多肽，加水制成溶液，分别灌胃于实施例1、2、3组小鼠，灌胃剂量为1g·kg^-1。同样的，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。各试验组每天灌胃给予相应受试样品1次，连续30天，末次灌胃给予受试样品后小鼠禁食不禁水5h，测其空腹血糖值。

2.3.2本发明制备的驼血多肽对高血糖小鼠血糖的影响

挑选造模成功的高血糖模型小鼠50只，禁食不禁水5h后测其空腹血糖值，按其空腹血糖值随机分为模型对照组、实施例1、2、3组、阳性对照组，灌胃给予受试样品的方式同2.3.1；模型对照组高血糖模型小鼠灌胃给予等体积蒸馏水，另取10只正常小鼠为空白对照，灌胃给予等体积蒸馏水。各组小鼠每天灌胃给予相应受试样品1次，连续灌胃给予相应受试样品30天，末次灌胃给予相应受试样品后小鼠禁食不禁水5h，测其空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。

计算公式：血糖下降百分率＝[(试验前血糖值-试验后血糖值)/试验前血糖]×100％。

2.3.3本发明制备的驼血多肽对高血糖小鼠糖耐量试验

挑选造模成功的高血糖模型小鼠50只，禁食不禁水5h后测其空腹血糖值，按其空腹血糖值随机分为模型对照组、实施例1、2、3组、阳性对照组，各试验组高血糖模型小鼠灌胃给予相应受试样品的方式同2.3.1，模型对照组高血糖模型小鼠灌胃给予等体积蒸馏水。各组小鼠每天灌胃给予相应受试样品1次，连续灌胃给予相应受试样品30天。各组小鼠于末次灌胃前禁食不禁水5h，测定其空腹血糖值，即为0h时的血糖值，然后灌胃给予相应受试样品或等体积蒸馏水，20min后各组小鼠经口给予葡萄糖2.0g/kg，测定给葡萄糖后0.5h、2h的各组小鼠的血糖值，计算模型对照组与各受试样品组给葡萄糖后各时间点血糖值及血糖曲线下面积的变化，作为糖耐量观察指标。

计算公式：血糖曲线下面积＝[(0h血糖值+0.5h血糖值)/2]×0.5+[(2h血糖值+0.5h血糖值)/2]×1.5。

2.3.4统计学处理试验数据均采用均数±标准差来表示，组间差异显著性用t检验比较，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。

3.试验结果：

3.1本发明制备的驼血多肽对正常小鼠血糖的影响

表1本发明制备的驼血多肽对正常小鼠空腹血糖的影响

组别	数量(只)	试验前血糖值(mmol/L)	试验后血糖值(mmol/L)
				空白对照组	10	6.83±0.56	6.78±0.88
实施例1组	10	6.79±0.72	6.71±0.57
				实施例2组	10	6.84±0.61	6.68±0.75
实施例3组	10	6.94±0.79	6.62±0.36
				阳性对照组	10	6.76±0.83	5.33±0.85<sup>*</sup>

注：试验前后自身血糖值比较，^*P＜0.05。

3.2本发明制备的驼血多肽对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响

表2本发明含有青梅提取物的组合物对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响

注：试验前后自身血糖值比较，^▲▲P＜0.01；^▲P＜0.05；与空白对照组比较，^##P＜0.01；^#P＜0.01；与模型对照组比较，^ΔΔP＜0.01；^ΔP＜0.05。

3.3本发明制备的驼血多肽对高血糖模型小鼠糖耐量的影响

表3本发明制备的驼血多肽对高血糖模型小鼠糖耐量的影响

注：与模型对照组比较，^ΔP＜0.01。

4.结论

本试验通过研究本发明实施例1、2、3制备的驼血多肽对正常小鼠的空腹血糖值、高血糖模型小鼠的血糖值和糖耐受的影响来评价本发明制备的驼血多肽辅助降血糖的功能。

首先，本试验采用健康昆明种成年小鼠作试验动物，连续30天给药，小鼠无一死亡，试验结束后处死小鼠解剖观察各脏器未发现毒性反应，说明本发明制备的驼血多肽安全性高。

从表1试验结果可知，各试验组给予相应受试样品30天后，阳性对照组受试样品能显著降低小鼠的血糖值(P＜0.05)，而本发明实施例1、2、3对正常小鼠空腹血糖值无显著影响(P＞0.05)。

从表2试验结果可知，各试验组给予相应受试样品30天后，与模型对照组相比，阳性对照组和实施例1、2、3组高血糖模型小鼠的空腹血糖值均显著降低(P＜0.05)，其中，实施例3制备的驼血多肽降血糖的效果最佳，为本发明最佳实施例。而对比例1和对比例2组高血糖模型小鼠试验后的空腹血糖值与试验前相比显著下降(P＜0.05)，但与试验后模型对照组高血糖模型小鼠的空腹血糖值相比无显著差异(P＞0.05)。

从表3试验结果可知，各试验组给予相应受试样品30天后，实施例1、2、3制备的驼血多肽和阳性对照组受试样品均能减少高血糖模型小鼠的血糖曲线下面积，与模型对照组相比均具有显著性差异(P＜0.01)，其中，实施例2制备的驼血多肽的效果最为显著。

综上所述，本发明制备的驼血多肽具有辅助降血糖的功能，安全性高，可用于制备降血糖食品、保健品和药品。此外，由试验结果可知，实施例2为本发明最佳实施例。

二、本发明驼血多肽毒性试验：

依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中毒性试验：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的健康成年昆明种小鼠和Wistar种大鼠为实验动物。

急性毒性实验：采用最大耐受剂量(MTD)试验法，剂量设为9000mg/kg BW。选昆明种小鼠20只，体重为18～22g，雌雄各10只。试验前动物禁食16h，用蒸馏水将样品浓度配成450mg/mL，然后给动物灌胃，灌胃量为0.4mL/20g BW，观察记录动物的中毒表现，每周称重一次，观察两周时间，试验结束后解剖动物进行大体观察。

表4急性毒性观察情况

由表4可见，给予受试物后，动物生长良好，未见有中毒症状，无动物死亡，试验结束后解剖动物体观察均未见异常。据此判定本发明对小鼠的急性经口毒性MTD 9000mg/kgBW，按急性毒性分级标准，属于无毒级。

大鼠30天喂养试验：分别以80、160、320mg/kg BW(相当于人体推荐用量5、10、20倍)3个剂量的样品掺入饲料连续给大鼠喂食30天，结果大鼠的体重增长、食物利用率、血常规、血液生化、脏器重量及脏器系数均无异常改变，大鼠的肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸和卵巢均未见病理组织学改变，未发现该样品对大鼠有毒性作用。

经上述各项试验证明，本发明较对照组能显著降低小鼠的空腹血糖值、减少高血糖模型小鼠的血糖曲线下面积，说明本发明具有很好的降血糖的功能，并且安全有效，无毒副作用。

Claims (4)

1.一种制备降血糖功能的驼血多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)向处理后的新鲜骆驼血或冷冻后的骆驼血中加入纯水，粉碎，搅拌均匀后置于发酵罐中，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶切，酶切后进行高温灭酶灭菌；冷却至室温后，板框过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液；

所述的蛋白酶为Alcalase酶和/或动物蛋白水解酶，酶切条件为：pH为5～9，温度为45～55℃；

2)将骆驼血酶解液直接加入离子交换树脂柱进行吸附，流速为3～15BV/h，弃去残液；吸附结束后，用5～20BV的纯水进行冲洗除杂，流速为3～15BV/h，弃去水洗液；然后，用2～40BV的氨水进行洗脱，流速为3～15BV/h，收集洗脱液，得到骆驼血多肽溶液；

所述的离子交换树脂为110×4型阳离子交换树脂；

3)将得到的驼血多肽溶液使用色谱柱分离，干燥后得到纯化后的具有降血糖功能的驼血多肽；

所述的色谱填料为C8、C18或C32；

所述的色谱柱分离所用的流动相为流动相A组成为纯水和三氟乙酸，其体积比为99～99.95:0.05～1；流动相B为95％乙醇，流动相C为乙酸乙酯；流动相A:B:C为70～90:20～5:10～1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的洗脱液为0.1～5％氨水。

3.一种驼血多肽，其特征在于，所述的驼血多肽是由权利要求1或2所述的方法制备的。

4.权利要求3所述的驼血多肽在制备降血糖功能的制品中的应用。