CN107604032B - 一种具有抗疲劳作用的驼血多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗疲劳作用的驼血多肽及其制备方法，本发明制备得到的驼血多肽产品含量＞80％，回收率＞75％。本发明与已有技术方法相比，特点在于提供了一种具有抗疲劳活性的驼血多肽的制备工艺；使用高温蒸汽进行预处理，不仅加快体系升温，而且可以使蛋白质发生变化，有利于酶切进行；整个生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好；工艺路线简单，可为食品、保健品、药品等提供具有抗疲劳活性的驼血多肽。

Description

一种具有抗疲劳作用的驼血多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳作用的驼血多肽及其制备方法。

背景技术

骆驼是骆驼科骆驼属(Camelus)的动物，是我国重要的家畜资源之一，具有重要的经济价值。骆驼血的蛋白质含量为20.51％，其中，骆驼血清的蛋白质总量中，白蛋白含量高达73.20％，白蛋白与球蛋白比率为2.72，与绵羊、牛、马等比较有极显著差异。由于骆驼生存在严酷的恶劣环境条件下，特殊的环境使其蛋白质类型、分子量、含量等有显著差异，具有特殊的生理、营养功能。骆驼作为“沙漠之舟”，其血液中的成分具有较强的抗疲劳功能。

研究表明，人类对蛋白质的利用是将蛋白质酶解成多肽进行吸收利用。骆驼血含有丰富的蛋白质，是制备多肽的理想原料。由于骆驼血的特殊性质，在相关产品的运输和储藏上也存在一定的问题。因此，先利用酶解方法将蛋白质酶解成多肽，然后进行分离富集制备较高纯度和较强抗疲劳作用的驼血多肽，可以大大提高骆驼血中蛋白质的利用率和贮存性能。随着相关技术研究的不断深入，驼血多肽的应用领域将不断加大，可以广泛应用于食品、保健品和化妆品等领域，消费的上升潜力很大，而产品价格未来将相对稳定。同时，随着人民生活水平的提高，国内大中城市的高端消费群体对功能多肽产品的需求还在不断增加，相关产品市场短期内尚供不应求。在高新技术的支持下，具有抗疲劳活性的驼血多肽新产品目标市场将会得到极大的拓展。相关的驼血多肽产品方便消费者食用，有很大的市场需求。就全球市场而言，精细加工的驼血多肽产品必将成为未来骆驼血资源开发的主导方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗疲劳作用的驼血多肽及其制备方法，针对现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种高纯度和高抗疲劳活性的驼血多肽，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，包括以下步骤：

1)先将新鲜骆驼血或者冷冻骆驼血置于发酵罐中，加水搅拌均匀，通入高温蒸汽进行预处理，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶解，酶解液进行高温灭酶灭菌。

所述的蛋白酶为Protamex复合蛋白酶和/或复合风味蛋白酶；

酶解条件是指体系pH值为5～7，温度为40～60℃，酶切时间为0.5～12h。

2)将灭酶灭菌后的骆驼血酶解液冷却至室温后，离心收集上清液，得到驼血多肽粗提取液。

步骤2)中的高速离心是指离心机转速为8000～20000转/分钟。

3)将驼血多肽粗提取液加入大孔吸附树脂柱进行反复多次吸附，流速为4～12BV/h(柱体积，简称BV)；吸附结束后，用5～20BV的纯水进行冲洗，流速为4～12BV/h；然后用5～50BV的洗脱液进行洗脱，流速为4～12BV/h，收集洗脱液，将溶液干燥后得到驼血多肽产品。

所述的大孔吸附树脂柱中使用的树脂为XDA-8、LX-68和HPD750，其质量比为1:1～3:1～5；

为了获得更好的分离效果，XDA-8:LX-68:HPD750的质量比为1:3:2；

所述的洗脱液为乙酸、乙醇和水的混合溶液，其体积比为1:1～10:89～98；

为了获得更好的分离效果，乙酸:乙醇:水的体积比为1:5:94。

利用本发明提供的驼血多肽可用于汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂等食品、保健食品、药品等的原料。

本发明方法的驼血多肽的提取率大于75％，分离纯化的驼血多肽纯度均达到80％以上，而且大孔吸附树脂的再生性能好，可以多次再生重复使用，洗脱剂无毒无害，也可以回收多次利用。与已有技术方法相比，本发明的特点在于提供了一种从骆驼血中制备高纯度和抗疲劳活性多肽的制备工艺；生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好；工艺路线简单，可为药物、保健品或食品等提供高纯度的驼血多肽。本发明可进一步促进驼血多肽的产业化开发。

具体实施方式

在驼血多肽的制备过程中，树脂的比例、洗脱液的组分及比例对纯化效果具有重要的影响，既要保证提取率，又要保证纯度。因此，申请人经过长期的研究，确定驼血多肽纯化的树脂比例、洗脱液的组分及比例。

实施例1

先将新鲜骆驼血100g置于发酵罐中，加入纯水200g，在转速为220转/分钟时搅拌均匀，通入温度为112℃的高温蒸汽进行预处理，控制体系温度为45℃，用HCl和NaOH调pH值为5.5，然后向发酵罐中加入0.5％的Protamex复合蛋白酶进行酶切，酶切2h后，再将发酵罐温度升至85℃，保温15分钟，进行灭酶灭菌。

将灭酶灭菌后的骆驼血酶解液冷却至室温后，8000转/分钟进行离心，收集离心液，得到驼血多肽提取液。

称取100g XDA-8型大孔吸附树脂、100g LX-68型大孔吸附树脂和100g HPD750型大孔吸附树脂，在水溶液中均匀混合，湿法装入一根内径4cm、柱高60cm的玻璃柱中，利用输液泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为6BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用6BV的纯水进行冲洗，流速为5BV/h，弃去水洗液；然后用10BV的乙酸:乙醇:水(1:2:97,v/v)进行洗脱，流速为5BV/h，收集洗脱液，浓缩后干燥得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，色谱条件如下：

色谱柱：TSK gel G2000SWXL(300mm I.D.×7.8mm)或性能与此相近的同类型其它适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱；

流动相为乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.1(体积比)；

流速为0.5mL/min；

检测波长为214nm；

进样量为10μL。

检测结果表明驼血多肽的纯度为83.2％，驼血多肽的提取率为76.1％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

实施例2

先将冷冻骆驼血300g置于发酵罐中，加入纯水1200g，在转速为250转/分钟时搅拌均匀，通入温度为115℃的高温蒸汽进行预处理，控制体系温度为50℃，用HCl和NaOH调pH值为6.0，然后向发酵罐中加入2％的复合风味蛋白酶进行酶切，酶切5h后，再将发酵罐温度升至90℃，保温20分钟，进行灭酶灭菌。

将灭酶灭菌后的骆驼血酶解液冷却至室温后，10000转/分钟进行离心，收集离心液，得到驼血多肽提取液。

称取300g XDA-8型大孔吸附树脂、600g LX-68型大孔吸附树脂和900g HPD750型大孔吸附树脂，在水溶液中均匀混合，湿法装入一根内径8cm、柱高120cm的玻璃柱中，利用输液泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为8BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用7BV的纯水进行冲洗，流速为8BV/h，弃去水洗液；然后用15BV的乙酸:乙醇:水(1:8:91,v/v)进行洗脱，流速为8BV/h，收集洗脱液，浓缩后干燥得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为86.8％，驼血多肽的提取率为78.9％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

实施例3

先将新鲜骆驼血1000g置于发酵罐中，加入纯水6000g，在转速为300转/分钟时搅拌均匀，通入温度为120℃的高温蒸汽进行预处理，控制体系温度为55℃，用HCl和NaOH调pH值为6.5，然后向发酵罐中加入5％的Protamex复合蛋白酶和复合风味蛋白酶(1:3)进行酶切，酶切1h后，再将发酵罐温度升至95℃，保温30分钟，进行灭酶灭菌。

将灭酶灭菌后的骆驼血酶解液冷却至室温后，高速离心，收集上清液，得到驼血多肽提取液；18000转/分钟进行离心，收集离心液，得到驼血多肽提取液。

称取400g XDA-8型大孔吸附树脂、1200g LX-68型大孔吸附树脂和800g HPD750型大孔吸附树脂，在水溶液中均匀混合，湿法装入一根内径12cm、柱高600cm的玻璃柱中，利用输液泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为10BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用12BV的纯水进行冲洗，流速为10BV/h，弃去水洗液；然后用20BV的乙酸:乙醇:水(1:5:94,v/v)进行洗脱，流速为10BV/h，收集洗脱液，浓缩后干燥得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为90.5％，驼血多肽的提取率为79.6％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

以上实施例表明，使用的洗脱液能够满足提取率和纯度两方面的要求。

以下通过试验例进一步阐述本发明制备的驼血多肽的效果。

实施例4

1、依据卫生部关于《保健食品检测与评价技术规范》缓解体力疲劳动物实验法：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的清洁级(B级)雄性健康成年昆明种小鼠48只，体重18～22g。设60、120、240mg/kg(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)BW实施例1制备的驼血多肽3个剂量的实验组，同时设一个阴性对照组(生理盐水)，共计4个组，每组随机12只动物。小鼠常规光照、饮水，25℃饲养。每日灌胃1次，灌胃量为小鼠质量的1％，阴性对照级给予等量生理盐水，连续30天后测各项指标。

(1)负重游泳实验：末次给予受试药物30min后，将鼠尾根部负荷体重5％的铅皮，置小鼠于游泳箱(约50cm x 50cm x 40cm)中游泳，水深不低于30cm，水温25℃±1℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。

若实验组游泳时间明显长于阴性对照组游泳时间，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试动物有延长小鼠负重游泳时间的作用。

(2)血清尿素测定：末次给小鼠受试物30min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，运动后休息60min后立即拨眼球采血0.5mL，置于4℃冰箱约3h，2000r/min离心15min得到血清，测定血清尿素值(酶法试剂盒)。

若实验组血清尿素含量明显低于阴性对照物，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物有减少疲劳小鼠尿素产生的作用。

(3)肝糖原测定：末次给小鼠受试物30min后，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，加入TCA，匀浆、离心，取上清液，测定肝糖原含量(蒽酮法)。

若实验组肝糖原含量明显低于阴性对照物，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物对小鼠肝糖原储备的作用。

(4)血乳酸测定：末次给予受试物30min后，将小鼠放于游泳箱中不负重游泳90min，水温30℃±1℃，休息60min后摘眼球取血，血液样品以3000r/min离心5min以分离血清，测定乳酸。

若实验组血乳酸变化值明显低于阴性对照物，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物有减小小鼠运动后血乳酸含量的作用。

实验数据采用SPSS软件做方差分析及组间比较。结果如下：

表1各组小鼠的负重游泳时间(±SD)

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	负重游泳时间(min)	P值
				阴性对照	12	15.26±4.91	-
60	12	24.58±5.83	＜0.05
				120	12	28.64±7.45	＜0.05
240	12	31.76±6.88	＜0.05

由表1可见，本发明样品各剂量组小鼠的负重(5％)游泳时间均比阴性对照组的延长，且各剂量组与隐性对照组的差异均具有显著性(P<0.05)，表明本发明的驼血多肽可延长小鼠游泳负重时间，提高运动耐力，具有一定的抗疲劳作用。

表2各组小鼠运动后血清尿素测定结果(±SD)

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	血清尿素(mg/L)	P值
				阴性对照	12	471.25±32.68	-
60	12	416.91±56.17	＜0.05
				120	12	391.64±47.38	＜0.05
240	12	387.62±36.91	＜0.05

血清尿素氮是蛋白质代谢的终产物，是评定机体对运动适应能力的重要指标之一，机体血清尿素氮含量随运动负荷的增加而增加，机体对负荷适应能力越差，血清尿素氮增加越明显。表2实验结果表明，本发明样品各剂量组小鼠的血消尿素氮含量均低于阴性对照组，其中高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P<0.05)，即驼血多肽能明显降低小鼠剧烈运动后血清尿素氨水平，说明驼血多肽减少或抑制剧烈运动中蛋白质的过量分解，提高了机体对剧烈运动的适应能力，使耐力增加。

表3各组小鼠肝糖原含量测定结果(±SD)

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	肝糖原(mg/g)	P值
				阴性对照	12	12.25±3.68	-
60	12	16.91±5.17	＜0.05
				120	12	19.64±7.38	＜0.05
240	12	20.62±6.91	＜0.05

肝糖原是血糖的储存库，在机体血糖降低时可迅速分解释放入血，以维持血糖水平的稳定。表3结果表明，本发明样品各剂量组小鼠的肝糖原含量均高于阴性对照组，且各剂量组与阴性对照组的差异均具有极显著性(P<0.01)，表明该样品具有促进小鼠的肝糖原储备的作用。驼血多肽能够提高肝糖原储备量和减少运动时肝糖原的消耗，为机体提供更多的能量来达到抗疲劳的目的。

表4各组小鼠运动后血乳酸含量测定结果(±SD)

剂量组(mg/kg BW)	动物数(只)	血乳酸(mmol/L)	P值
				阴性对照	12	26.25±3.68	-
60	12	24.91±5.17	＜0.05
				120	12	21.64±7.38	＜0.05
240	12	23.62±6.91	＜0.05

血乳酸是评价机体疲劳的重要标志物，机体在长时间剧烈运动后，体内堆积过多乳酸是引起运动性疲劳的一个重要原因，因为机体内乳酸积累过多会影响机体内环境的相对稳定和体内正常代谢过程。由表4可见，到补充驼血多肽可具有抑制血乳酸升高作用，且均具有极显著性(P<0.01)。说明驼血多肽能及时消除由于剧烈运动而产生的乳酸，从而减轻疲劳。

总结：研究表明，分别经口给予小鼠60、120、240mg/kg BW(分别相当于人体推荐量5、10、20倍)剂量的本发明样品30天，能延长小鼠的负重游泳时间，减少疲劳小鼠的血清尿素产生、增加小鼠的肝糖原的储备量、减小小鼠运动后血乳酸含量。由此可见，本发明所得的驼血多肽产品具有缓解体力疲劳功能的作用。

2、依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中毒性试验：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的健康成年昆明种小鼠和Wistar种大鼠为实验动物。

急性毒性实验：采用最大耐受剂量(MTD)试验法，剂量设为7200mg/kgBW。选昆明种小鼠20只，体重为18-22g，雌雄各10只。试验前动物禁食16h，用蒸馏水将样品浓度配成360mg/mL，然后给动物灌胃，灌胃量为0.4mL/20gBW，观察记录动物的中毒表现，每周称重一次，观察两周时间，试验结束后解剖动物进行大体观察。

表5急性毒性观察情况

由表5可见，给予受试物后，动物生长良好，未见有中毒症状，无动物死亡，试验结束后解剖动物体观察均未见异常。据此判定本发明对小鼠的急性经口毒性MTD 7200mg/kgBW，按急性毒性分级标准，属于无毒级。

大鼠30天喂养试验：分别以60、120、240mg/kg BW(相当于人体推荐用量5、10、20倍)3个剂量的样品掺入饲料连续给大鼠喂食30天，结果大鼠的体重增长、食物利用率、血常规、血液生化、脏器重量及脏器系数均无异常改变，大鼠的肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸和卵巢均未见病理组织学改变，未发现该样品对大鼠有毒性作用。

经上述各项试验证明，本发明较对照组能显著延长小鼠游泳时间，显著增加小鼠肝糖元含量，小鼠血乳酸含量和血清尿素水平明显降低，说明本发明具有很好的缓解疲劳的功能，并且安全有效，无毒副作用。

Claims (3)

1.一种驼血多肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：

1）先将新鲜骆驼血或者冷冻骆驼血置于发酵罐中，加水搅拌均匀，通入高温蒸汽进行预处理，然后向发酵罐中加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解液进行高温灭酶灭菌；

酶解条件是体系pH值为5.5，温度为45℃，酶切时间为2 h；

2）将灭酶灭菌后的骆驼血酶解液冷却至室温后，离心收集上清液，得到驼血多肽粗提取液；

3）将驼血多肽粗提取液加入大孔吸附树脂柱进行反复多次吸附，流速为4～12 BV/h；吸附结束后，用5～20 BV的纯水进行冲洗，流速为4～12 BV/h；然后用5～50 BV的洗脱液进行洗脱，流速为4～12 BV/h，收集洗脱液，将溶液干燥后得到驼血多肽产品；

所述的大孔吸附树脂柱中使用的树脂为XDA-8、LX-68和HPD750，其质量比为1:1:1；

所述的洗脱液为乙酸、乙醇和水的混合溶液，其体积比为1:2:97。

2.一种驼血多肽，其特征在于，所述的驼血多肽是由权利要求1所述的方法制备的。

3.权利要求2所述的驼血多肽在制备抗疲劳药品中的应用。