CN112979748B - 一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽，其氨基酸序列为Gly‑Thr‑Tyr‑Trp(GTYW)。本发明所提供的活性肽在慢性酒精性肝损伤动物模型实验中，可以显著降低小鼠血清AST、ALT活力及肝脏/血清TG含量，显著升高小鼠肝脏AST、ALT活力，并且通过病理切片可看到由乙醇导致的肝组织损伤逐渐改善，由此表明GTYW具有预防慢性酒精性肝损伤的作用。本发明不仅能够提高豆粕的经济附加值，还为保肝护肝产品的开发利用提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽。
背景技术
酒作为一种饮品，无论是在日常饮食，还是在社交场合，都是必不可少的。适度饮酒，不仅能使人精神愉悦，起到缓解疲惫、解忧消愁的作用，还能促进血液流动、胃肠消化等。然而过度饮酒，尤其是长期慢性饮酒，会对多种器官系统造成损伤，例如导致肝损伤。近年来，酒精性肝病的发病率逐年上升，酒精已成为仅此与肝炎病毒导致肝损伤的第二大病因，严重危害到了人类的生命健康。因此，开发安全有效的保护护肝产品，具有重要的社会意义和实用价值。
目前市面上存在的保肝护肝产品，大多是天然来源的粗提物，虽然也有一定的保肝效果，但是其成分不能确定，质量也难以保证。因此，利用现代技术对提取的天然产物进行分离纯化，并对其组成进行鉴定，明确具体的生物活性成分，是开发新一代保肝护肝产品的重要手段。
豆粕是豆油加工的主要副产物，在国内主要应用于畜牧业，在食品工业上应用较少，造成了豆粕资源的极大浪费。豆粕中含有丰富的优质蛋白，是制备生物活性肽的良好来源。研究发现，用豆粕制备活性肽，具有良好的抗氧化、抗疲劳、降血压等活性，而氧化应激是导致酒精性肝损伤的重要发病机制之一，因此，豆粕活性肽具有潜在的预防酒精性肝损伤的作用，然而目前并未有相关的研究报道。
本发明是从豆粕中制备了活性肽，经分离纯化及质谱鉴定，确定了出一条氨基酸序列。通过慢性酒精性肝损伤的动物模型，发现该序列活性肽具有预防慢性酒精性肝损伤的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽，以解决开发具有明确生物活性成分的保肝护肝产品问题。
本发明的一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽，其获得可利用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶对豆粕进行酶解，并借助多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和液相色谱)实现，也可以通过固相合成的方法获得。优选为通过固相合成的方法获得。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
(1)活性肽的制备、分离纯化及鉴定
将市售的豆粕通过粉碎机破碎，并经过60目筛子筛分得到豆粕粉。按照底物浓度10％调配豆粕溶液，搅拌均匀后进行超声处理。超声结束后，将溶液置于煮沸的水浴锅中进行蛋白质变性。变性后的溶液降温至30～60℃，用酸碱液调节pH至碱性，然后加入碱性蛋白酶开始酶解，加酶量3000～11000U/g，酶解时间1-5h。酶解结束后，将溶液置于煮沸的水浴锅中进行灭酶。灭酶后的溶液需降至室温，然后在低温下离心得到活性肽。对活性肽进行超滤处理，分离纯化出分子量小于1kDa的组分，对该组分进行脱盐处理，然后借助LC-MS/MS鉴定结构。依据质谱图信息，并结合软件分析及蛋白质数据库，确定出活性肽的氨基酸序列为Gly-Thr-Tyr-Trp(GTYW)。
(2)活性肽GTYW具有预防慢性酒精性肝损伤的作用
采用固相合成法合成活性肽GTYW。通过在慢性酒精性肝损伤的动物模型中灌胃GTYW，发现活性肽能够显著降低小鼠血清中AST、ALT活力及肝脏/血清中TG含量，显著升高小鼠肝脏中AST、ALT活力，能改善小鼠病理切片中由乙醇导致的肝组织损伤。
本发明具有以下有益效果：
(1)以豆粕为原料，采用超声辅助酶解法制备活性肽，经过分离纯化获得分子量小于1kDa的组分，将该组分通过液相二级质谱鉴定，获得氨基酸序列Gly-Thr-Tyr-Trp(GTYW)；
(2)活性肽GTYW在慢性酒精性肝损伤动物模型实验中，可以显著降低小鼠血清AST、ALT活力及肝脏/血清TG含量，显著升高小鼠肝脏AST、ALT活力，并且通过病理切片可看到由乙醇导致的肝组织损伤逐渐改善，说明GTYW具有预防慢性酒精性肝损伤的作用；
(3)不仅能够提高豆粕的经济附加值，还为保肝护肝产品的开发利用提供新思路。
附图说明
图1GTYW的质谱图；
图2GTYW的结构式；
图3各组实验小鼠的肝脏系数；
图4各组实验小鼠的血清指标(A：血清AST和ALT活性，B：血清TG含量)；
图5各组实验小鼠的肝脏指标(A：肝脏AST和ALT活性，B：肝脏TG含量)；
图6各组实验小鼠的病理切片(400×)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。
实施例1：活性肽的制备、分离纯化及鉴定
(1)将市售的豆粕通过粉碎机破碎，并经过60目筛子筛分；
(2)按照底物浓度9％调配溶液，搅拌均匀后超声处理，超声功率300w，超声时间9min；
(3)超声结束后，将溶液置于煮沸的水浴锅中蛋白质变性10min；
(4)将变性后的溶液降温至50℃，用酸碱液调节pH至8.0，然后加入碱性蛋白酶开始酶解，加酶量7000U/g，酶解时间3h；
(5)酶解结束后，将溶液置于煮沸的水浴锅中灭酶10min；
(6)灭酶后的溶液降至室温，在4℃，4000r/min下离心20min，得到活性肽；
(7)对活性肽进行超滤处理，将活性肽依次通过分子量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，最终分离纯化出分子量小于1kDa的组分；
(8)将分子量小于1kDa的组分在40℃下真空浓缩，并冷冻干燥成活性肽粉；
(9)将分子量小于1kDa的活性肽粉进行脱盐处理；
(10)将脱盐后的肽组分进行LC-MS/MS鉴定，色谱条件：使用C18色谱柱；流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱：0-60min，5-35％B；60-64min，35-75％B；64-74min75％B；流速为300nL/min。质谱条件：纳米ESI源；采用数据依赖性采集模式，先在FT模式下以60000的分辨率进行全MS扫描，然后对初始MS扫描中的15种最丰富离子进行CIDMS/MS扫描；
(11)依据质谱图信息，并结合软件分析及蛋白质数据库，确定出活性肽的氨基酸序列为Gly-Thr-Tyr-Trp(GTYW)，位于大豆蛋白(B2ZF64-1)的486-489残基位置，其分子质量为525.55Da，等电点是7.0(如附图1)。GTYW的结构式如图2所示。
实施例2：活性肽GTYW具有预防慢性酒精性肝损伤的作用
实验过程中所用的活性肽GTYW，是通过固相合成得到的，纯度为95％。
实验动物分组及造模方法：选取SPF级健康雄性ICR小鼠40只饲养于动物房，温度控制为24±2℃，湿度控制为60±5％，光照时间为12h/天。适应环境一周后，将实验小鼠随机分为4组，每组10只，依次为空白组、模型组、对照组、活性肽组。每天灌胃2次，每次间隔2h，持续4周。第一次灌胃时，空白组和模型组灌胃生理盐水，对照组灌胃50mg/kg的GSH溶液(阳性药物)，活性肽组灌胃50mg/kg的GTYW溶液(实验药物)。2h后第二次灌胃，除空白组灌胃生理盐水外，其他组均灌胃50％的酒精。每周灌胃的酒精量会增加1mL/kg，第一周为9mL/kg，到第四周为12mL/kg。整个实验期间，每天记录小鼠的体重变化及健康状况。
样品采集：最后一次灌胃前禁食不禁止水12h，灌胃酒精后1h采集小鼠的血清和肝脏。采集的血样静置于冰盒中，待部分血清析出后，在4℃下，以3500r/min离心10min，取上清液检测AST、ALT和TG。采集的肝脏，一部分制备成10％的肝脏组织匀浆，用于检测肝脏中的AST、ALT和TG，一部分固定于4％的组织固定液中，用于HE病理切片分析。
统计学分析：所有实验结果均以平均值±标准差表示(Mean±SD)，采用单因素方差分析(ANOVA)比较各组间的差异性，选择“Duncan”检验进行显著性分析，*表示空白组与各组间差异显著(p<0.05)，**表示空白组与各组间差异极显著(p<0.01)，#表示模型组与各组间差异显著(p<0.05)，##表示模型组与各组间差异显著(p<0.05)。
结果与分析：
1.实验小鼠的体重变化
表1不同处理对实验小鼠的体重影响(Mean±SD，n＝10)
整个实验期间跟踪小鼠体重，结果如表1所示。初始体重为适应环境后的体重，由表可知，随机分组后各组间无差异性。第一周灌胃9mL/kg酒精，各组间同样无差异。第二周灌胃10mL/kg酒精，活性肽组与空白组无差异，模型组和对照组与空白组有差异。第三周灌胃11mL/kg酒精，活性肽组与空白组依旧无差异，同时，模型组与空白组也无差异，但是模型组的误差较大，对照组与空白组依旧差异极显著。第四周灌胃12mL/kg酒精，各组与空白组均有差异。从第一周到第三周，模型组和对照组的体重增长速率明显比空白组慢，可能是由于灌胃酒精引起的食欲不振，而灌胃GTYW比GSH更能够缓解这种不适，所以活性肽组的体重变化与空白组无异，之所以最后一周出现差异，可能是因为灌胃酒精量过高，活性肽的作用效果减弱。
2.实验小鼠的肝脏系数
实验小鼠的肝脏系数结果如附图3所示，当肝脏受损时，肝脏系数会受到影响。由图可知，模型组的肝脏系数较大，并且与空白组具有显著性差异，说明模型组的肝脏受损。对照组和活性肽组均与空白组无差异，但对照组与模型组有差异，而活性肽组无差异，说明在肝脏系数这一指标上，对照组对肝脏的保护作用要比活性肽组好。
3.实验小鼠的肝脏损伤情况
血清AST和ALT的结果如图4(A)所示。AST和ALT主要存在于肝细胞中，当肝细胞发生损伤时，AST和ALT会从肝细胞中流出并进入血液，因此血清中AST和ALT活性的增加是作为判断肝损伤的重要指标。由图可知，模型组的AST和ALT与空白组相比均有显著性增加，其中ALT为极显著增加，表明模型组的肝脏发生了损伤。对照组及活性肽组的AST和ALT与空白组相比均无显著性差异，而与模型组相比均差异显著，说明GSH和GTYW均能保护由酒精引起的肝损伤，并且在血清AST和ALT这一指标上，活性肽GTYW的作用与GSH相近。
血清TG的结果如图4(B)所示。酒精的摄入会引起肝脏损伤，进而引起脂质代谢紊乱，因此血清中TG含量的升高也是判断肝损伤重要指标之一。由图可知，模型组的TG含量最高，与空白组差异极显著，这与血清AST和ALT的结果相一致，均可说明模型组的肝脏受损。对照组与模型组差异极显著，与空白组无差异，说明灌胃GSH能够缓解由肝损伤引起的脂质代谢紊乱，从而起到保护肝脏的作用。活性肽组不仅与模型组差异极显著，与空白组同样差异极显著，说明在缓解脂质代谢紊乱方面，活性肽的作用要比GSH强。
肝脏AST和ALT的结果如图5(A)所示。因为AST和ALT主要存在于肝细胞中，因此肝脏中AST和ALT的活性减少反而意味着肝脏受损，这与血清的结果正好相反。由图可知，肝脏AST及ALT与血清AST和ALT的趋势基本一致，唯一不同的是，在肝脏AST中模型组与空白组之间无统计学意义上的差异，这可能是由于模型组的误差较大所致。
肝脏TG的结果如图5(B)所示。该结果同样与血清TG结果相近，不同的是在血清TG中，GTYW的作用要比GSH好，而在肝脏TG中，GSH的作用要比GTYW的好。但TG这一指标，无论是在血清中还是肝脏中，都可以说明活性肽GTYW确实具有缓解脂质代谢紊乱的作用。
综合血清及肝脏的AST、ALT和TG指标可发现，在酒精的干预下，模型组的肝脏确实受损，而对照组和活性肽组具有改善肝损伤的作用，由此表明活性肽GTYW具有预防慢性酒精性肝损伤的作用。
4.实验小鼠的病理切片
肝脏HE切片的结果如图6所示。如图，空白组的肝细胞结构完整，排列整齐，细胞核清晰可见，无组织学上的异常。模型组的肝细胞边界模糊，部分细胞出现肿胀，排列松散，肝索结构基本消失，并且在细胞核周围还分布有大小不一的脂滴。与模型组相比，对照组的肝细胞结构较为完整，但也有部分细胞核缺失，排列也较为整齐，并未见脂滴。活性肽组的肝细胞结构完整，并沿肝索整齐排列，细胞核清晰，细胞浆均匀，虽然细胞核周围存在少量的脂肪滴，但与模型组相比具有明显的改善作用。
肝脏的组织病理情况与肝脏及血清的理化指标检测结果基本一致，说明活性肽GTYW具有良好的预防小鼠慢性酒精性肝损伤的作用，并且该作用效果与已被证实具有保肝护肝作用的GSH相近。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对于本领域的普通技术人员，可以在不脱离本发明的原理和精神的情况下，对上述实施例进行多种改进和润饰，这些改进和润饰都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽
<140> 2021104092873
<141> 2021-04-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Thr Tyr Trp
1
Claims (7)
1.氨基酸序列为Gly-Thr-Tyr-Trp(GTYW)的活性肽在制备预防慢性酒精性肝损伤的药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品降低血清中谷草转氨酶AST的活力、降低血清中谷丙转氨酶ALT的活力和/或降低血清中总胆固醇TG的含量。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品提高肝脏中谷草转氨酶AST的活力、提高肝脏中谷丙转氨酶ALT的活力提高和/或降低肝脏中总胆固醇TG的含量。
4.一种预防慢性酒精性肝损伤的药品，其特征在于，含有氨基酸序列为Gly-Thr-Tyr-Trp(GTYW)的活性肽。
5.根据权利要求4所述的药品，其特征在于，所述药品降低血清中谷草转氨酶AST的活力、降低血清中谷丙转氨酶ALT的活力和/或降低血清中总胆固醇TG的含量。
6.根据权利要求4所述的药品，其特征在于，所述药品提高肝脏中谷草转氨酶AST的活力、提高肝脏中谷丙转氨酶ALT的活力提高和/或降低肝脏中总胆固醇TG的含量。
7.根据权利要求4所述的药品，其特征在于，所述药品为口服剂型。
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