CN117143949B - 一种南极磷虾源高f值寡肽及其在护肝中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种南极磷虾源高F值寡肽及其在护肝中的应用,所提供的高F值寡肽,是将南极磷虾先用糜蛋白酶进行酶解,灭酶后,再用风味蛋白酶进行酶解;灭酶的酶解液用活性炭进行吸附,去除活性炭后获得的。所提供的高F值寡肽,其中两种寡肽的序列为VDYG或VEDD。本发明所提供的方法制备的南极磷虾寡肽的F值远高于其他酶解组合,从而解决了目前选用酶切位点广泛的蛋白酶而引起的酶消耗量大、生产成本高、稳定性差等问题,从而实现了高F值肽的定向制备。所制备的寡肽符合高F值寡肽的要求。本发明制得的高F值寡肽可以加速乙醇在肝脏内的代谢,保护酒精对肝脏的损伤,具有醒酒护肝的功效。
Description
技术领域
本发明属于多肽制备技术领域,具体涉及一种南极磷虾源高F值寡肽及其在护肝中的应用。
背景技术
酒精刺激机体氧化产生氧化应激产物自由基,自由基能够激活磷脂酶,同时导致脂质过氧化反应,造成细胞膜通透性增加,流动性发生改变,会使人体的免疫功能受损。而且酒精还会抑制人体中枢神经系统,长期饮酒导致慢性酒精中毒还会引起小脑萎缩。
除药物外,目前市面上常见的具有醒酒效果的产品有刺梨解酒口服液、牛樟芝解酒口服液、葛花解酒口服液等植物源口服液。这些从天然产物中提纯或是由天然产物与中草药、果蔬混合制备的产品中含有能够增强酒精代谢或是抑制肠胃吸收酒精的黄酮类化合物、皂苷类化合物、多糖类物质、多酚类物质。与之相比,小分子肽类物质的营养更加全面,吸收效果更好。高F值寡肽具有醒酒护肝的作用已经得到广泛的认可,其含有丰富的支链氨基酸,能够提高血液中丙氨酸和亮氨酸浓度,产生稳定的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,有效降低血乙醇浓度。
南极磷虾具有典型的高蛋白特点,南极磷虾中蛋白质含量高达50%以上(以干重计),可以直接向人类提供大量的动物蛋白,被称为“世界蛋白质资源库”,是开发具有特定功能的生物活性肽的良好原料来源。测定南极磷虾氨基酸组成可以发现其支链氨基酸组成占整体氨基酸组成的20%左右,以南极磷虾为原料开发具有醒酒护肝活性的产品具有广阔的前景。
高F值寡肽的制备过程较为复杂,工艺的关键所在为提高F值。目前国内外研究者主要选用单酶或复合酶对原料进行酶解,主要选择的酶有中性、碱性、木瓜等蛋白酶,这些蛋白酶的酶切位点广泛,导致水解过程中特定酶切目标氨基酸不足,酶解效果并不好。
发明内容
本发明提供了一种南极磷虾源高F值寡肽及其在护肝中的应用,即一种基于特定的内切酶和外切酶结合水解南极磷虾,再进一步吸附芳香族氨基酸所制备的高F值寡肽。
本发明首先提供一种以南极磷虾为原料所制备的高F值寡肽,是将南极磷虾先用糜蛋白酶进行酶解,灭酶后,再用风味蛋白酶进行酶解;灭酶的酶解液用活性炭进行吸附,去除活性炭后获得本发明的南极磷虾高F值寡肽;
所述的使用糜蛋白酶进行酶解,是在pH 8.0、温度为37℃条件下进行酶解;
所述的使用风味蛋白酶进行酶解,是在pH 7.5、温度为50℃条件下进行酶解;
所述的活性炭进行吸附,是调节酶解液的pH为4.5后进行吸附。
所述的南极磷虾源高F值寡肽,其序列为VDYG或VEDD。
本发明所提供的南极磷虾源高F值寡肽可用于制备护肝制品。
本发明所提供的方法制备的南极磷虾寡肽的F值远高于其他酶解组合,从而解决了目前选用酶切位点广泛的蛋白酶而引起的酶消耗量大、生产成本高、稳定性差等问题,从而实现了高F值肽的定向制备。所制备的寡肽的F值为29.01±0.37,符合高F值寡肽的要求。本发明制得的高F值寡肽可以加速乙醇在肝脏内的代谢,保护酒精对肝脏的损伤,具有醒酒护肝的功效。与市售玉米醒酒肽相比,南极磷虾高F值寡肽醒酒和护肝效果更佳。
附图说明
图1为本发明中两步酶筛选过程酶解效果比较图(不同酶类型对F值(A)、DH和PR(B)的影响,不同酶组合对OD220/OD280(C)、F值(D)的影响),
图2为本发明中糜蛋白酶酶解效果比较图(不同糜蛋白酶添加量(A)、水解时间(B)、底物浓度(C)对糜蛋白酶水解效果的影响),
图3为本发明中风味蛋白酶酶解效果比较图(不同风味蛋白酶添加量(A)和水解时间(B)对风味蛋白酶水解效果的影响),
图4为本发明中活性炭吸附效果比较图(活性炭添加量(A)和吸附时间(B)对吸附效果的影响),
图5为本发明中人工神经网络建立进行水解控制图(GLU-LYS-BP-ANNs的结构图(A),样本值与拟合值的比较分析(B)和拟合误差分析(C)),
图6为本发明中南极磷虾高F值寡肽对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏状态的影响图,
图7为本发明中南极磷虾高F值寡肽对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能指标(ALT和AST水平)的影响图,
图8为本发明中南极磷虾高F值寡肽对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏中ADH和ALDHmRNA的影响图。
具体实施方式
F值是指寡肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的摩尔比值,高F值低聚肽(high F-value oligopeptide)是由动植物蛋白经酶解后制得的支链氨基酸含量高、芳香族氨基酸含量低的寡肽,其比值大于20,以低苯丙氨酸寡肽为代表。
本发明选用特异性蛋白酶进行定向酶切,内切酶酶解将芳香族氨基酸暴露在肽链末端,经过外切酶将芳香族氨基酸切下,后进行芳香族氨基酸的进一步吸附。
本发明所提供的方法,可以减小酶的消耗量、降低生产成本,实现过程可控。制备得到的南极磷虾高F值寡肽具有醒酒护肝的功能,可用于制备具有醒酒护肝功效的药品、保健品和食品。
本发明所提供的方法,包括如下的步骤:
(1)南极磷虾虾肉与蒸馏水以一定比例混合后匀浆,调节匀浆液pH值,加酶后在一定温度下水浴,120rpm振荡酶解,沸水浴灭酶后冷却至室温。
(2)调节水解液pH,加入第二步水解酶进行酶解,沸水浴灭酶后冷却至室温。
(3)调节水解液pH,酶解液中加入一定量的活性炭于室温振荡吸附,过滤脱除活性炭后冷冻干燥,即为南极磷虾高F值寡肽。
作为本发明的一种优选方案,步骤(1)中,所述内切酶为糜蛋白酶。糜蛋白酶酶解条件:酶解时间4h,加酶量2%,料液比(m/v)1:20,酶解温度37℃,酶解pH为8。此条件下得到的水解产物水解效果较好且F值高。
作为本发明的一种优选方案,步骤(2)中,所述外切酶为风味蛋白酶。风味蛋白酶酶解条件:酶解时间3h,加酶量2%,酶解温度50℃,酶解pH为7.5。此条件下得到的水解产物水解效果较好且F值高。
作为本发明的一种优选方案,步骤(3)中,活性炭吸附pH为4.5,活性炭添加量为3g/100mL,吸附时间为90min,使用0.8μm的滤膜进行过滤。此条件下活性炭对芳香族氨基酸的吸附效果最好且F值高。
本发明使用生物传感器动态监测水解过程,利用生物传感器响应因子与酶解特征建立关联,直观呈现出糜蛋白酶和风味蛋白酶酶解过程中的动态变化,对南极磷虾高F值寡肽的制备进行监控,实现定向制备。其中酶解监控响应因子为谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)。
本发明使用UHPLC-Q-TOF对南极磷虾高F值寡肽进行序列鉴定,同时以体外乙醇脱氢酶(ADH)激活率为指标,使用分子排阻色谱以及高效液相色谱对HFO寡肽进行分离纯化,进一步对分离组分进行收集和序列鉴定。
本发明所提供的高F值寡肽,鉴定共得到78条肽段中含有氨基酸残基数在4~16之间,其中79%的肽段含有支链氨基酸Leu、Val或Ile残基。
本发明所提供的高F值寡肽对体外乙醇脱氢酶(ADH)具有激活效果,通过SephadexG15分离共收集得到5个组分,其中G15-F1组分具有最强的ADH激活效果。利用RP-HPLC进一步分离G15-F1组分获得5种组分,其中R-F1的OD220/OD280最高,是发挥醒酒护肝活性的典型肽段组分。通过对组分R-F1进行肽序列鉴定,选择置信区间>95%的肽序列,鉴定出具有高活性肽段2条,分别为VDYG和VEDD。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1:制备南极磷虾高F值寡肽
将南极磷虾流水解冻后使用厨房纸吸干表面水分,从碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和糜蛋白酶六种酶中选择第一步酶解用酶,按照酶的最适浓度和最适pH进行酶解。以水解度(DH)、蛋白质得率(PR)以及F值筛选最佳用酶。结果如图1到图5所示,吸附前,糜蛋白酶水解产物F值为3.95±0.27,显著高于其他水解产物;吸附后,糜蛋白酶水解产物F值显著升高至9.37±0.82。糜蛋白酶水解产物的水解度和蛋白质回收率分别为20.52±0.92%和87.79±1.02%,蛋白质回收率高于其他组,因此选用糜蛋白酶作为第一步水解用酶。
第一步酶解完成后冷却至室温,选取中性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶继续酶解。根据OD220/OD280、F值筛选第二步最佳用酶。从图1中可以看出,糜蛋白酶-风味蛋白酶组合的水解产物OD220/OD280显著高于其他组。经风味蛋白酶酶解、活性炭吸附后,糜蛋白酶水解产物F值显著升高至22.24±0.78,符合高F值标准,即F值>20。其他酶组合F值均小于20,因此选用糜蛋白酶和风味蛋白酶作为两步水解酶。
确定两步酶水解的最佳用酶后,将南极磷虾按照料液比(1:20,m/v)进行匀浆,调节匀浆液pH至8,加入糜蛋白酶2%在37℃水浴120rpm振荡4h,沸水浴灭酶后得到第一步水解液。冷却后调节pH至7.5,加入风味蛋白酶2%在50℃水浴120rpm振荡2h,沸水浴灭酶后得到第二步水解液。冷却后调节pH至4.5,加入活性炭粉末(3g/100mL),在25℃下130rpm振荡吸附90min,经0.8μm滤膜过滤并冷冻干燥,得到南极磷虾高F值寡肽。
选用谷氨酸和赖氨酸作为响应因子,结合糜蛋白酶添加量以及酶解时间、料液比作为神经网络输入节点,以F值和水解度作为输出节点,实现了糜蛋白酶水解过程的在线快速监控。动态监控模型参数如下所示:
隐层为1层,输入层与隐层之间使用logsig传递函数,隐层与输出层之间使用线性purelin函数,网络训练函数采用trainlm,适应性学习函数采用LEARNGDM,性能函数采用MSE,训练误差设为0.00001。使用糜蛋白酶加酶量,底物浓度,酶解时间和Glu浓度以及Lys浓度作为输入层节点,使用DH和F值作为输出层节点。最终得到:F值的仿真值与输出值的R2值为0.9793,DH的仿真值与输出值的R2值为0.9909,拟合性较好。DH的误差范围在-0.1%~0.1%之间,F值的误差范围在-0.2~0.1%,可用来监控水解过程。
实施例2:南极磷虾高F值寡肽的效果
下面通过建立急性饮酒小鼠模型进一步说明南极磷虾高F值寡肽的醒酒护肝生理功能。
选用雄性昆明小鼠适应性喂养2周后,每组12只随机分组,分为六组,分别为正常组(Normal)、模型组(Model)、阳性对照组(Positive)、低剂量组(L-HFO)、高剂量组(H-HFO)和市售玉米肽组(Corn)。实验各组按照设定的灌胃内容及剂量连续灌胃14天,末次灌胃4h后进行酒精造模,禁食不禁水,记录小鼠的翻正反射时间以及醒酒时间。12h后进行2次酒精造模,禁食不禁水,2h后小鼠眼球取血脱颈处死,取材。
表1:南极磷虾高F值寡肽(HFO)对急性饮酒小鼠翻正反射的影响表
注:不同的字母代表具有显著性差异(P<0.05)
如表1所示,HFO干预后小鼠的LORR潜伏期和LORR持续时间与模型组相比存在显著性差异(P<0.05),且高剂量HFO组小鼠的LORR持续时间低于低剂量HFO组,说明通过HFO干预,小鼠的醉酒时间延长,醒酒时间缩短。与市售玉米肽组相比,高剂量HFO组小鼠的醉酒率更低,LORR持续时间更短。
各组小鼠肝脏切片的H&E染色结果如图6所示。空白对照组肝细胞形态正常,细胞质丰满,肝细胞有序,未观察到组织病理学变化。模型组酒精诱导之后的肝细胞表现有坏死,淋巴浆细胞浸润、空泡化现象。与模型组相比,市售玉米肽,HFO低剂量组和高剂量组的肝细胞病变情况有所减轻。灌胃高剂量HFO的小鼠肝细胞中央静脉清晰,细胞结构完整且细胞核周围空泡较少,这一现象与阳性对照组相似。得到结论南极磷虾高F值寡肽能够在一定程度上减轻酒精诱导造成的小鼠肝脏损伤。
血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平反映了小鼠肝细胞受损的程度,当小鼠肝细胞受损时,其肝脏通透性会增强,ALT和AST进入血液,血液中AST和ALT水平增加。如图7所示,与模型组相比,通过南极磷虾高F值寡肽干预后建立饮酒模型的小鼠血清中的ALT和AST水平显著降低。与市售玉米肽组相比,HFO组更能够有效抑制血清中AST的升高。这说明,摄入南极磷虾高F值寡肽可以有效保护小鼠的肝脏受损。
乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)是人体摄入酒精后发挥主要代谢作用的酶。与正常组相比,模型组小鼠肝脏的ADH和ALDH mRNA水平均显著下降。HFO的干预能够使小鼠肝脏中的ADH和ALDH mRNA水平上调。其中L-HFO可以使ADH和ALDH分别上调143.74%和37.68%,H-HFO可以使ADH和ALDH分别显著上调241.29%和119.14%。这表明,HFO可以通过调节ADH的活力来促进酒精代谢,对ALDH也有一定的作用,从而在一定程度上加速酒精代谢,减轻酒精对小鼠的刺激作用。
实施例3:南极磷虾高F值寡肽的序列鉴定
通过UHPLC-Q/TOF对第一实施例中南极磷虾高F值肽进行肽序列鉴定,DDA采集后搜库一共匹配到78条肽(置信区间>90%),如下表所示。这些肽的氨基酸残基数在4~16之间,其中79%的肽段含有支链氨基酸Leu、Val或Ile残基。表明南极磷虾高F值寡肽具有潜在的醒酒护肝活性。
表2:南极磷虾高F值寡肽的序列鉴定表
通过Sephadex G15对HFO进行分离,共获得五个组分,进一步测定各组分的ADH激活率,与HFO寡肽相比,G15-F1、G15-F3、G15-F4组分的ADH激活率显著上升。其中G15-F1组分活性最强,浓度为0.5mg/mL时G15-F1组分ADH激活率为57.64±0.17%,是相同浓度寡肽ADH激活率的1.39倍,浓度为1mg/mL时G15-F1组分ADH激活率为103.77±2.42%,是相同浓度寡肽ADH激活率的1.28倍。因此,选择G15-F1组分进行下一步纯化。
通过反相液相色谱对G15-F1组分进行分离,共获得五个组分,进一步通过测定分离过程中的OD220和OD280,可以得到R-F1组分的OD220/OD280最高,因此选择此过程中R-F1组分进行收集和序列鉴定。通过对组分R-F1进行肽序列鉴定,选择置信区间>95%的肽序列,鉴定出高活性肽段2条,分别为VDYG、VEDD。
对序列为VDYG、VEDD的寡肽进行合成后检测,结果表明序列为VDYG的寡肽,在浓度为1mg/mL时的ADH激活率为125.83±1.35%。而序列为VEDD的寡肽,在浓度为1mg/mL时的ADH激活率为137.62±2.46%,表现出更好的护肝效果。
Claims (3)
1.一种以南极磷虾为原料所制备的高F值寡肽,其特征在于,所述的高F值寡肽的氨基酸序列为VDYG。
2.权利要求1所述的高F值寡肽在制备解酒药品中的应用。
3.一种用于解酒的药品,其特征在于,所述的药品中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的高F值寡肽。
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