CN105368901B - 一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法。其是以仿刺参加工加工液为原料，通过电渗透脱盐、真空干燥，得浓缩液；酶解浓缩液，离心取酶解上清液，将酶解上清液真空浓缩、冷冻干燥后，得固体粉末；将固体粉末复溶于去离子水，乙醇沉淀多糖，取沉淀后的溶解液采用凝胶过滤层析法，收集各吸收峰洗脱液，洗脱液进行抑菌活性测后，将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽。本发明提供的提取抗菌多肽的方法工艺合理、操作可行，按照该方法所提取的抑菌多肽来源可靠，安全性高，后期研究方便。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的制备，尤其是一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法。
背景技术
我们知道，生物活性肽(biologically active peptide)是由20-60个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是药物筛选、制备疫苗和食品添加剂的天然资源宝库，也是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。
现有研究表明，肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高，这也正是活性肽的无穷魅力所在。在生物活性肽领域有一种抗菌多肽，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌多肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。
仿刺参(Apostichopus japonicas，Selenka) 又称刺参，属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲（Holothuroidea），刺参科（Stichopodidae），仿刺参属（Apostichopus）。主要分布于西太平洋北部，包括中国黄渤海域、俄罗斯东部海岸、日本和韩国沿岸等。而新鲜的仿刺参体内具有自溶酶，为利于保存，需要经过沸水煮制进行灭酶处理，然后才可作为原材料保存或进行后续加工。然而仿刺参在煮制过程中，有许多营养成分和功效成分会流失在加工液中。据前期研究发现，煮制100 kg 仿刺参，至少会产生约60 kg的加工液。目前，海参加工液没有充分利用直接排放，不仅会对周边水体造成富营养污染，而且也是对资源的一种极大浪费。伴随着海参加工的规模化、集约化，可收集的海参加工液资源越来越丰富，如何高值化利用该资源，变废为宝，开发成具有极高利用价值的功能食品，延伸海参产业链，日渐成为海参加工企业和从事海参研究的科研人员共同关注的课题。
目前，还没有发现利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺合理、操作可行、产物安全性高的利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）原材料选取与处理
选取仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至4～10℃，管式离心，去除仿刺参加工液中的不溶物，得上清液；
（2）脱盐
将步骤（1）中得到的上清液通过电渗析进行脱盐处理，得脱盐液；
（3）真空浓缩
将步骤（2）中得到的脱盐液进行真空浓缩至原溶液体积的1/10～1/20，得浓缩液；
（4）酶解
将步骤（3）中得到的浓缩液中加入2～5% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解酶，调整溶液pH值至7.5～8.5，温度50～60℃，水解3～5 h；水解后加热至90～100℃，保持10～20min灭酶，得酶解液；将酶解液离心，得酶解上清液；
（5）浓缩、干燥
将步骤（4）中得到的酶解上清液进行真空浓缩至固形物含量在15～30%之间，冷冻干燥，制得固体粉末；
（6）乙醇沉淀
将步骤（5）得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为70～90％，4℃沉淀1～2h，离心去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液；
（7）超滤、冷冻干燥
将步骤（6）中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的组分，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物；
（8）分离纯化
将步骤（7）中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0.2～0.4g/mL溶液，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5～0.8 mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用；
（9）抑菌活性测定、复合
将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽；其中，
所述酶解浓缩液的海产品水解酶为南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解专用酶。
所述的仿刺参加工液是新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮10～30min，捞出参体后所得液体。
所述上清液的电渗析脱盐处理的电压控制为16～30V，流速控制为10～70L/h。
所述脱盐液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82.7～96KPa，温度为50～60℃。
所述酶解上清液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82.7～90.6KPa，温度为45～55℃。
所述的各吸收峰洗脱液的抑菌活性测定是取100μL E.coli 菌液(OD600nm 为0.3～0.5）涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液各取1-3μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+，10 mg/mL）阳性对照组；测定具有抑菌活性的吸收峰洗脱液。
本发明以仿刺参加工加工液为原料，通过电渗透脱盐、真空干燥，得浓缩液；酶解浓缩液，离心取酶解上清液，将酶解上清液真空浓缩、冷冻干燥后，得固体粉末；将固体粉末复溶于去离子水，乙醇沉淀多糖，取沉淀后的溶解液采用凝胶过滤层析法，收集各吸收峰洗脱液，洗脱液进行抑菌活性测后，将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽。本发明采用了酶-膜耦联技术对仿刺参进行了深层次开发，具体体现在：1、以电渗析脱盐的仿刺参加工液为酶解原料；2、采用凝胶色谱法从蛋白酶解产物中分离生物活性肽；经抑菌活性测定，该复合多肽具有较好的体外抑菌活性。同时作为天然的抑菌多肽，相比其他原核或真核表达产物，本发明所提取的抑菌多肽来源可靠，安全性高，后期研究方便。本发明提供的提取抗菌多肽的方法工艺合理、操作可行、产物安全性高，同时减少仿刺参加工液排放后的环境污染，具有广泛的社会和经济效益。
附图说明
下面结合附图和实施例对本做进一步说明。
图1是仿刺参加工废弃液蛋白酶解产物的Sephadex LH-20凝胶色谱分离图(Sephadex LH-20洗脱曲线)；
图2多肽抑菌活性图；
图3是复合多肽组分高效液相分析图谱(检测波长 214 nm)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本做进一步说明。
实施例1
一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其经过下列工艺步骤：
（1）原材料选取与处理
选取新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮20min，捞出参体后所得仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至6℃，管式心机控制转速6000r/min，离心20min，去除仿刺参加工液中的不溶物，得上清液；
（2）脱盐
将步骤（1）中得到的上清液采用电驱动设备渗析脱盐，电压控制为24V，流速控制为30L/h，得脱盐液；
（3）真空浓缩
将步骤（2）中得到的脱盐液在真空度控制为86KPa，温度为55℃条件下，浓缩至原溶液体积的1/15，得浓缩液；
（4）酶解
将步骤（3）中得到的浓缩液中加入4%(以底物蛋白含量计，w/w%)南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解酶，调整溶液pH值至8.0，温度55℃，水解4 h；水解后加热至95℃，保持15min灭酶，得酶解液；将酶解液离心，得酶解上清液；
（5）浓缩、干燥
将步骤（4）中得到的酶解上清液在真空度控制为85KPa，温度为50℃条件下，浓缩至固形物含量在20%之间，冷冻干燥，制得固体粉末；
（6）乙醇沉淀
将步骤（5）得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为80％（v/v），4℃沉淀1.5h，采用管式离心机控制转速4000r/min，离心15 min，去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液；
（7）超滤、冷冻干燥
将步骤（6）中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的组分，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物；
（8）分离纯化
将步骤（7）中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0.3g/mL溶液，采用Sephadex LH-20(2.0 cm×60 cm)凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.6mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液；如图1所示，本实施例收集到5个吸收峰洗脱液；
（9）抑菌活性测定、复合
将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；其中，该抑菌活性测定是取100μL E.coli 菌液(OD600nm 为0.3～0.5）涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8）中得到的5个吸收峰洗脱液各取2μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+，10 mg/mL）阳性对照组；如图2所示，测得吸收峰洗脱液1、吸收峰洗脱液2具有较好的抑菌活性，吸收峰洗脱液3～5 无体外抑菌活性；将测得具有抑菌活性的测得吸收峰洗脱液1和吸收峰洗脱液2合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽。
高效液相色谱分析：将提得到的复合抗菌多肽进行高效液相色谱分析，其中，色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Waters Atlantis，T3，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1。流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为214 nm。
表1 高效液相色谱分离条件
| 时间(min) | A (水，%) | B (乙腈，%) |
| 0 | 98 | 2 |
| 30 | 35 | 65 |
| 33 | 0 | 100 |
| 38 | 0 | 100 |
| 40 | 98 | 2 |
本发明分离得到的仿刺参生物活性复合抗菌多肽，具有较好的体外大肠杆菌抑制活性。本发明所得的生物活性复合抗菌多肽为白色粉末，易溶于水。
用高效液相色谱对复合抗菌多肽组分进行分析，如图3所示。根据出峰时间和峰形分析，冻干后得到活性多肽白色粉末。
实施例2
一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其经过下列工艺步骤：
（1）原材料选取与处理
选取新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮30min，捞出参体后所得仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至4℃，管式心机控制转速4000 r/min离心30 min，去除仿刺参加工液中的不溶物，得上清液；
（2）脱盐
将步骤（1）中得到的上清液采用电驱动设备渗析脱盐，电压控制为30V，流速控制为70L/h，得脱盐液；
（3）真空浓缩
将步骤（2）中得到的脱盐液在真空度控制为96KPa，温度为50℃条件下，浓缩至原溶液体积的1/20，得浓缩液；
（4）酶解
将步骤（3）中得到的浓缩液中加入5% (以底物蛋白含量计，w/w%)南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解酶，调整溶液pH值至7.5，温度50℃，水解3 h；水解后加热至90℃，保持20min灭酶，得酶解液；将酶解液离心，得酶解上清液；
（5）浓缩、干燥
将步骤（4）中得到的酶解上清液在真空度控制为82.7KPa，温度为55℃条件下，浓缩至固形物含量在30%之间，冷冻干燥，制得固体粉末；
（6）乙醇沉淀
将步骤（5）得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为90％（v/v），4℃沉淀1h，采用管式离心机控制转速6000r/min离心15 min，去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液；
（7）超滤、冷冻干燥
将步骤（6）中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的组分，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物；
（8）分离纯化
将步骤（7）中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0.4g/mL溶液，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用；
（9）抑菌活性测定、复合
将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；其中，抑菌活性测定是取100μL E.coli 菌液(OD600nm 为0.3～0.5）涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液各取3μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+，10 mg/mL）阳性对照组；将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽。
本实施例提供的提取抗菌多肽的方法工艺合理、操作可行，按照该方法所提取的抑菌多肽来源可靠，安全性高，后期研究方便。
实施例3
一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其经过下列工艺步骤：
（1）原材料选取与处理
选取新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮10min，捞出参体后所得仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至10℃，管式心机控制转速4000 r/min离心20 min，，去除仿刺参加工液中的不溶物，得上清液；
（2）脱盐
将步骤（1）中得到的上清液采用电驱动设备渗析脱盐，电压控制为16V，流速控制为10L/h，得脱盐液；
（3）真空浓缩
将步骤（2）中得到的脱盐液在真空度控制为82.7KPa，温度为60℃条件下，浓缩至原溶液体积的1/10，得浓缩液；
（4）酶解
将步骤（3）中得到的浓缩液中加入2% (以底物蛋白含量计，w/w%)南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解酶，调整溶液pH值至8.5，温度60℃，水解5h；水解后加热至100℃，保持10min灭酶，得酶解液；将酶解液离心，得酶解上清液；
（5）浓缩、干燥
将步骤（4）中得到的酶解上清液在真空度控制为90.6KPa，温度为45℃条件下，浓缩至固形物含量在15%之间，冷冻干燥，制得固体粉末；
（6）乙醇沉淀
将步骤（5）得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％（v/v），4℃沉淀2h，采用管式离心机控制转速4000r/min离心20min，去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液；
（7）超滤、冷冻干燥
将步骤（6）中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的组分，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物；
（8）分离纯化
将步骤（7）中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0.2g/mL溶液，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.8 mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用；
（9）抑菌活性测定、复合
将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；其中，抑菌活性测定是取100μL E.coli 菌液(OD600nm 为0.3～0.5）涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液各取1μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+，10 mg/mL）阳性对照组；将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽。
本实施例提供的提取抗菌多肽的方法工艺合理、操作可行、产物安全性高，同时减少仿刺参加工液排放后的环境污染，具有广泛的社会和经济效益。
Claims (6)
1.一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）原材料选取与处理
选取仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至4～10℃，管式离心，去除仿刺参加工液中的不溶物，得上清液；
（2）脱盐
将步骤（1）中得到的上清液通过电渗析进行脱盐处理，得脱盐液；
（3）真空浓缩
将步骤（2）中得到的脱盐液进行真空浓缩至原溶液体积的1/10～1/20，得浓缩液；
（4）酶解
将步骤（3）中得到的浓缩液中加入2～5%海产品水解酶，调整溶液pH值至7.5～8.5，温度50～60℃，水解3～5 h，所述的海产品水解酶的加入量以底物蛋白含量计，按w/w%计算；水解后加热至90～100℃，保持10～20min灭酶，得酶解液；将酶解液离心，得酶解上清液；
（5）浓缩、干燥
将步骤（4）中得到的酶解上清液进行真空浓缩至固形物含量在15～30%之间，冷冻干燥，制得固体粉末；
（6）乙醇沉淀
将步骤（5）得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为70～90％，4℃沉淀1～2h，离心去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液；
（7）超滤、冷冻干燥
将步骤（6）中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的组分，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物；
（8）分离纯化
将步骤（7）中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0.2～0.4g/mL溶液，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5～0.8 mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用；
（9）抑菌活性测定、复合
将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肽；其中，
所述酶解浓缩液的海产品水解酶为南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解专用酶。
2.根据权利要求1所述的一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：所述的仿刺参加工液是新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮10～30min，捞出参体后所得液体。
3.根据权利要求1所述的一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：所述上清液的电渗析脱盐处理的电压控制为16～30V，流速控制为10～70L/h。
4.根据权利要求1所述的一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：所述脱盐液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82.7～96KPa，温度为50～60℃。
5.根据权利要求1所述的一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：所述酶解上清液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82.7～90.6KPa，温度为45～55℃。
6.根据权利要求1所述的一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法，其特征在于：所述的各吸收峰洗脱液的抑菌活性测定是取100μL E.coli 菌液涂布LB培养皿，设置3个重复，所述的E.coli 菌液的OD600nm 为0.3～0.5；将步骤（8）中得到的各吸收峰洗脱液各取1-3μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素阳性对照组，所述的卡那霉素阳性对照组中，卡那霉素的浓度为10 mg/mL；测定具有抑菌活性的吸收峰洗脱液。
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