CN1064050C - 生物抗菌肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物抗菌肽及其制备方法，本发明的抗菌肽以林蛙蛙皮为原料，经除脂除肌肉前处理、溶胀、匀浆、抽提、离心、沉淀、透析除盐、浓缩、洗脱、收集活力峰等步骤，最后制得。本抗菌肽具有制备工艺简单、产率高、抗菌谱广、杀菌效力高等优点，可广泛地应用于食品、水果及蔬菜保鲜及护肤品等领域。
Description
本发明涉及一类生物抗菌肽及其制备方法，特别是涉及一类从林蛙蛙皮提取的抗菌肽及其制备方法。
七十年代末期，瑞典科学家Boman首先从惜古比天蚕(HyalopHoracecropia)蛹中经诱导分离纯化了天蚕素(cecropins)，引起了人们的广泛重视，特别是80年代后期以来对抗菌肽的筛选、纯化、结构测定、机理研究、基因克隆和应用研究等方面都取得了显著的进展。1989年Lee等人从猪小肠中发现并纯化了抗菌肽，又有人从牛气管和两栖类中发现并纯化了抗菌肽，说明抗菌肽类化合物是广泛存在的。目前已确定一级结构的抗菌肽有二十几种，可分为有二硫键抗菌肽和不含二硫键的抗菌肽，这些抗菌肽的残基数一般在20-60之间，具有广谱抗细菌、抗病毒和抗癌等重要功能，具有重要的应用价值。
本发明的目的是提供制备工艺简单、原料来源广泛、成本低廉的抗菌肽制备方法，得到一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒和抗肿瘤的生物抗菌肽产品。
本发明所涉及的生物抗菌肽以林蛙蛙皮为原料，其制备工艺路线如下：
1、取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；
2、加少量(1～2ml/g干皮)的缓冲液(0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的酸性或中性缓冲溶液)，于4℃～80℃溶胀1～24小时；(鲜皮材料无需此步操作)
3、鲜皮或溶胀后干皮浸泡并匀浆；
4、加上述缓冲液(10～100ml/g蛙皮)4℃～80℃抽提2～72小时；
5、3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，对沉淀物可重复操作4,5步骤2～3次；
6、合并上清液，加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；
7、4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；
8、对上清液透析24～72小时除盐；
9、透析后上清液超滤浓缩或冻干浓缩；
10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液，进行梯度洗脱，收集活力峰；
11、活力峰超滤浓缩或冻干浓缩；
12、浓缩液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；
13、活力峰超滤浓缩或冻干浓缩；
14、浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；
15、活力峰冻干，于零下20℃保存，得本发明所说的从林蛙蛙皮制备的抗菌肽。
本抗菌肽具有如下性能：
(一)生化特性：
1、热稳定性
林蛙皮抗菌肽80℃ 5小时不失活，100℃ 10min仍有活力；
2、pH值稳定性
在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；
3、非极性体系稳定性
抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质体中也呈稳定α-螺旋构象；
4、等电点
采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽的pI值：
pI值为8.0～10.5的碱性多肽；
5、分子量
采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得本抗菌肽的分子量为4～6KD；
6、氨基酸组成：
用6N HCl于100～120℃下在真空安瓿瓶内水解10～24小时，水解后除去过量盐酸，于HITACHI 835-50氨基酸自动分析仪上测定抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸(Aspartic acid)；苏氨酸(Threonine)；丝氨酸(Serine)；谷氨酸(Glutamic acid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；缬氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；异亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；赖氨酸(Lysine)；组氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。
(二)生理活性
采用两种方法测定抗菌肽的生理活性
1、液体比浊法
将处于对数生长期的菌液预冷后，3000r.p.m离心10分钟得菌体，用pH7.0、0.2M磷酸缓冲液洗去残余培养基后，将菌体悬浮于pH7.0、0.2M磷酸缓冲液中，使OD值为0.3～0.4，按2ml/管加入菌液，并加入适量的待测样，设立阳性、阴性对照，混匀后，37℃摇床培养45分钟，冰浴10分钟。
λ600nm处测OD值
根据μ2=(A0-A)/A计算抑菌活力
μ：活力单位；A0：阴性对照OD值；A：样品管OD值。
2、抑菌圈法
用相同大小滤纸片分别加入不等量抗菌肽，晾干后，置于涂菌液的培养皿内，24小时后观察结果，以抑菌圈大小来测定抑菌活力。
3、实验结果
经测定，林蛙皮抗菌肽可广泛抑制多种革兰氏阳性、阴性细菌及真菌，下表给出了几种细菌的最低抑菌浓度。
最小抑菌浓度(ug/ml)
| 菌种 | 抗菌肽 |
| 铜绿假单孢菌 G-Organism 27853 | 5 |
| 大肠杆菌 G-Escherichia coli ATCC25922 | 10 |
| 粪链球菌 G+S.faccalis ATCC29212 | 10 |
| 枯草杆菌 G+Bacillus sublilis63501 | 10 |
| 普通变形杆菌 G-Proteus vulgaris49027 | 30 |
(三)水果保鲜试验
A组：选取草莓6枚，水洗后室温放置(标记为A1～A6)；
B组：选取草莓4枚，水洗后喷抗菌肽蛙皮初提液(相当于步骤5得到的抗菌肽)，(标记为B1～B4)；
C组：选取草莓4枚，水洗后喷步骤15后得到的抗菌肽，(标记为C1～C4)。
生理活性试验及水果保鲜试验表明：本发明的生物抗菌肽可广泛地用于食品、水果保鲜，护肤品等领域。
本抗菌肽来源于生物，是肽类物质，属天然物质，且水溶性好，用于水果保鲜，抗菌肽会形成一层无色保护膜，隔绝空气的接触并能杀死水果表面的细菌，从而达到水果保鲜保水的目的，对水果的色香味影响不明显。
试验结果如下(单位：小时)：
| 时间 | A组 | B组 | C组 |
| 24 | A1软化，有液体流出 | 正常 | 正常 |
| 33 | A1有霉菌出现，A2开始软化 | 正常 | 正常 |
| 48 | A1、A2大量霉菌且有孢子生成；A3开始腐烂；A4、A5有斑点状软化区 | B1有软化点 | 正常 |
| 57 | A1、A2、A3出水干缩，长出黑曲霉等真菌；A4、A5、A6出现软化区 | B1出现软化区 | C1出现软化区 |
| 72 | A1、A2、A3完全腐烂；A4、A5、A6霉烂 | B1、B2、B3出现霉烂 | C2、C3、C4干缩 |
| 96 | A1～A6完全腐烂 | B4干缩 | C2、C3、C4干缩 |
| 130 | A1～A6完全腐烂 | B4干缩 | C2、C3、C4干缩 |
抗菌肽对于皮肤上存在的各种细菌具有高效杀伤作用，如铜绿假单孢菌，其活性比溶菌酶还高，抗菌肽制剂应用于皮肤消毒，具有对皮肤无损害，杀菌效果好的优点。应用于护肤品中，由于其特有的杀菌性及高稳定性，可以在护肤同时得到杀菌的效果，对于常见的皮肤病如青春痘、粉刺等有一定的疗效。本抗菌肽具有抗细菌，抗真菌，抗病毒和抗肿瘤的功能。
可以看出，本发明的生物抗菌肽具有制备工艺简单，抗菌谱广，抗菌效果好，稳定性高等优点。
下面举例说明本发明生物抗菌肽的制备：
实施例1：
1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉；
2、加2ml0.01mol/L、pH2.5柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，于4℃溶胀24小时；
3、溶胀蛙皮匀浆；
4、加10ml步骤2所述的缓冲液，进行抽提，于4℃抽提72小时；
5、3000r.p.m,30min离心，收集上清；沉淀重抽提两次；
6、上清液加(NH4)2SO4沉淀，至终浓度为20％；
7、4000r.p.m,30min离心，收集上清液；
8、上清液透析24小时；
9、上清液超滤浓缩；
10、浓缩液上CM-纤维素柱，pH4.0、0.01mol/LNaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.0、0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；
11、活力峰冻干浓缩；
12、浓缩液上SephadexG25柱，pH6.0、0.01mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，收集活力峰；
13、活力峰冻干浓缩；
14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C1810μ),10％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；
15、活力峰冻干于零下20℃保存。
产率：2.7mg/g干皮。
实施例2：
取林蛙干皮1g，前处理后加入2ml、0.5mol/L、pH7.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，80℃溶胀1小时，匀浆后加入100ml上面所述的缓冲液进行抽提，于80℃抽提2小时，10000r.p.m、10min离心，收集上清液，上清液加入(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为80％,20000r.p.m、离心10min，收集上清液，透析72小时除盐，上清液冻干浓缩；浓缩液上CM-纤维素柱，以pH5.0、0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.5、0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰，活力峰冻干浓缩；浓缩液上SephadexG50柱，洗脱条件为pH7.0、0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，收集活力峰冻干浓缩；浓缩液上半制备HPLC(SepherisorbC1810μ)，80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；冻干于零下20℃保存。
产率：1.9mg/g干皮。
实施例3：
1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉前处理；
2、加2ml、0.2mol/L、pH5.0NaAc-HAc缓冲液，于40℃溶胀4小时；
3、匀浆；
4、加50ml步骤2所述的缓冲液进行抽提，70℃抽提4小时；
5、6000r.p.m,15min离心，沉淀反复抽提两次；
6、沸水浴10min；
7、18000r.p.m,15min离心，收集上清液；
8、上清液透析36小时除盐；
9、上清液超滤浓缩；
10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0、0.05mol/LNaAc-HAc缓冲液，以pH5.1、0.2～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；
11、活力峰超滤浓缩；
12、浓缩液上SephadexG25柱，pH6.4、0.05mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，收集活力峰；
13、活力峰超滤浓缩；
14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C1810μ),20～80％乙腈(0.01％TFA)梯度洗脱，收集活力峰；
15、冻干于零下20℃保存。
产率：3.5mg/g干皮
Claims (5)
1、从林蛙皮中制备得到的一类生物抗菌肽产品，其具有如下特征：
(1)热稳定性：
本抗菌肽80℃5小时不失活，100℃10min仍有活力；
(2)pH值稳定性：
在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；
(3)非极性体系稳定性：
本抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质
体中也呈稳定α-螺旋构象；
(4)等电点：
采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽pI值：
pI值为8.0～10.5的碱性多肽；
(5)分子量：
采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞
行时间质谱法，测得本抗菌肽的分子量为4～6KD；
(6)氨基酸组成：
本抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸；苏氨酸；丝氨酸；谷氨
酸；甘氨酸；丙氨酸；半胱氨酸；缬氨酸；甲硫氨酸；异亮氨酸；亮
氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸；赖氨酸；组氨酸；精氨酸；脯氨酸。
2、如权利要求1所述的生物抗菌肽在制备食品、水果和蔬菜保鲜剂中的应用。
3、如权利要求1所述的生物抗菌肽在制备护肤品及皮肤外用药中的应用。
4、如权利要求1所述的生物抗菌肽，在制备抗菌药物中的应用。
5、一种制备如权利要求1所述的生物抗菌肽产品的方法，其步骤如下：
(1)取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；
(2)按1～2ml/g的用量在干皮中加入0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的酸性或中性缓冲溶液，于4℃～80℃溶胀1～24小时，鲜皮无需此操作；
(3)鲜皮或溶胀后干皮浸泡并匀浆；
(4)按10～100ml/g的用量在匀浆后蛙皮中加入与步骤2相同的缓冲液，于4℃～80℃抽提2～72小时；
(5)3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，对沉淀物可重复操作4,5步骤2～3次；
(6)合并上清液，加(NH4)2SO4沉淀，(NH4)2SO4终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；
(7)4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；
(8)对上清液透析24～72小时除盐；
(9)透析后上清液超滤浓缩或冻干浓缩；
(10)浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液，进行梯度洗脱，收集活力峰；
(11)活力峰超滤浓缩或冻干浓缩；
(12)浓缩液上SephadexG-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；
(13)活力峰超滤浓缩或冻干浓缩；
(14)浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；
(15)活力峰冻干，于零下20℃保存，获得所述生物抗菌肽。
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