CN105219827A - 鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其包括清洗、酶解、纯化等步骤经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His。本发明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从水生生物提取多肽的方法，尤其涉及一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法。
背景技术
自由基是机体许多生化反应的中间产物，正常情况下，其产生和清除处于平衡状态。但是，当这一平衡被打破时，自由基会使机体处于氧化压力之下，通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子、细胞及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老、疲劳并诱发各种疾病。
根据自由基理论，人体疲劳的产生和体内自由基生成相关，因而具有抗氧化活性的物质存在潜在的抗疲劳活性。
天然的生物活性物质相对于市售的合成剂，具有健康安全的优势，因此，开发海洋生物活性物质具有重要意义。
胶原蛋白主要存在于动物的骨、腱、软骨和皮肤等结缔组织中，是结缔组织中胶原蛋白纤维的蛋白质。胶原蛋白在发展历史过程中，其重要的材料来源一直是陆生动物猪和牛，因为它们具有来源丰富的皮和骨。虽然，人们早已了解了鱼胶原蛋白，但遗憾的是，未能将其作为工业上应用的重要材料，这主要是由于水产捕捞来源不稳定，缺乏规模。近年来，环境等诸多因素引发了陆生动物疾病的产生，如疯牛病等，陆生动物蛋白质的安全性受到质疑；而水产养殖和水产品加工业有了很大的发展，鱼皮、鱼鳞、鱼骨和鱼内脏等鱼类加工下脚料的来源日趋稳定，且具有安全性。因而，对鱼类胶原蛋白的应用与开发已经成为人们关注的热点。然而，胶原蛋白独特的三螺旋结构是非常稳定的，加热时间短和加热温度一般时都难以使其分解，因而不容易被消化吸收。而胶原蛋白水解而得的胶原蛋白肽却能弥补这一缺陷，其分子量小，易于身体吸收。国内外的研究已经表明，水产胶原蛋白肽具有多种功能，包括抗氧化、抗疲劳、抑制血管紧张素转化酶、提高免疫力、抗衰老和抗肿瘤等，并且以其具有的高度生物安全性，可广泛应用于食品、化妆品及医药制备等领域，开发前景非常广阔。
鱼鳔作为渔业加工下脚料，常被废弃或作为简单的加工材料而得不到充分的利用。目前，对于鱼鳔蛋白肽的制备及其活性的相关研究甚少，因此，以养殖大黄鱼鱼鳔为原料制备多肽并研究其抗氧化与抗疲劳活性，为海洋药物和保健食品开发提供理论和实验依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案为：一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其包括以下步骤：
1）清洗步骤：选取鱼鳔用流动水彻底清洗，剪成小块儿（0.5×0.5cm。用0.1MNaOH以1:10(w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馏水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋白；为了脱脂，接着用10%正丁醇以1:10(w/v)的比例浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然后用10倍体积的冷蒸馏水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂，最后用冷蒸馏水冲洗。将预处理好的鱼鳔进行匀浆，备用。
2）酶解步骤：以包含动物、植物及微生物蛋白酶在内的4种商业化蛋白酶（木瓜酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶），分别在其最适条件下酶解匀浆后的鱼鳔，酶解时间均为6h，加酶量均为鱼鳔匀浆质量的2%，料液比为1:3；
3）纯化步骤：上述步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过SephadexG-25层析柱(2.6cm×60cm)进一步分离纯化，样品浓度为25mg/mL，上样量为2mL，用去离子水洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，以0.1%TFA去离子水配制1mg/mL样品溶液，过0.22μm微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化，色谱分析条件为：进样量，20μL；色谱柱类型，C18HypersilBDS(250mm×4.6mm,5μm)；柱温，30℃；流动相为乙腈-水溶液(含有0.1mL/100mL的三氟乙酸)，采用梯度洗脱，在50min洗脱时间内乙腈浓度由0%线性递增至100%；洗脱流速，1.0mL/min；紫外检测波长设定280nm。同样收集各洗脱峰后，浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His（GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH）。本发明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
附图说明
图1是本发明的蛋白肽分子量测定质谱图；
图2是本发明的蛋白肽高效液相色谱C18柱洗脱峰整体洗脱图；
图3是本发明的蛋白肽高效液相色谱C18柱洗脱峰局部洗脱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：养殖大黄鱼鱼鳔为原料制备多肽并研究其抗氧化与抗疲劳活性，为海洋药物和保健食品开发提供理论和实验依据。鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其包括以下步骤：
1）清洗步骤：选取鱼鳔用流动水彻底清洗，剪成小块儿（0.5×0.5cm。用0.1MNaOH以1:10(w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馏水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋白；为了脱脂，接着用10%正丁醇以1:10(w/v)的比例浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然后用10倍体积的冷蒸馏水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂，最后用冷蒸馏水冲洗。将预处理好的鱼鳔进行匀浆，备用。
2）酶解步骤：以包含动物、植物及微生物蛋白酶在内的4种商业化蛋白酶（木瓜酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶），分别在其最适条件下酶解匀浆后的鱼鳔，酶解时间均为6h，加酶量均为鱼鳔匀浆质量的2%，料液比为1:3；
3）纯化步骤：上述步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过SephadexG-25层析柱(2.6cm×60cm)进一步分离纯化，样品浓度为25mg/mL，上样量为2mL，用去离子水洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，以0.1%TFA去离子水配制1mg/mL样品溶液，过0.22μm微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化，色谱分析条件为：进样量，20μL；色谱柱类型，C18HypersilBDS(250mm×4.6mm,5μm)；柱温，30℃；流动相为乙腈-水溶液(含有0.1mL/100mL的三氟乙酸)，采用梯度洗脱，在50min洗脱时间内乙腈浓度由0%线性递增至100%；洗脱流速，1.0mL/min；紫外检测波长设定280nm。同样收集各洗脱峰后，浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His（GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH）。本发明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种鱼鳔胶原蛋白肽的用途，该蛋白肽的氨基酸序列为：
Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His（GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH），其分子量为6719.5718Da，具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抗氧化保健食品或添加剂、也可用于制备抗疲劳保健食品或添加剂。
自由基是机体许多重要的生化反应的中间代谢产物，正常状况下，其产生和清除处于动态平衡。然而，自由基是有效的防御系统，如果机体不能维持这一动态平衡，则会使自己处于氧化压力状态下，自由基通过攻击机体大分子物质和细胞器，对机体造成损伤。然而，肌肉细胞含有复杂的内源性细胞防御机制以清除氧自由基（如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等），对机体由运动引发的氧化损伤和DNA损伤具有一定的保护作用。GSH-Px可加速H2O2和GSH的反应，并将它们转化为水和氧化性谷胱甘肽；SOD可以清除超氧阴离子自由基；CAT可以降解羟自由基。
表1本发明蛋白肽（SBP-Ⅲ-3）对小鼠负重游泳时间的影响
| 组别 | 空白对照组 | 低剂量组 | 中剂量组 | 高剂量组 |
| 游泳时间（min) | 16.1±1.46 | 25.43±1.91* | 28.86±1.01** | 33.41±5.40** |
注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与低剂量组比较aP<0.05，bP<0.01
评价剧烈运动能力的又一重要指标是能量以糖原形式储存的能力。运动所需能量首先来源于糖原的分解，然后来自肌肉和肝脏中的糖原流通。
表2本发明蛋白肽（SBP-Ⅲ-3）对小鼠抗氧化酶活力的影响
注：与对照组相比*P<0.05,**P<0.01；与低剂量组相比a P<0.05,b P<0.01
运动中，当肌糖原减少时，肝糖原含量的降低则成为运动耐力的主要限制因素。因此，增加肝糖原和肌糖原储备有利于增强耐力和运动能力。各剂量组小鼠的肝糖原水平明显高于对照组，并且高剂量组显著高于低剂量组（P<0.05或P<0.01）。剂量组SBP-HG和SBP-MG小鼠的肌糖原水平明显高于对照组（P<0.01）。此结果表明，纯化肽可通过维持体内糖原含量为机体储备能量而达到抗疲劳的效果。
实验通过测定SOD、GSH-Px和CAT的活性以评价纯化肽SBP-Ⅲ-3的抗氧化活性。结果如表2所示与对照组相比，剂量组SBP-HG和SBP-MG小鼠体内的T-SOD活性分别增加了44.2%和15.7%，具有差异显著性，然而低剂量组SBP-LG则增加了4.2%，与对照组并无显著性差异（P<0.05）。另外，剂量组SBP-HG和SBP-MG之间也有显著差异性（P<0.01）。GSH-Px和CAT的活性与T-SOD具有相同趋势。丙二醛（MDA）是一种脂质过氧化物，可以反映机体自由基的含量。本实验还检测了小鼠肝脏和血浆中的MDA含量。结果如表3所示，三个剂量组小鼠的MDA水平均低于对照组水平，且高、中剂量组小鼠的肝脏中MDA含量均显著高于对照组（P<0.05或P<0.01）。以上研究结果表明，该纯化肽可能通过控制自由基的积累以保护机体不受氧化损伤，从而具有抗疲劳的效果。
表3本发明蛋白肽（SBP-Ⅲ-3）对小鼠血浆和肝脏中MDA含量的影响
注：与对照组相比*P<0.05,**P<0.01；与低剂量组SBP-LG相比a P<0.05,b P<0.01
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
Claims (4)
1.一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）清洗步骤：选取鱼鳔用流动水彻底清洗，剪成小块儿（0.5×0.5cm；用0.1MNaOH以1:10(w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馏水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋白；为了脱脂，接着用10%正丁醇以1:10的重量体积比浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然后用10倍体积的冷蒸馏水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂，最后用冷蒸馏水冲洗；将预处理好的鱼鳔进行匀浆，备用；
2）酶解步骤：以蛋白酶酶解匀浆后的鱼鳔，酶解时间均为6h，加酶量均为鱼鳔匀浆质量的2%，料液比为1:3；
3）纯化步骤：上述酶解步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过SephadexG-25层析柱进一步分离纯化，样品浓度为25mg/mL，上样量为2mL，用去离子水洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，以0.1%TFA去离子水配制1mg/mL样品溶液，过0.22μm微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化；收集各洗脱峰后，浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为：
Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His。
2.根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的蛋白酶为木瓜酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或碱性蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的SephadexG-25层析柱的规格为2.6cm×60cm。
4.根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的RP-HPLC的色谱分析条件为：进样量，20μL；色谱柱类型是规格为250mm×4.6mm,5μm的C18HypersilBDS；柱温，30℃；流动相为含有0.1mL/100mL的三氟乙酸的乙腈-水溶液；采用梯度洗脱，在50min洗脱时间内乙腈浓度由0%线性递增至100%；洗脱流速，1.0mL/min；紫外检测波长设定280nm。
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