CN107586319A - 一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽及其应用，具体为：以鮸鱼鱼鳔为原料，通过脱脂、碱性蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Phe‑Pro‑Tyr‑Leu‑Arg‑His(FPYLRH)，ESI‑MS测定分子量为831.98Da。有益效果为：本发明制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基和羟基自由基具有良好的清除作用；同时，该抗氧化肽对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞‑HUVEC细胞氧化损伤具有保护作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗氧化肽，尤其是涉及一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽及其应用。
背景技术
抗氧化剂是能帮助捕获并中和自由基从而祛除自由基对人体损害的一类物质，其能防止或延缓食品氧化，提高食品的稳定性和延长贮存期的食品添加剂。目前，化学合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、叔丁基对苯二酚等广泛地应用到食品工业中。但是，化学合成抗氧化剂不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官，部分国家和地区已经明确限量或禁止使用。一些天然抗氧化剂也受到了原料、价格以及其他一些因素的制约，因此开发高效、低毒的天然抗氧化剂已经成为人们研究的热点。
鮸鱼（Miichthys miiuy），又称米鱼、鳘鱼，属鲈形目石首鱼科。鮸鱼鱼鳔脂肪含量低，主要成分是生物大分子胶原蛋白质等活性物资，易于被人体消化吸收和利用，从而改善组织营养状况和加速新陈代谢，影响某些特定组织生理机能，促进生长发育增强抗病能力，起到延缓衰老和抵御癌症的效能。现在市场上鱼螺的应用主要是烹饪和干制品加工为主，干制生产的鱼螺附加值低，并且有明显的地域化特点，主要集中在沿海地区，而内地少有食用，从一定程度上制约了鱼鳔的销售，经济价值有限，因此研究出一种可行的鱼鳔深加工技术成为当务之急。而以鮸鱼鱼鳔为原料，利用酶解技术制备鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而以鮸鱼鱼鳔酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用更是未见报道。
现有技术如授权公告号为CN 102363800 B的中国发明专利，公开了一种超声波酶解鱼鳔制备抗氧化寡肽的方法，先将鱼鳔粉碎为鱼鳔粉末；再向鱼鳔粉末中加入pH值为6.0的磷酸盐缓冲液和胰蛋白酶，搅拌均匀，得到鱼鳔溶液；然后将鱼鳔溶液在水浴中酶解，再将鱼鳔溶液进行超声处理进行酶解，超声处理后继续在恒温水浴中酶解；酶解结束后，灭酶、冷却、过滤得到上清液；将上清液用10000Da超滤膜超滤，超滤后的溶液经冷冻干燥，得到鱼鳔抗氧化寡肽。上述制备的抗氧化寡肽对人体的自由基有很好的清除作用，能起到防止衰老，炎症，以及动脉硬化而引发的心脑血管疾病，也可以作为一种营养添加剂应用于食品中。但该制备方法未经脱脂步骤，增加抗氧化肽的提取难度，此外该得到的抗氧化肽的纯度较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够清除自由基和保护细胞免受氧化损伤作用的鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，该抗氧化肽可作为抗氧化药品、保健产品和食品添加剂。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，上述抗氧化肽氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)，分子量831.98 Da。
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，具体包括下述步骤：
鮸鱼鱼鳔预处理：鮸鱼鱼鳔经清洗、匀浆至糊状后，按固液比1g:10～15mL加入0.08-0.12M的NaOH溶液，于0-5℃下浸泡12～15h，过滤，用蒸馏水洗至中性，按固液比1g:5～8mL加入10%的异丙醇溶液，脱脂36～48h，过滤，弃滤液，固体物用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔，该步骤能彻底除去鱼鳔的脂肪组织脱脂，降低鱼鳔蛋白的提取难度，无试剂残留，还能除去非胶原蛋白的杂蛋白，提高所得抗氧化肽的纯度，且该处理方法对于鱼鳔中的其他成分及功效无任何影响；
鮸鱼鱼鳔的酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:5～8mL加入蒸馏水，调节pH值至9～10，加入鱼鳔重量2～3%碱性蛋白酶，在50～60℃下酶解3～4h，然后在90～100℃灭酶10-15min，冷却至室温，在10000-15000rmp下离心15-25min，收集上清液，即得鮸鱼鱼鳔酶解液，上述碱性蛋白酶的酶活力≥2.0×105U/g，能有效的从鱼鳔中提取出高活性的活性多肽，提高蛋白质的转化率，使得活性多肽的得率高，反应条件温和，成本较低，安全性高，不仅不会破坏活性多肽的成分和活性，而且能改善活性多肽的品质；
鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，即得鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，该步骤可制得纯度较高的鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，该抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力，同时具有良好的抗氧化活性，易于消化吸收，安全无毒副作用。
作为优选，鮸鱼为Miichthys miiuy。
作为优选，离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
离子交换树脂层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成浓度为45~55mg/mL的溶液，4℃、12000r/min离心20min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集自由基清除活性最强组分，即为离子交换层析酶解物，该方法具有重复性好、操作简单、洗脱范围广的优势，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产；
凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45~55 mg/mL的溶液，在4℃、12000r/min下离心20min，去除不溶性杂质，上清液经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物，该方法根据在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便、不影响目标组分化学性质；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His(FPYLRH)，该方法灵敏度高、分离效果好，能快速分离纯化目标产物。
再优选，RP-HPLC纯化条件为：进样量为10~15μL；色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为0.8~1.0mL/min；紫外检测波长280 nm。
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力；利用H2O2诱导人脐静脉内皮细胞-HUVEC氧化损伤模型，研究鮸鱼鱼鳔与鱼肉多肽对氧化损伤细胞的保护作用，结果表明：在100μmol/L浓度处理24h，FPYLRH较模型组表现出对HUVEC细胞更强的保护能力；FPYLRH能显著提高细胞内SOD和GSH-Px的活力，并显著降低胞内NO和MDA的含量；FPYLRH对双氧水诱导HUVEC细胞氧化损伤起到保护作用。因此，FPYLRH具有良好的抗氧化活性，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）本发明鮸鱼鱼鳔抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力；
2）该抗氧化肽具有良好的抗氧化活性，对HUVEC细胞更强的保护能力，能显著提高细胞内SOD和GSH-Px的活力，并显著降低胞内NO和MDA的含量，且该抗氧化肽具有易于消化吸收和安全无毒副作用的特点，可作为药品、保健食品和食品的添加剂；
3）本发明鱼鳔抗氧化肽通过酶解方法制得，酶解过程易控制，能使抗氧化肽最大限度的释放出来，提高抗氧化肽的得率，且通过经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到的抗氧化肽纯度高；
4）本发明采用鮸鱼鱼鳔为原料生产抗氧化肽，弥补了行业空白，为鱼鳔的深加工提供了一种切实可行的工艺技术。
附图说明
图1为本发明实施例2的DEAE-52阴离子交换树脂层析图；
图2为本发明实施例2的葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析图；
图3为本发明实施例2葡聚糖凝胶Sephadex G-25制备酶解物的RP-HPLC分析；
图4为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)的质谱图；
图5为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对DPPH自由基的清除作用；
图6为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对羟基自由基的清除作用；
图7为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对超氧阴离子自由基的清除作用；
图8为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对HUVEC细胞的增殖活性的影响；
图9为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH) 对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；
图10为本发明不同浓度抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用；
图11为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞的保护作用的Hoechst 33342染色实验结果；
图12为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞内GSH-Px含量的影响；
图13为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞内SOD含量的影响；
图14为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞内MDA含量的影响；
图15为本发明抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤HUVEC细胞内NO含量的影响。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其制备方法具体包括下述步骤：
1）鮸鱼鱼鳔预处理：鮸鱼（Miichthys miiuy）鱼鳔经清洗、匀浆至糊状后，按固液比1g:15mL加入0.08M的NaOH溶液，于5℃下浸泡12h，过滤，用蒸馏水洗至中性，按固液比1g:8mL加入10%的异丙醇溶液，脱脂36h，过滤，弃滤液，固体物用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔；
2）鮸鱼鱼鳔的酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:8mL加入蒸馏水，调节pH值至9，加入鱼鳔重量2%碱性蛋白酶，在60℃下酶解4h，然后在90℃灭酶15min，冷却至室温，在10000rmp下离心25min，收集上清液，即得鮸鱼鱼鳔酶解液，上述碱性蛋白酶的酶活力≥2.0×105U/g；
3）鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，即得鮸鱼鱼鳔抗氧化肽。
上述离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
离子交换树脂层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成浓度为55mg/mL的溶液，4℃、12000r/min离心20min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集自由基清除活性最强组分，即为离子交换层析酶解物；
凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为55mg/mL的溶液，在4℃、12000r/min下离心20min，去除不溶性杂质，上清液经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物，该方法根据在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便、不影响目标组分化学性质；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His(FPYLRH)，该方法灵敏度高、分离效果好，能快速分离纯化目标产物。
上述RP-HPLC纯化条件为：进样量为10μL；色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
实施例2：
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其制备方法具体包括下述步骤：
1）鮸鱼鱼鳔预处理：鮸鱼（Miichthys miiuy）鱼鳔经过清洗、匀浆至糊状后，按照1 g:10mL加入0.1M NaOH于4℃浸泡15h，过滤，用蒸馏水洗至中性，按照1g:5mL加入10%的异丙醇溶液，脱脂48h，过滤，弃上清液，用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔；
2）鮸鱼鱼鳔的酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:5mL加入蒸馏水。调节pH值至9～10，加入鱼鳔重量2.5%碱性蛋白酶（酶活力≥2.0×105U/g），55℃酶解3.5h，于95℃、10min灭酶，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，即鮸鱼鱼鳔酶解液；
3）鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构。
上述离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
离子交换树脂层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，4℃、12000 r/min离心20 min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集自由基清除活性最强组分（DMS-Ⅲ），即为离子交换层析酶解物，DEAE-52阴离子交换树脂层析图如图1所示；
凝胶柱层析：将DMS-Ⅲ溶于双蒸水配成浓度为50 mg/mL的溶液，4 ℃、12000 r/min离心20 min，去除不溶性杂质，上清液经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物（GS-III），葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析图如图2所示；
RP-HPLC纯化：将GS-III用双蒸水配成100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC（进样量10μL；色谱柱Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：40%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280nm，进行纯化，根据对自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽，酶解物的RP-HPLC图如图3所示。
结构检测：收集自由基清除活性最高的1个活性肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)，ESI-MS测定分子量为831.98Da，抗氧化肽的质谱图如图4所示。
将制得的鮸鱼鱼鳔抗氧化肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)进行自由基清除实验，抗氧化肽对DPPH自由基的清除作用如图5所示，抗氧化肽对羟基自由基的清除作用如图6所示，抗氧化肽对超氧阴离子自由基的清除作用如图7所示，结果表明：Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用。
利用H2O2诱导人脐静脉内皮细胞-HUVEC氧化损伤模型，研究Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)对氧化损伤细胞的保护作用，如图8-15所示，结果表明：在100μmol/L浓度处理24h，FPYLRH较模型组表现出对HUVEC细胞更强的保护能力；FPYLRH能显著提高细胞内SOD和GSH-Px的活力，并显著降低胞内NO和MDA的含量；FPYLRH对双氧水诱导HUVEC细胞氧化损伤起到保护作用。
实施例3：
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其制备方法具体包括下述步骤：
1）鮸鱼鱼鳔预处理：鮸鱼（Miichthys miiuy）鱼鳔经过清洗、匀浆至糊状后，按照1 g:10mL加入0.1M NaOH于4℃浸泡15h，过滤，用蒸馏水洗至中性，按照1g:5mL加入10%的异丙醇溶液，再加入鱼鳔重量0.022%和0.004%的十二烷基苯磺酸钠和香芹酚，脱脂48h，过滤，弃滤液，固体物用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔，上述十二烷基苯磺酸钠和香芹酚可与异丙醇发挥相互协同的作用，破坏脂肪细胞膜，使得细胞内的脂肪渗出，同时也增加异丙醇的溶解能力，可促进不同种类的脂肪酸三甘油酯快速溶解于溶液中，进而除去，加快鱼鳔的脱脂速率和效果，该步骤能彻底除去鱼鳔的脂肪组织脱脂，降低鱼鳔蛋白的提取难度，无试剂残留，还能除去非胶原蛋白的杂蛋白，提高所得抗氧化肽的纯度，且该处理方法对斗鱼鳔中的其他成分及功效无任何影响；
2）鮸鱼鱼鳔的酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:5mL加入蒸馏水。调节pH值至9～10，加入鱼鳔重量2.5%碱性蛋白酶（酶活力≥2.0×105U/g），55℃酶解3.5h，于95℃、10min灭酶，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，即鮸鱼鱼鳔酶解液；
3）鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得到鮸鱼鱼鳔抗氧化肽。
一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，该抗氧化肽可作为药品、保健食品和食品的添加剂。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 鮸鱼(Miichthysmiiuy)
<400> 2
Phe Pro Tyr Leu Arg His
1 5
Claims (9)
1.一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其特征在于：所述抗氧化肽的氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)。
2.根据权利要求1所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其特征在于：所述抗氧化肽的ESI-MS测定分子量为831.98Da。
3.根据权利要求1所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽，其特征在于：所述抗氧化肽的制备方法包括下述步骤：
1）鮸鱼鱼鳔预处理：鮸鱼鱼鳔经清洗、匀浆至糊状后，按固液比1g:10～15mL加入0.08-0.12M的NaOH溶液，于0～5℃下浸泡12～15h，过滤，用蒸馏水洗至中性，按固液比1g:5～8mL加入10%的异丙醇溶液，脱脂36～48h，过滤，弃滤液，固体物用蒸馏水将异丙醇冲洗干净，干燥，得脱脂鮸鱼鱼鳔；
2）鮸鱼鱼鳔的酶解：取脱脂鮸鱼鱼鳔，按料液比1g:5～8mL加入蒸馏水，调节pH值至9～10，加入鱼鳔重量2～3%碱性蛋白酶，在50～60℃下酶解3～4h，然后在90～100℃灭酶10～15min，冷却至室温，在10000～15000rmp下离心15～25min，收集上清液，即得鮸鱼鱼鳔酶解液；
3）鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备：将鮸鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，即得鮸鱼鱼鳔抗氧化肽。
4.根据权利要求3所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中碱性蛋白酶的酶活力≥2.0×105U/g。
5.根据权利要求3所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中离子交换树脂层析为：将上述超滤酶解液用双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，4℃、12000r/min离心20min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集自由基清除活性最强组分，即为离子交换层析酶解物。
6.根据权利要求3所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中凝胶柱层析为：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55 mg/mL的溶液，在4℃、12000r/min下离心20min，去除不溶性杂质，上清液经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用超纯水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物。
7.根据权利要求3所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中RP-HPLC纯化为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Phe-Pro-Tyr-Leu-Arg-His (FPYLRH)。
8.根据权利要求3所述的一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中RP-HPLC纯化条件为：进样量为10～15μL；色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为0.8～1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
9.一种鮸鱼鱼鳔抗氧化肽的应用，其特征在于：所述鱼鳔抗氧化肽应用于制备抗氧化药物、保健品和食品的添加剂。
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