CN110904180B - 一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1)取活沙蚕，吐沙，制浆，得浆液；2)在浆液中添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为600‑1000U/g，于40‑45℃下，酶解1‑4h，并于90‑100℃下，灭酶4‑6min，冷却，得酶解液；3)将酶解液粗滤、细滤、超滤，浓缩，脱盐，纯化，干燥，得沙蚕抗氧化肽。本发明的制备方法简单，操作方便，绿色环保，易于实现产业化；所得沙蚕抗氧化肽的纯度高，活性强，抗氧化作用好，对DPPH自由基、超氧自由基和羟基自由基均有清除效果，同时，对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用，可广泛用于营养食品、功能食品和饲料等的生产制作中。

Description

一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多肽制备的技术领域，特别是指一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用。
背景技术
沙蚕在分类学上属于环节动物门、多毛纲、游走目、沙蚕科，俗称海虫、海蛆、海蜈蚣、海蚂蝗，栖息泥沙中。沙蚕是构成海洋生物食物链的主要成分之一，也是海洋生态修复与环境情况指示的重要物种。我国的沙蚕种类有约80多种，多产于黄海和渤海沿岸。沙蚕是重要的经济多毛类，因其出口经济价值高，出口量大，海南、福建、浙江、广东、山东沿海已有规模化人工养殖，是当地出口创汇的重要品种之一。
沙蚕含丰富的蛋白质，是目前公认的鱼、虾、蟹类等的最佳鲜活饵料，在游钓业内也被称为“万能钓饵”。沙蚕营养丰富，在中国沿海地区，已被人们当作美食，鲜沙蚕放入油锅中爆炒，肉脆味丰；沙蚕晒干后，又称“龙肠干”，色金黄而透明，比鲜品更为醇美清甜，为高级宴席的珍贵名菜。沙蚕具有药用价值，在日本民间，某些沙蚕用于食疗兼优的药膳，被称为海中的“冬虫夏草”。在我国古代就作为药材用于身体调养和疾病治疗。根据我国医学巨著《本草纲目》记载，沙蚕具有“补脾胃，生血利湿，行小便”等功效；据《本草纲目拾遗》中记录，疣吻沙蚕味甘，性温；归脾、胃经；具有补脾胃，益气血，利水消肿之功效。
目前，国内外学者也开展了沙蚕的生物学特征、生活史、规模养殖等相关研究，对于其生物活性的研究主要集中在沙蚕溶栓蛋白酶、金属蛋白酶、纤溶酶和激酶等具有溶栓活性的研究，但上述活性物质难以规模化生产制备，多数还停留在实验室研究水平上。
发明内容
本发明的目的是提出一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用，本发明的沙蚕抗氧化肽制备方法简单，操作方便，绿色环保，易于实现产业化；所得沙蚕抗氧化肽的纯度高，活性强，抗氧化作用好。
本发明的一种沙蚕抗氧化肽的制备方法，其技术方案是这样实现的：包括以下步骤：1)取活沙蚕，吐沙，制浆，得浆液；2)在浆液中添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量为600-1000U/g，于40-45℃下，酶解1-4h，并于90-100℃下，灭酶4-6min，冷却，得酶解液；3)将步骤2)所得的酶解液粗滤、细滤、超滤，浓缩，脱盐，纯化，干燥，得沙蚕抗氧化肽。
酶解技术是发掘天然产物蛋白质资源的一项重要工艺手段，通过选择性的可控酶解，可以使许多生物活性功能被掩盖或被多种共存杂质干扰的多肽类产物得以释放，表现出各种生理活性。沙蚕已经被广泛的规模化养殖，产量高，成本低，取材方便。本发明以沙蚕为原料，经过吐沙、制浆、酶解、灭酶、过滤、浓缩、层析、干燥等处理而得到，这种制备方法简单，操作方便，绿色环保，得率高，易于实现产业化；所得的沙蚕抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用好，对DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基均有清除效果，同时，对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用，可广泛用于营养食品、功能食品、饲料和抗氧化药品等的生产制作中。本发明中胃蛋白酶的添加量是将胃蛋白酶添加到浆液中制成料液之后，测定每g料液中胃蛋白酶所具有的酶活力，单位U/g。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，超滤是在两个串联连接的卷式超滤膜中完成的，第一个卷式超滤膜为聚醚砜膜，能够截留分子量大于20000Da的大分子，膜面积为0.20-0.30m2，进口压力为15-30bar，出口压力为10-20bar，平均膜通量为42-55LMH；第二个卷式超滤膜为复合膜，能够截留分子量大于2000Da的小分子，膜的面积为0.20-0.30m2，进口压力为15-30bar，出口压力为10-20bar，平均膜通量为20-30LMH。本发明采用两步法利用卷式超滤膜进行超滤，两次超滤均需注意调整进出口的压力，进口压力通常大于出口压力，防止压力过大引起滤液中大分子物质含量过多；这种超滤方法效率高，精度控制准确，分子量范围控制容易，且大大减少了膜的污染，可以得到分子量范围适宜的沙蚕抗氧化肽，本发明所得的沙蚕抗氧化肽的分子量小于2000Da。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，纯化的步骤为：a)采用SephadexG-25凝胶柱进行柱层析，收集分子量范围为1000-2000Da的活性物质；b)采用Sephacryl S-100凝胶柱进行柱层析，收集分子量范围为1000-1500Da的活性物质；c)采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱为SEC60柱，收集分子量范围为1100-1200Da的活性物质；优选地，所述步骤a)中，Sephadex G-25凝胶柱的规格为1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积5％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，2mL/管，检测波长220nm；所述步骤b)中，Sephacryl S-100凝胶柱的规格是1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积3％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，1mL/管，检测波长220nm；所述步骤c)中，高效液相色谱的纯化条件为：色谱柱BioBasic SEC60柱，色谱柱规格为7.8×300mm，流动相：含0.1％FA的0-50％乙腈梯度洗脱，洗脱速度1mL/min，上样量100uL，洗脱时间50min，紫外检测器，检测波长220nm。本发明所得的沙蚕抗氧化粗肽依次经过Sephadex G-25、Sephacryl S-100凝胶柱和高效液相色谱柱SEC60柱纯化，冻干，得抗氧化肽；这种逐级柱层析纯化分离法，分离效果好，纯度高，对抗氧化肽活性无影响。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，细滤为采用陶瓷膜过滤，陶瓷膜的膜芯精度为180-220nm，膜面积0.4-0.8m2，进料压力为3-4bar，出膜压力为2-3bar，平均膜通量为85-92LMH。本发明采用陶瓷膜进行细滤，可将粗滤液中的沙蚕细胞碎片和大分子物质除去，减轻后续卷式膜超滤的压力，延长卷式膜芯的使用寿命；并且，陶瓷膜耐酸碱，膜再生性能好，孔径分布窄，过滤精度高，抗污染能力高，清洗简单，分离效率高，可以有效去除大颗粒杂质以及大分子物质。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，粗滤是采用100-200目的滤袋过滤。本发明采用滤袋进行粗滤，可将酶解液中的杂质和絮状物等快速除去，减轻后续陶瓷膜细滤的压力和污染，且滤袋操作方便，成本低，产业化容易。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，脱盐是采用恒定电压方法进行电渗析脱盐，电压为11-12V，平均电流为0.28-0.80A，8-12对阴阳膜交换堆叠，流量为0.6-2L/min；优选地，所述步骤3)中，脱盐之前料液的电导率为39-46ms/cm，脱盐之后料液的电导率为3.25-3.30ms/cm。本发明采用恒定电压模式进行电渗析脱盐，电极通常为双涂层钛涂铱钽，这种脱盐方法脱盐率高，不改变分子极性，使用效果好。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，浓缩采用真空加热浓缩，加热温度不超过80℃，真空度为0.1-1.0MPa。本发明采用真空加热浓缩，控制加热温度和真空度，浓缩效率高，不会破坏浓缩物中的有效成分，有利于保持沙蚕抗氧化肽的活性。
作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，浆液的pH值为2-3。本发明的沙蚕在制浆之后，对其pH值进行调整，加入酶后，能使酶的催化活性达到最高，催化效率达到最佳。
作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，活沙蚕是在海水中进行吐沙，吐沙时间为24-48h；优选地，所述步骤1)中，制浆是在吐沙后的沙蚕中添加沙蚕质量6-8倍的蒸馏水打浆而成，打浆时的打浆机转速为800-1200r/min，时间为2-6min。本发明在海水中完成沙蚕的吐沙，去除沙蚕体内沙质，控制制浆浓度使酶与底物比率达到最佳，控制制浆速度和时间，使底物颗粒大小均一，达到酶解产物分子量可控的目的。
本发明的一种沙蚕抗氧化肽，其技术方案是这样实现的：所述沙蚕抗氧化肽是根据上面任意一项所述的沙蚕抗氧化肽的制备方法制备而成的；优选地，所述沙蚕抗氧化肽的分子量范围为1100-1200Da。本发明所得的沙蚕抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用好，对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、超氧自由基(·O2 -)和羟基自由基(-OH)均有清除效果，同时，对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)细胞氧化损伤有明显的保护作用。
本发明的一种沙蚕抗氧化肽的应用，其技术方案是这样实现的：所述沙蚕抗氧化肽用于制备食品、饲料或抗氧化药品。本发明所得的沙蚕抗氧化肽性能优异，可广泛用于生产营养食品、功能食品、饲料和抗氧化药品等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以沙蚕为原料，经过吐沙、制浆、酶解、灭酶、过滤和纯化等处理而得到，这种制备方法简单，操作方便，绿色环保，得率高，易于实现产业化；所得的沙蚕抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用好，对DPPH自由基、超氧自由基和羟基自由基均具有清除效果，同时，对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用，可广泛用于生产营养食品、功能食品、饲料和抗氧化药品等。
附图说明
图1为本发明实施例一所得的沙蚕抗氧化肽的TOF-LC-MS/MS质谱图；
图2为本发明实施例二所得的沙蚕抗氧化肽的TOF-LC-MS/MS质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明的一种沙蚕抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
1)沙蚕，体质量为300-400尾/Kg，采集后清洗，海水中室温吐沙24h；取1Kg沙蚕，按质量比1:8添加蒸馏水，于800r/min的转速下，打浆2min，调整pH值为2.0，得沙蚕浆液；
2)在步骤1)所得的沙蚕浆液中加入胃蛋白酶，酶加入量为600U/g料液，于40℃下，酶解4h，并于90℃下，灭酶6min，冷却，得酶解液；
3)将步骤2)所得的酶解液采用200目的滤袋粗滤，得粗滤液7.80L；
4)将步骤3)所得的粗滤液采用陶瓷膜澄清，陶瓷膜参数为膜芯精度220nm，膜面积为0.4m2，进料压力为3bar，出膜压力为2bar，平均膜通量为92LMH，平均膜通量是每平方米每小时透过是料液量，得澄清料液7.50L；
5)将步骤4)所得的澄清料液采用二步法过卷式超滤膜，第一步经过截留分子量为20000Da的聚醚砜膜，膜面积为0.20m2，进口压力为15bar，出口压力为10bar，平均膜通量为55LMH，收集滤过液7L；第二步经过截留分子量为2000Da的复合膜，膜面积为0.20m2，进口压力为15bar，出口压力为10bar，平均膜通量为30LMH，收集滤液6.8L；
6)将步骤5)所得的滤液采用真空加热浓缩，加热温度80℃，真空度为0.1MPa，浓缩后料液体积为1.6L；
7)将步骤6)所得的浓缩液电渗析脱盐，采用恒定电压模式，电压为11V，平均电流为0.80A，12对阴阳膜交替堆叠，流量控制为0.6L/min，电极为双涂层钛涂铱钽，接收液体积为1.6L，料液体积为1.6L，料液起始电导率为39.24ms/cm，脱盐后电导率为3.30ms/cm，脱盐率91.59％；
8)将步骤7)所得的脱盐之后的料液进行真空干燥，得沙蚕抗氧化粗肽；
9)将步骤8)所得的抗氧化粗肽，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephadex G-25凝胶柱进行柱层析，Sephadex G-25凝胶柱的规格是1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积5％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，2mL/管，检测波长220nm；收集第31-45管，冷冻干燥；
10)将步骤9)所得组分，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephacryl S-100凝胶柱进行柱层析，Sephacryl S-100凝胶柱的规格是1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积3％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，1mL/管，检测波长220nm；收集55-85管，冷冻干燥；
11)将步骤10)所得的组份，添加双蒸水，溶解至100mg/mL；采用高效液相色谱进行纯化，纯化条件如下：色谱柱BioBasic SEC60柱(7.8×300mm)，流动相：0-50％乙腈(含0.1％FA)梯度洗脱，洗脱速度1mL/min，上样量100uL，洗脱时间50min，紫外检测器，检测波长220nm，收集馏分液，冷冻干燥，得沙蚕抗氧化肽纯品。
将本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品置于TOF-LC-MS/MS指纹图谱上鉴定肽指纹图谱，其中，液相色谱(LC)为Shimazu的Prominence nano 2D，质谱仪器为BrukerDaltonics的Micro TOF-QII；由附图1可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽是序列为Gly-Leu-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Asp-Lys(缩写为GLSAPVPDDK)，分子量为1160Da，等电点为5.81的抗氧化肽。
将本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品溶解于蒸馏水中，配制成不同浓度的溶液，浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL，采用以下方法测定其对DPPH自由基、-OH和·O2 -的清除率，阳性对照为0.16mg/mL的乙酰半胱氨酸(Nac)，测试结果如表1所示。
1、DPPH自由基清除率的测定
取0.2mmol/L DPPH甲醇溶液2mL，甲醇定容至3mL，测量517nm处吸光值作为A0；取DPPH甲醇溶液2mL，加入不同浓度酶解液100μL，甲醇定量至3mL，充分混匀，置于暗处反应30min后，测量517nm处吸光值作为A，甲醇调仪器零点，反应后体系若有少量沉淀会影响吸光值测定，可以过0.45μm滤膜去除；DPPH清除率计算公式如下：
DPPH清除率＝(A0-A)/A0×100％；
2、超氧自由基(·O2 -)清除率的测定
采用联苯三酚法测定超氧自由基清除率，取2950uL pH值为8.2的0.1mol/LTris-HCl缓冲液，加入50μl 25mmol/L联苯三酚溶液，迅速混合，测量325nm吸光值，30s时读数为A1，每隔30s测量一次，至读数接近稳定时为A2，计算ΔA0＝A1-A2；取100μL不同浓度酶解液，加入2950μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL联苯三酚溶液，迅速混合，测量325nm吸光值，30s时读数为A样1，每隔30s测量一次，至读数接近稳定时为A样2，计算ΔA样＝A样1-A样2，测定前采用水调零；
超氧阴离子自由基清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0×100％；
3、羟基自由基(-OH)清除率的测定
采用水杨酸法测定羟基自由基清除率，取1mL 1.8mmol/L FeSO4溶液(取FeSO4.7H2O 0.05g溶于双蒸水，溶解后加入少量H2SO4与还原铁粉，定容至100mL)、1mL9mmol/L乙醇-水杨酸溶液、250μL双蒸水和1mL 8.8mmol/LH2O2混合作为A0；取1mL FeSO4溶液、1mL乙醇-水杨酸溶液与100μL不同浓度的样品溶液混合，用双蒸水定量到2250μL，最后加入1mL H2O2混合均匀作为Ax；取1mL FeSO4溶液、1mL乙醇-水杨酸溶液与100μL不同浓度酶解液混合，用双蒸水定量到3250μL，混合均匀作为Ax0，均置于37℃水浴10min，于505nm下测定吸光值，测定前用水调零，全部溶液现配现用；
羟基自由基清除如下公式计算：
羟基自由基清除率＝[A0-(Ax-Ax0)]/ΔA0×100％。
由表1可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对DPPH自由基的清除率为IC50＝0.29mg/mL，并且，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对-OH和·O2 -的清除率IC50分别为0.279mg/mL和0.247mg/mL。
表1抗氧化肽对三种自由基的清除率
样品浓度(mg/mL) DPPH自由基清除率(％) 羟基自由基清除率(％) 超氧自由基清除率(％)
0.25 48.12±0.40 48.36±0.39 55.26±0.39
0.50 55.92±0.34 56.55±0.58 68.01±0.47
1.00 65.23±0.56 66.89±0.31 75.68±0.21
1.50 68.04±0.15 70.06±0.29 85.26±0.62
2.00 79.56±0.97 82.69±0.25 90.38±0.88
阳性对照 86.17±0.74 89.00±0.18 95.00±0.36
将本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品溶解于蒸馏水中，分配制成不同浓度的溶液，浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL，采用以下方法测定其HUVEC细胞氧化损伤性能，其中，造模组为浓度是400μM的氧化剂H2O2，阳性对照为浓度是1.5mM的乙酰半胱氨酸(Nac)，实验测试结果如表2所示。
4、HUVEC细胞损伤抗氧化测定方法
4.1细胞复苏：从液氮罐中取出HUVEC细胞后迅速置于37℃水浴中融化，期间不断摇晃；待细胞完全溶化后，转移至超净台中，用移液器转移至15ml离心管中并添加适量培养基(降低DMSO浓度，减少细胞伤害)，1000rpm，离心3min，去除上清；用培养液重新悬浮细胞转移至培养瓶中37℃，5％CO2条件下培养；
4.2细胞传代：显微镜下观察，待细胞生长至汇合率达到90％左右时，将HUVEC细胞传至新的培养瓶中；
4.3种板：待细胞生长至汇合率达到80-90％左右时常规稀释，按1×104/孔(细胞悬液体积90μl/孔)的数量接种于96细胞培养板，培养24h；
4.4加药培养：按照实验所设定的待测化合物的终浓度，NAC终浓度1.5mM加入96孔板中，每孔细胞加10μl药物，每个浓度设5个复孔以及对照孔、模型组和阳性药组，继续培养24h；
4.5造模：各组加入氧化剂H2O2(400μm)进行造模，继续培养24h；
4.6MTT检测：每孔细胞加入20μl MTT溶液(避光，剧毒)，继续37℃培养4h后，弃上清，加入分子生物级别DMSO溶液，每孔150μl，震荡摇匀使结晶全部溶解，10min，570nm和630nm处用酶标仪测定吸光度，避光处理；注：阴性对照孔也需加入MTT和DMSO溶液来进行测定；
计算公式：细胞抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100。
表2抗氧化肽对HUVEC细胞氧化损伤保护实验结果
样品浓度 HUVEC细胞生长抑制率(％)
造模组400μM双氧水 64.60±0.56
阳性对照组1.5mM Nac 17.76±0.10
0.25mg/mL 52.45±0.00
0.50mg/mL 42.22±0.23
1.00mg/mL 30.38±0.17
1.50mg/mL 22.46±0.12
2.00mg/mL 19.15±0.09
由表2可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用。
实施例二
本发明的一种沙蚕抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
1)沙蚕，体质量为300-400尾/kg，采集后清洗，海水中室温吐沙48h；取2Kg沙蚕，按质量比1:6添加蒸馏水，于1200r/min的转速下，打浆6min，调整pH值为3.0，得沙蚕浆液；
2)在步骤1)所得的沙蚕浆液中加入胃蛋白酶，酶加入量为1000U/g料液，于45℃下，酶解1h，并于100℃下，灭酶4min，冷却，得酶解液；
3)将步骤2)所得的酶解液采用100目的滤袋粗滤，得粗滤液7.50L；
4)将步骤3)所得的粗滤液采用陶瓷膜澄清，陶瓷膜参数为膜芯精度180nm，膜面积为0.8m2，进料压力为4bar，出膜压力为3bar，平均膜通量为85LMH，平均膜通量是每平方米每小时透过是料液量，得澄清料液7.00L；
5)将步骤4)所得的澄清料液采用二步法过卷式超滤膜，第一步经过截留分子量为20000Da的聚醚砜膜，膜面积为0.30m2，进口压力为30bar，出口压力为20bar，平均膜通量为42LMH，收集滤过液6.50L；第二步经过截留分子量为2000Da的复合膜，膜面积为0.30m2，进口压力为30bar，出口压力为20bar，平均膜通量为20LMH，收集滤液6.20L；
6)将步骤5)所得的滤液采用真空加热浓缩，加热温度60℃，真空度为1.0MPa，浓缩后料液体积为2.2L；
7)将步骤6)所得的浓缩液电渗析脱盐，采用恒定电压模式，电压为12V，平均电流为0.28A，8对阴阳膜交替堆叠，流量控制为2L/min，电极为双涂层钛涂铱钽，接收液体积为4.0L，料液体积为2.2L，料液起始电导率为45.10ms/cm，脱盐后电导率为3.26ms/cm，脱盐率92.80％；
8)将步骤7)所得的脱盐之后的料液进行真空干燥，得沙蚕抗氧化粗肽；
9)将步骤8)所得的抗氧化粗肽，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephadex G-25凝胶柱进行柱层析，Sephadex G-25凝胶柱(规格是1.6×50cm)采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液平衡后，上样量为柱体积5％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，2mL/管，检测波长220nm，收集第31-45管，冷冻干燥；
10)将步骤9)所得组分，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephacryl S-100凝胶柱进行柱层析，Sephacryl S-100凝胶柱(规格是1.6×50cm)采用pH值为7.4浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液平衡后，上样量为柱体积3％，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，1mL/管，检测波长220nm，收集55-85管，冷冻干燥；
11)将步骤10)所得的组份，添加双蒸水，溶解至100mg/mL；采用高效液相色谱进行纯化，纯化条件如下：色谱柱BioBasic SEC60柱(7.8×300mm)，流动相：0-50％乙腈(含0.1％FA)梯度洗脱，洗脱速度1mL/min，上样量100uL，洗脱时间50min，紫外检测器，检测波长220nm，收集馏分液，冷冻干燥，得沙蚕抗氧化肽纯品。
本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品置于实施例一所用的TOF-LC-MS/MS指纹图谱上鉴定肽指纹图谱，由附图2可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽是序列为Gly-Leu-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Asp-Lys(缩写为GLSAPVPDDK)，分子量为1160Da，等电点为5.81的抗氧化肽。
将本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品溶解于蒸馏水中，配制成不同浓度的溶液，浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL，按照实施例一中的方法测定其对DPPH自由基、-OH和·O2 -的清除率，其中，阳性对照为0.16mg/mL的乙酰半胱氨酸(Nac)，实验结果如表3所示。由表3可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对DPPH自由基的清除率为IC50＝0.29mg/mL，而且，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对-OH和·O2 -的清除率IC50分别为0.279mg/mL和0.247mg/mL。
表3抗氧化肽对三种自由基的清除率
样品浓度(mg/mL) DPPH自由基清除率(％) 羟基自由基清除率(％) 超氧自由基清除率(％)
0.25 47.96±0.50 48.29±0.46 55.38±0.29
0.50 55.90±0.36 56.16±0.50 68.12±0.53
1.00 65.19±0.60 66.91±0.03 75.91±0.15
1.50 68.00±0.19 70.41±0.09 85.30±0.06
2.00 80.00±0.74 82.38±0.04 90.46±0.85
阳性对照 86.90±0.06 89.00±0.16 95.24±0.86
将本实施例所得的沙蚕抗氧化肽纯品溶解于蒸馏水，配制成不同浓度的溶液，浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL，按照实施例一中的方法测定其HUVEC细胞氧化损伤性能，其中，造模组为浓度是400μM的氧化剂H2O2，阳性对照为浓度是1.5mM的乙酰半胱氨酸(Nac)，实验结果如表4所示。由表4可以看出，本发明所得的沙蚕抗氧化肽对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用。
表4抗氧化肽对HUVEC细胞氧化损伤保护实验结果
样品浓度 HUVEC细胞生长抑制率(％)
造模组400μM双氧水 64.68±0.43
阳性对照组1.5mM Nac 17.16±0.17
0.25mg/mL 52.74±0.08
0.50mg/mL 42.26±0.27
1.00mg/mL 30.08±0.57
1.50mg/mL 22.44±0.09
2.00mg/mL 19.09±0.06
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以沙蚕为原料，经过吐沙、制浆、酶解、灭酶、过滤、浓缩、纯化、干燥等处理而得到，这种制备方法简单，操作方便，绿色环保，得率高，易于实现产业化；所得的沙蚕抗氧化肽纯度高，活性强，抗氧化作用好，对DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基均具有清除效果，同时，对HUVEC细胞氧化损伤有明显的保护作用，可广泛用于生产营养食品、功能食品和饲料等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110> 山东省海洋生物研究院
<120> 一种沙蚕抗氧化肽及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（沙蚕抗氧化肽）
<400> 1
Gly Leu Ser Ala Pro Val Pro Asp Asp Lys
1 5 10

Claims (4)

1.一种沙蚕抗氧化肽，其特征在于：
所述沙蚕抗氧化肽的序列为Gly-Leu-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Asp-Lys。
2.根据权利要求1所述的沙蚕抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）沙蚕，体质量为300-400尾/Kg，采集后清洗，海水中室温吐沙24h；取1Kg沙蚕，按质量比1:8添加蒸馏水，于800r/min的转速下，打浆2min，调整pH值为2.0，得沙蚕浆液；
2）在步骤1）所得的沙蚕浆液中加入胃蛋白酶，酶加入量为600U/g料液，于40℃下，酶解4h，并于90℃下，灭酶6min，冷却，得酶解液；
3）将步骤2）所得的酶解液采用200目的滤袋粗滤，得粗滤液7.80L；
4）将步骤3）所得的粗滤液采用陶瓷膜澄清，陶瓷膜参数为膜芯精度220nm，膜面积为0.4m2，进料压力为3bar，出膜压力为2bar，平均膜通量为92LMH，得澄清料液7.50L；
5）将步骤4）所得的澄清料液采用二步法过卷式超滤膜，第一步经过截留分子量为20000Da的聚醚砜膜，膜面积为0.20m2，进口压力为15bar，出口压力为10bar，平均膜通量为55LMH，收集滤过液7L；第二步经过截留分子量为2000Da的复合膜，膜面积为0.20m2，进口压力为15bar，出口压力为10bar，平均膜通量为30LMH，收集滤液6.8L；
6）将步骤5）所得的滤液采用真空加热浓缩，加热温度80℃，真空度为0.1MPa，浓缩后料液体积为1.6L；
7）将步骤6）所得的浓缩液电渗析脱盐，采用恒定电压模式，电压为11V，平均电流为0.80A，12对阴阳膜交替堆叠，流量控制为0.6L/min，电极为双涂层钛涂铱钽，接收液体积为1.6L，料液体积为1.6L，料液起始电导率为39.24ms/cm，脱盐后电导率为3.30 ms/cm，脱盐率91.59%；
8）将步骤7）所得的脱盐之后的料液进行真空干燥，得沙蚕抗氧化粗肽；
9）将步骤8）所得的抗氧化粗肽，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephadex G-25凝胶柱进行柱层析，Sephadex G-25凝胶柱的规格是1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积5%，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，2mL/管，检测波长220nm；收集第31-45管，冷冻干燥；
10）将步骤9）所得组分，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephacryl S-100凝胶柱进行柱层析，Sephacryl S-100凝胶柱的规格是1.6×50cm，事先采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液进行平衡，上样量为柱体积3%，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，1mL/管，检测波长220nm；收集55-85管，冷冻干燥；
11）将步骤10）所得的组份，添加双蒸水，溶解至100mg/mL；采用高效液相色谱进行纯化，纯化条件如下：色谱柱 BioBasic SEC60柱，规格为7.8×300mm，流动相：含0.1%FA 的0-50%乙腈梯度洗脱，洗脱速度1mL/min，上样量100uL，洗脱时间50min，紫外检测器，检测波长220nm，收集馏分液，冷冻干燥，得沙蚕抗氧化肽纯品。
3.根据权利要求1所述的沙蚕抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）沙蚕，体质量为300-400尾/kg，采集后清洗，海水中室温吐沙48h；取2Kg沙蚕，按质量比1:6添加蒸馏水，于1200r/min的转速下，打浆6min，调整pH值为3.0，得沙蚕浆液；
2）在步骤1）所得的沙蚕浆液中加入胃蛋白酶，酶加入量为1000U/g料液，于45℃下，酶解1h，并于100℃下，灭酶4min，冷却，得酶解液；
3）将步骤2）所得的酶解液采用100目的滤袋粗滤，得粗滤液7.50L；
4）将步骤3）所得的粗滤液采用陶瓷膜澄清，陶瓷膜参数为膜芯精度180nm，膜面积为0.8m2，进料压力为4bar，出膜压力为3bar，平均膜通量为85LMH，得澄清料液7.00L；
5）将步骤4）所得的澄清料液采用二步法过卷式超滤膜，第一步经过截留分子量为20000Da的聚醚砜膜，膜面积为0.30m2，进口压力为30bar，出口压力为20bar，平均膜通量为42LMH，收集滤过液6.50L；第二步经过截留分子量为2000Da的复合膜，膜面积为0.30m2，进口压力为30bar，出口压力为20bar，平均膜通量为20LMH，收集滤液6.20L；
6）将步骤5）所得的滤液采用真空加热浓缩，加热温度60℃，真空度为1.0MPa，浓缩后料液体积为2.2L；
7）将步骤6）所得的浓缩液电渗析脱盐，采用恒定电压模式，电压为12V，平均电流为0.28A，8对阴阳膜交替堆叠，流量控制为2L/min，电极为双涂层钛涂铱钽，接收液体积为4.0L，料液体积为2.2L，料液起始电导率为45.10ms/cm，脱盐后电导率为3.26ms/cm，脱盐率92.80%；
8）将步骤7）所得的脱盐之后的料液进行真空干燥，得沙蚕抗氧化粗肽；
9）将步骤8）所得的抗氧化粗肽，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephadex G-25凝胶柱进行柱层析，Sephadex G-25凝胶柱的规格是1.6×50cm，采用pH值为7.4且浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液平衡后，上样量为柱体积5%，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，2mL/管，检测波长220nm，收集第31-45管，冷冻干燥；
10）将步骤9）所得组分，添加双蒸水，溶解至10mg/mL，采用Sephacryl S-100凝胶柱进行柱层析，Sephacryl S-100凝胶柱的规格是1.6×50cm，采用pH值为7.4浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液平衡后，上样量为柱体积3%，洗脱时，采用上述磷酸盐缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱1.5倍柱体积，1mL/管，检测波长220nm，收集55-85管，冷冻干燥；
11）将步骤10）所得的组份，添加双蒸水，溶解至100mg/mL；采用高效液相色谱进行纯化，纯化条件如下：色谱柱 BioBasic SEC60柱，规格为7.8×300mm，流动相：含0.1%FA的0-50%乙腈梯度洗脱，洗脱速度1mL/min，上样量100uL，洗脱时间50min，紫外检测器，检测波长220nm，收集馏分液，冷冻干燥，得沙蚕抗氧化肽纯品。
4.一种根据权利要求1所述的沙蚕抗氧化肽的应用，其特征在于：
所述沙蚕抗氧化肽用于制备食品、饲料或抗氧化药品。
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