CN107594541A - 一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用，涉及苦瓜精深加工及多肽提取纯化技术领域。膜分离纯化技术工艺是将苦瓜原料清洗、打浆破碎，浸提，离心去渣，得离心液；将离心液经微滤膜系统进行过滤，得微滤膜透过液；将透过液经两种不同分子量卷式超滤膜纯化系统进行分离纯化，得超滤膜截留液；将截留液经高压反渗透膜进行浓缩，得固形物含量≥30％的浓缩液；将浓缩液干燥。该技术新工艺有效保证了苦瓜多肽蛋白的天然活性及其含量高于25％；制备的提取物含有大量具有调控血糖代谢功能的特定分子量和序列苦瓜多肽，对糖尿病治疗效果好，该苦瓜多肽蛋白提取物可制作成用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品。

Description

一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋 白提取物及其应用

技术领域

本发明涉及食用农产品加工技术领域，且特别涉及一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用。

背景技术

苦瓜又名凉瓜，属葫芦科植物，为一年生攀缘草木，果实为长椭圆形，成熟时为黄色，表面具有多数不整齐瘤状凸起，种子藏于肉质果实之中。苦瓜味苦性寒，是一种药食两用蔬菜。据《本草纲目》及《滇南本草》记载，苦瓜具有清热消暑、养血益气、补肾健脾、滋肝明目的作用；苦瓜中的维生素C含量高，具有预防坏血病、保护细胞膜、防止动脉粥样硬化、提高机体应激能力、保护心脏等作用；苦瓜含有胰蛋白酶抑制剂，可抑制癌细胞所分泌出来的蛋白酶，防止恶性肿瘤，而且还具备有降血脂和血压的作用。

近年来，关于苦瓜的研究就没有停止，1981年Khana报道了由苦瓜果实、种子和组织中提取出分子量为11kDa的成分，该成分经皮下注射对人体Ⅰ、Ⅱ型糖尿病具有良好的降血糖活性，但该成分口服会因肠道破坏失活；2003年刘璇报道了由苦瓜籽提取出6.8kDa的苦瓜多肽，该多肽具胰蛋白酶抑制活性和抗植物致病菌活性；2012年Blum A报道了由苦瓜中提取的粗提物可抑制11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型基因表达，用于Ⅱ型糖尿病治疗。中国专利文献号CN101985644A公开了一种苦瓜多肽及其制备方法与应用，利用木瓜蛋白酶解反应，将冻干苦瓜粉直接酶解约8小时得到含苦瓜多肽的混合液，进一步冷藏沉降48-72小时、过滤，并在100℃酶灭活处理30分钟。中国专利文献号CN104605136A公开了一种苦瓜多肽的制备方法，将苦瓜籽粉经去油后，利用碱水提取过滤、然后加酸沉降的方法分离苦瓜多肽，浸提和沉降时间各为24小时。

虽然科技人员已经认识到，从苦瓜中提取出来的苦瓜多肽提取物可用于治疗糖尿病，市场上也出现了很多苦瓜提取物及相应产品，但同时存在一些问题：一是上述文献及有关苦瓜多肽的制备方法，多采用各类酶解反应或碱提酸沉结合其他沉降等生产方法得到，制备时间周期长或某些步骤操作温度高，多肽蛋白质含量不高，极少超过10％，分子量分布不清楚。二是市面现有的苦瓜提取物产品多是以皂苷为主，实际上为“苦瓜皂苷”。天然活性的苦瓜多肽是有效调控血糖代谢的关键成分，因此，现有的苦瓜多肽蛋白提取物及相应产品对糖尿病的治疗效果有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，能高效提取、分离、纯化具有调节血糖功能的天然苦瓜多肽蛋白，有效保证苦瓜多肽蛋白的高生物活性及其含量。

本发明的另一目的在于提供一种苦瓜多肽蛋白提取物，其具有调控血糖代谢功能，对糖尿病的治疗效果好。

本发明的另一目的在于提供一种苦瓜多肽蛋白提取物的应用，可制作成用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其包括以下步骤：

将苦瓜原料清洗、打浆破碎，加入净化水浸提，再离心去渣，得离心液；

将离心液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；

将微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；

将超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液；

将超滤膜截留液经过截留分子量为100～150Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，得到浓缩液，浓缩液的固形物含量≥30％；

将浓缩液进行干燥，得到苦瓜多肽蛋白含量不低于25％的苦瓜提取物粉末。

进一步地，在本发明较佳实施例中，选用新鲜苦瓜或干燥苦瓜、苦瓜籽作为苦瓜原料，清洗的方法是：将苦瓜原料先经自来水清洗，再经电解式高浓度臭氧水清洗，清洗水中臭氧浓度达10～20mg/L，水流量150～450L/h。

进一步地，在本发明较佳实施例中，浸提的方法是：在粉碎或打浆后的苦瓜原料中加入5～10质量倍、使用缓冲盐调控体系pH近中性的净化水，在38～52℃进行超声波辅助的逆流提取2～4次，每次30～60分钟。

进一步地，在本发明较佳实施例中，离心去渣的方法是：采用碟片式离心机或管式离心机进行离心。

进一步地，在本发明较佳实施例中，微滤膜过滤系统采用三支膜并联使用，过滤膜为有机管式、中空纤维或陶瓷微滤膜，经过微滤膜系统进行过滤的操作温度为15～35℃，操作压力为0.1～0.5MPa。

进一步地，在本发明较佳实施例中，卷式超滤膜纯化系统采用两支膜并联使用，过滤膜为含有聚砜或聚醚砜材料的过滤膜，经过卷式超滤膜纯化系统进行纯化的操作温度为15～35℃，操作压力为0.3～0.8MPa。

进一步地，在本发明较佳实施例中，卷式高压反渗透膜系统浓缩系统采用四支膜串联使用，经过卷式高压反渗透膜系统进行浓缩的操作温度为15～35℃，操作压力为3.5～5.5MPa。

进一步地，在本发明较佳实施例中，干燥方法为真空冷冻干燥或低温喷雾干燥。

一种苦瓜多肽蛋白提取物，其采用上述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺制得，其苦瓜多肽蛋白含量不低于25％，多肽蛋白的分子量分布为4.5～68kDa之间，其中分子量6kDa左右的苦瓜多肽片段的含量占比例为18％～25％，该多肽蛋白的氨基酸序列表如SEQ ID NO.1所示。

一种苦瓜多肽蛋白提取物的应用，其作为制备用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品的原料。

本发明实施例的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用的有益效果是：本发明实施例的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺是将苦瓜原料清洗、打浆破碎，加入净化水浸提，再离心去渣，得离心液；将离心液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；将微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；将超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液；将超滤膜截留液经过截留分子量为100～150Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，得到固形物含量≥30％的浓缩液；将浓缩液进行干燥得到苦瓜多肽蛋白含量不低于25％的苦瓜提取物粉末，该技术工艺采用多层次的膜分离纯化技术，常温操作实现高效分离纯化精制浓缩，有效保证了苦瓜多肽蛋白的天然活性及其高含量，制备具有降低血糖功能的天然苦瓜多肽蛋白，其生产效率高、周期短、过程能耗低，连续化操作，清洗方便；相较于植物多肽蛋白的常规分离纯化工艺而言，后者使用凝胶类分子筛柱层析的方式，不仅操作繁琐费时、而且凝胶柱层析工业化放大具有生产成本高、清洗较麻烦的缺陷，因此本工艺技术具有极强的优势；制得的苦瓜多肽蛋白提取物含有大量具有调控血糖代谢功能的特定分子量和序列的苦瓜多肽，对糖尿病的治疗效果好，该苦瓜多肽蛋白提取物可制作成用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的苦瓜多肽蛋白提取物的多肽蛋白分子量分布的SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明实施例中的苦瓜多肽蛋白提取物对于餐后血糖值的影响变化图；

图3为本发明实施例中的苦瓜多肽蛋白提取物对于糖化血红蛋白的影响变化图；

图4为本发明实施例中的苦瓜多肽蛋白提取物对于胰岛素的影响变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用进行具体说明。

本发明实施例提供一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其包括以下步骤：

S1、清洗：选用新鲜苦瓜或干燥苦瓜、苦瓜籽作为苦瓜原料，多选用生长期较长，绿色偏黄、苦瓜籽粒较饱满的新鲜苦瓜作为原料。

苦瓜清洗的方法是：将苦瓜原料先经自来水清洗，再经电解式高浓度臭氧水清洗，清洗水中臭氧浓度达10～20mg/L，水流量150～450L/h，用以进一步清除农残药残、微生物残留等。

S2、打浆或粉碎：将清洗后的新鲜苦瓜打浆或将干燥的苦瓜原料粉碎成过20目筛的粗粉。

S3、浸提：将打浆或粉碎后的苦瓜原料倒入超声波辅助浸提罐，并加入5～10质量倍、38～52℃的净化水，利用缓冲盐调节体系pH＝6.8～7即中性，进行逆流提取2～4次，每次30～60分钟，得率高。

S4、离心去渣：采用碟片式离心机或高速管式离心机进行离心，并去渣，得离心液。

S5、微滤：将离心液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液。截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜过滤系统是指微滤膜的截留性能为3μm～0.1μm，例如：截留分子量为0.1μm的微滤膜系统是指其可以截留大于0.1μm的分子，使不大于0.1μm的分子通过。微滤膜透过液是指能通过微滤膜系统的液体。

本实施例中，微滤膜过滤系统是由三支膜并联使用，过滤膜为有机管式、中空纤维或陶瓷微滤膜组成；经过微滤膜系统进行过滤的操作温度为15～35℃，操作压力为0.1～0.5MPa。

S6、超滤：将微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液。截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统是指卷式超滤膜纯化系统的截留性能为50～200kDa，例如：截留分子量为200kDa的卷式超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于200kDa的分子，使分子量不大于200kDa的分子通过。超滤膜透过液是指通过卷式超滤膜纯化系统的液体。

将超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液。截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统是指卷式超滤膜纯化系统的截留性能为500～1000Da，例如：截留分子量为500Da的卷式超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于500Da的分子，使分子量不大于500Da的分子通过。超滤膜截留液是指卷式超滤膜纯化系统截留的液体。

本实施例中，卷式超滤膜纯化系统采用两支膜并联使用，过滤膜为含有(PS)聚砜或(PFS)聚醚砜材料的过滤膜。经过卷式超滤膜纯化系统进行纯化的操作温度为15～35℃，操作压力为0.3～0.8MPa。

S7：纳滤：将超滤膜截留液经过截留分子量为100～150Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，除去水分及小分子杂质，主要是部分残留无机盐离子，得到浓缩液，浓缩液的固形物含量≥30％。截留分子量为100～150Da的卷式高压反渗透膜系统是指卷式高压反渗透膜系统的截留性能为100～150Da，例如：截留分子量为100Da的卷式高压反渗透膜系统是指其可以截留分子量大于100Da的分子，使分子量不大于100Da的分子通过。浓缩液是指卷式高压反渗透膜系统截留的液体。

本实施例中，卷式高压反渗透膜系统即为高压浓缩膜，具体是由聚酰胺复合材料膜制成。卷式高压反渗透膜系统浓缩系统采用四支膜串联使用。经过卷式高压反渗透膜系统进行浓缩的操作温度为15～35℃，操作压力为3.5～5.5MPa。

S8、干燥：将浓缩液进行干燥，干燥方法为真空冷冻干燥或低温喷雾干燥，得到苦瓜多肽蛋白含量不低于25％的苦瓜提取物粉末，即为苦瓜多肽蛋白提取物。

本发明实施例提供一种苦瓜多肽蛋白提取物，其采用上述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺制得。

本发明实施例的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，高效提取、分离、纯化具有调节血糖功能的天然苦瓜多肽蛋白，免除酶解及高温灭酶步骤，生产周期短，分离纯化浓缩温度低，有效保证了制备的苦瓜蛋白多肽的天然活性及其高含量，苦瓜多肽蛋白提取物中苦瓜多肽蛋白(分子量为5～60kDa)的含量至少高于25％。提取物产品中不含大豆蛋白多肽等其他非苦瓜来源的多肽蛋白。另外，本发明实施例采用的是多层次的膜分离纯化技术，常温操作实现高效分离纯化精制浓缩，生产过程低能耗、连续化操作，清洗方便。而植物多肽蛋白的常规分离纯化工艺使用凝胶类分子筛柱层析的方式，不仅操作繁琐费时，而且凝胶柱层析工业化放大生产成本高、清洗较麻烦。

一、对苦瓜多肽蛋白提取物中苦瓜多肽蛋白的分子量进行检测：

具体是采用SDS-PAGE分析法对苦瓜多肽蛋白提取物中的多肽蛋白分子量分布进行检测，图1为检测到的PAGE电泳图。

由图1可以发现：按照本发明制备方法得到的苦瓜多肽蛋白提取物的苦瓜多肽蛋白，分子量为5.5～7kDa的苦瓜多肽的含量占比在20％以上，该蛋白多肽片段是有效调控血糖代谢的关键功能成分，接近胰岛素分子量。因此，按照本发明实施例的技术工艺得到的苦瓜多肽蛋白提取物中含有大量具有调节血糖功能的天然活性苦瓜多肽。

二、对上述分子量为5.5～7kDa的苦瓜多肽蛋白的氨基酸序列进行检测：苦瓜多肽蛋白提取物中分子量为5.5～7kDa的蛋白多肽片段的氨基酸序列表如SEQ ID NO.1所示。

具有上述氨基酸序列的苦瓜蛋白多肽的胰岛素受体结合能力强，能激活胰岛受体蛋白信号通路，恢复受损胰岛细胞功能。因此，采用本发明制备方法得到的苦瓜多肽蛋白提取物具有非常好的治疗糖尿病效果，尤其是结合胰岛素受体的能力及恢复胰岛功能与降血糖的效果。

本发明实施例提供一种苦瓜多肽蛋白提取物的应用，其作为制备用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品的原料。

苦瓜多肽蛋白是一种纯天然植物成分，通过激活胰岛素受体信号通路，最终提高胰岛素有效利用率来调控血糖，从而实现了血糖按照人体正常生理自然规律代谢的目的，且没有副作用。苦瓜多肽为糖尿病患者即血糖偏高人群提供了一种安全、持久的血糖调节的解决方案，缓解了人们在使用化学合成的降血糖药物时，给自身带来的系列毒副作用及并发症问题。采用高含量、天然活性的苦瓜多肽蛋白作为原料制成的特膳食品、保健食品或药品对糖尿病的治疗效果好。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种苦瓜多肽蛋白提取物，其采用以下方法制得：

选用生长期较长，绿色偏黄、苦瓜籽粒较饱满的新鲜苦瓜作为原料，将苦瓜原料先经自来水清洗，再经电解式高浓度臭氧水清洗，清洗水中臭氧浓度15mg/L，水流量300L/h，以降低农残药残及微生物残留。

将清洗后的苦瓜原料打浆破碎成过20目筛网的液态物料。

将打浆破碎后的苦瓜原料倒入超声波辅助浸提罐，并加入8质量倍、50℃的净化水，利用缓冲盐调节体系pH≈7，进行超声辅助的逆流提取3次，每次30分钟。

采用高速管式离心机进行离心，并去渣，得离心液。

将离心液经过截留分子量为1μm的中空纤维微滤膜系统进行过滤，操作温度为30℃，操作压力为0.3MPa，得微滤膜透过液。

先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，操作压力为0.8MPa，得超滤膜透过液；再将透过液经过截留分子量为800Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，压力为0.8MPa，得到超滤膜截留液。

将超滤膜截留液经过截留分子量为150Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，操作温度为30℃，操作压力为4MPa，得到固形物含量≥30％的浓缩液。

采用真空冷冻干燥的方式将浓缩液进行干燥，得到苦瓜多肽蛋白提取物，其多肽蛋白的含量达27.5％。

实施例2

本实施例提供一种苦瓜多肽蛋白提取物，其采用以下方法制得：

选用生长期较长，绿色偏黄、苦瓜籽粒较饱满的新鲜苦瓜作为原料，将苦瓜原料先经自来水清洗，再经电解式高浓度臭氧水清洗，水中臭氧浓度20mg/L，水流量450L/h，以降低农残药残及微生物残留。

将清洗后的苦瓜原料打浆破碎成过20目筛网的液态物料。

将打浆破碎后的苦瓜原料倒入超声波辅助浸提罐，并加入5质量倍、38℃的净化水，利用缓冲盐调节体系pH≈6.7，进行超声辅助的逆流提取2次，每次60分钟。

采用碟片式离心机进行离心，并去渣，得离心液。

将离心液经过截留分子量为0.1μm的有机管式微滤膜系统进行过滤，操作温度为25℃，压力为0.5MPa，得微滤膜透过液。

先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为100kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为35℃，压力为0.6MPa，得超滤膜透过液；再将透过液经过截留分子量为1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为25℃，压力为0.8MPa，得到超滤膜截留液。

将超滤膜截留液经过截留分子量为100Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，操作温度为25℃，操作压力为5.0MPa，得到固形物含量≥30％的浓缩液。

采用低温喷雾干燥的方式将浓缩液进行干燥，得到苦瓜多肽蛋白提取物，其多肽蛋白的含量为25.8％。

实施例3

本实施例提供一种苦瓜多肽蛋白提取物，其采用以下方法制得：

选用绿色偏黄、肉质饱满的干燥苦瓜或苦瓜切片作为原料，将苦瓜原料粉碎成过20目筛的粗粉。

将粉碎后的苦瓜原料倒入超声波辅助浸提罐，并加入10质量倍、52℃的净化水，利用缓冲盐调节体系pH≈6.8，进行超声波辅助的逆流提取2次，每次45分钟。

采用高速管式离心机进行离心，并去渣，得离心液。

将离心液经过截留分子量为0.2μm的陶瓷微滤膜系统进行过滤，操作温度为35℃，压力为0.5MPa，得微滤膜透过液。

先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为150kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为35℃，压力为0.5MPa，得超滤膜透过液；再将透过液经过截留分子量为500Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为35℃，压力为0.5MPa，得到超滤膜截留液。

将超滤膜截留液经过截留分子量为100Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，操作温度为35℃，压力为4.5MPa，得到固形物含量≥30％的浓缩液。

采用真空冷冻干燥或低温喷雾干燥的方式将浓缩液进行干燥，得到苦瓜多肽蛋白提取物，其多肽蛋白的含量达26.6％。

以下对实施例1～实施例3中的苦瓜多肽蛋白提取物进行药效评价。产品对糖尿病的药效评价可以从动物餐后的血糖值、糖化血红蛋白、胰岛素受体激酶活性这3个指标评价

一、苦瓜多肽蛋白提取物对于餐后血糖值的影响。

评价方法：将正常小鼠分为5组，分别为a组、b组、c组、d组和e组，禁食隔夜后分别喂食不同剂量实施例1中的苦瓜多肽蛋白提取物：a组为控制组，不喂食苦瓜多肽蛋白提取物；b组喂食苦瓜多肽蛋白提取物0.01mg/kg；c组喂食苦瓜多肽蛋白提取物0.1mg/kg；d组喂食苦瓜多肽蛋白提取物1mg/kg；e组喂食苦瓜多肽蛋白提取物10mg/kg，检测小鼠血糖值。

在15分钟后空腹注射葡萄糖4g/kg，并在不同时间点(30分钟、120分钟)检测小鼠血糖值，结果如图2所示。

通过图2可以发现：在大量摄取葡萄糖15分钟前食用苦瓜多肽蛋白提取物，2小时内就能快速使血糖获得调控。因此可以推论：本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物在血糖突然上升的情况下，能快速帮助降低血糖。

二、苦瓜多肽蛋白提取物对于糖化血红蛋白的影响。

评价方法：将正常小鼠标为f组，将糖尿病模型小鼠分为3组，分别为g组、h组、i组，每天正常喂食以及分别喂食不同剂量实施例2中的苦瓜多肽蛋白提取物：f组为正常对照组，不喂食苦瓜多肽蛋白提取物；g组为不喂食苦瓜多肽蛋白提取物的糖尿病小鼠；h组喂食苦瓜多肽蛋白提取物25mg/kg/d(低剂量)；i组喂食苦瓜多肽蛋白提取物50mg/kg/d(高剂量)，6周后检测所有小鼠的糖化血红蛋白HbA1c，结果如图3所示。

通过图3可以发现：长时间摄食本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物可以帮助糖化血红蛋白降低达34％，高剂量与低剂量的摄食量对糖化血蛋白的影响不明显，因此可以推论：本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物可以帮助调控血糖，且较佳的摄食量为25mg/kg。

三、苦瓜多肽蛋白提取物对于胰岛素受体的影响。

评价方法：将正常小鼠标为j组，将糖尿病模型鼠分为3组，分别为k组、m组、n组，每天正常喂食以及分别喂食不同剂量实施例3中的苦瓜多肽蛋白提取物：j组为正常对照组，不喂食苦瓜多肽蛋白提取物；k组喂食苦瓜多肽蛋白提取物0.5mg/kg/d；m组喂食苦瓜多肽蛋白提取物1mg/kg/d；n组喂食苦瓜多肽蛋白提取物4mg/kg/d，6周后，检测所有小鼠的胰岛素受体激酶活性，结果如图4所示。

通过图4可以发现：糖尿病鼠在长时间摄食本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物后，胰岛素受体激酶活性明显提高，尤其是n组糖尿病鼠的胰岛素受体激酶活性已经与正常小鼠的胰岛素受体激酶活性相差无几，由此可以推论：本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物可以提高胰岛素受体激酶活性，即有效维持胰岛素平衡，从而调控血糖稳定。

四、苦瓜多肽蛋白提取物对于高血糖糖尿病鼠空腹血糖的影响。

评价方法：将高血糖糖尿病模型小鼠分为4组，其中对照组正常喂食，另外3组每天分别经口喂食一次以实施例1、实施例2和实施例3中的苦瓜提取物加纯净水配制的灌胃液(当日配制，0.5mg/ml)，灌胃容量均为20ml/kg体重，连续给予受试物45d，对照组每日灌胃等量的纯净水。灌胃45d后各组模型小鼠禁食12h后测其空腹血糖值，结果如下表所示。

表1苦瓜提取物对高血糖糖尿病鼠空腹血糖的影响

由表1可见，试验前各组糖尿病模型鼠血糖检测值无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比，各剂量组小鼠空腹血糖值恢复正常，血糖值降低百分率均大大提高，由此可以推论：本发明实施例的苦瓜多肽蛋白提取物具有非常好的治疗糖尿病效果，尤其是降血糖及恢复胰岛功能调控血糖稳定的效果。

综上所述，本发明实施例的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺能高效提取、分离、纯化具有降低血糖功能的天然苦瓜多肽蛋白，生产周期短、分离纯化浓缩温度低，生产过程低能耗，有效保证了苦瓜多肽蛋白的天然活性及其高含量；制得的提取物含有大量具有调控血糖代谢功能的特定分子量和序列的苦瓜多肽，对糖尿病的治疗效果好；该苦瓜多肽蛋白提取物可制作成用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 李玉保，何静仁，湖北运鸿能源集团股份有限公司

<120> 一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Gln Cys Gln Gly Lys Arg Ser Trp Pro Gln Leu Val Gly Ser Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ala Lys Ala Val Ile Glu Arg Glu Asn Pro Arg Val Arg

20 25 30

Ala Val Ile Val Arg Val Gly Ser Pro Val Thr Ala Asp Phe Arg Cys

35 40 45

Asp Arg Val Arg Val Trp Val Thr Glu Arg Gly Ile Val Ala Arg Pro

50 55 60

Pro Ala Ile Gly

65

Claims (10)

1.一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，其包括以下步骤：

将苦瓜原料清洗、打浆破碎，加入净化水浸提，再离心去渣，得离心液；

将所述离心液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；

将所述微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；

将所述超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液；

将所述超滤膜截留液经过截留分子量为100～150Da的卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，得到浓缩液，所述浓缩液的固形物含量≥30％；

将所述浓缩液进行干燥，得到苦瓜多肽蛋白含量不低于25％的苦瓜提取物粉末。

2.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，选用新鲜苦瓜或干燥苦瓜、苦瓜籽作为苦瓜原料，所述清洗的方法是：将苦瓜原料先经自来水清洗，再经电解式高浓度臭氧水清洗，清洗水中臭氧浓度达10～20mg/L，水流量150～450L/h。

3.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述浸提的方法是：在粉碎或打浆后的苦瓜原料中加入5～10质量倍、使用缓冲盐调控体系pH近中性的净化水，在38～52℃进行超声波辅助的逆流提取2～4次，每次30～60分钟。

4.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述离心去渣的方法是：采用碟片式离心机或管式离心机进行离心。

5.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述微滤膜过滤系统采用三支膜并联使用，过滤膜为有机管式、中空纤维或陶瓷微滤膜，经过微滤膜系统进行过滤的操作温度为15～35℃，操作压力为0.1～0.5MPa。

6.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述卷式超滤膜纯化系统采用两支膜并联使用，过滤膜为含有聚砜或聚醚砜材料的过滤膜，经过卷式超滤膜纯化系统进行纯化的操作温度为15～35℃，操作压力为0.3～0.8MPa。

7.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述卷式高压反渗透膜系统浓缩系统采用四支膜串联使用，经过卷式高压反渗透膜系统进行浓缩的操作温度为15～35℃，操作压力为3.5～5.5MPa。

8.根据权利要求1所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺，其特征在于，所述干燥方法为真空冷冻干燥或低温喷雾干燥。

9.一种苦瓜多肽蛋白提取物，其特征在于，其采用如权利要求1至8中任一项所述的制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺制得，其苦瓜多肽蛋白含量不低于25％，多肽蛋白的分子量分布为4.5～68kDa之间，其中分子量6kDa左右的苦瓜多肽片段的含量占比例为18％～25％，该多肽蛋白的氨基酸序列表如SEQ ID NO.1所示。

10.一种如权利要求9所述的苦瓜多肽蛋白提取物的应用，其特征在于，其作为制备用于治疗糖尿病的特膳食品、保健食品或药品的原料。