CN103992387B - 一种贻贝蒸煮液活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贻贝蒸煮液活性肽及其制备方法和用途，该活性肽的氨基酸序列为Pro‑Arg‑Ser‑Arg‑Phe（SEQ No：1），ESI‑MS检测给出分子量为m/z 661.75 Da（[M+H]+662.61 Da）。贻贝蒸煮液加入到反渗透膜（RO膜）系统中，于压力2.0~3.0 MPa、温度20~30℃、流速0.5~1.0 m/s处理，得贻贝浓缩蒸煮液，贻贝浓缩蒸煮液喷雾干燥得蒸煮液固体粉末；制备的贻贝蒸煮液固体粉末按照1g:10~15 mL加入到甘氨酸–NaON缓冲液中，调pH至9.0~10.0，于45~55℃保温10~15 min，按照贻贝蒸煮液固体粉末质量加入蛋白酶，酶解，将酶解液加热灭酶活，离心，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得活性肽。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易于控制，制备的活性肽具有显著的抗氧化活性强，可用作于抗氧化相关的保健食品和药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种贝类蒸煮液活性肽的制备方法及应用，尤其涉及一种贻贝蒸煮液活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
贻贝是我国重要的养殖贝类品种之一，约占世界产量50%以上，目前主要加工手段为冷冻或干制。在干制贻贝过程中，需经过加水蒸煮取肉，煮过的汁液（即“贻贝蒸煮液”）则作为废液丢弃，既造成了资源的浪费，也带来了环境污染。
贻贝蒸煮液中含有水溶性的蛋白质、糖类、氨基酸、色素等物质。水溶性的蛋白质是蒸煮液中的主成分之一。因此，采用合理的技术，对贻贝蒸煮液中的蛋白资源加以回收利用，可有效提高贻贝原材料的利用率，创造经济效益，同时还可以保护环境，具有重要的意义。
目前，申请人研究发现，以贻贝蒸煮液为原料，利用反渗透膜浓缩技术浓缩蒸煮液，以酶解技术制备活性肽的工艺研究处于空白阶段，而利用贻贝蒸煮液酶解产物制备活性肽及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种贻贝蒸煮液活性肽，该抗活性肽具有较强的抗氧化作用，且安全无毒副作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种贻贝蒸煮液活性肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种贻贝蒸煮液活性肽在抗氧化功能食品和药物方面的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种贻贝蒸煮液活性肽，其特征在于该活性肽的氨基酸序列为Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 661.75 Da（[M+H]+ 662.61
Da）。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种贻贝蒸煮液活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取适量贻贝蒸煮液加入到反渗透膜（RO膜）系统中，于压力2.0~3.0 MPa、温度20~30 ℃、流速0.5~1.0 m/s处理，得贻贝浓缩蒸煮液，贻贝浓缩蒸煮液喷雾干燥得蒸煮液固体粉末；
2）将制备的贻贝蒸煮液固体粉末按照1g:10~15 mL加入到甘氨酸–NaON缓冲液中，调pH至9.0~10.0，于45~55 ℃保温10~15 min，按照贻贝蒸煮液固体粉末质量的0.5~1.0 %加入蛋白酶，酶解3~5 h；
3）将酶解液加热到90~95℃灭酶活10~15 min，4500~6000 r/min离心25~30 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到活性肽。
作为优选，所述步骤1）中的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝，或者翡翠贻贝。
作为优选，所述步骤1）中的反渗透膜为三醋酸纤维复合膜。
作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.9×105 U/g。
作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.0，采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa组分，即超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用超纯水配成20~25 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成30~50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）。
优选，所述凝胶为葡聚糖凝胶LH-20。
再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量20~25 μL；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18（250×4.6mm，5 μm）；柱温为20~25 ℃；流动相：20%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种贻贝蒸煮液活性肽的应用，其特征在于贻贝蒸煮液活性肽Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用。Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）具有抗氧化活性强和安全无毒副作用等优点，可应用于抗氧化功能食品和药物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用反渗透膜浓缩贻贝蒸煮液，显著提高了蒸煮液的浓缩效率，并使其营养物质得以最大程度的保留；酶解过程选用碱性蛋白酶作为酶解用酶，酶解过程易监控，使活性肽最大程度地释放出来；制备的活性肽是贻贝蒸煮液中的蛋白经酶水解制得，抗氧化作用显著，且安全、无毒副作用，可应用于抗氧化功能食品和药物。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶LH-20层析图；
图2是本发明的葡聚糖凝胶LH-20层析所分离各组分的羟基自由基清除活性图；
图3是本发明的葡聚糖凝胶LH-20制备酶解物（F3）的RP-HPLC图；
图4是本发明活性肽Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）的质谱（ESI-MS）图和结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种贻贝蒸煮液活性肽的制备方法，制备工艺流程如下：贻贝蒸煮液→反渗透膜浓缩→酶解→酶解物→超滤→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→活性肽。
实施例1：
1）取适量紫贻贝蒸煮液加入到反渗透膜（三醋酸纤维复合膜）系统中，于压力3.0 MPa、温度25 ℃、流速0.8 m/s处理，得贻贝浓缩蒸煮液，贻贝浓缩蒸煮液喷雾干燥得蒸煮液固体粉末；
2）将制备的贻贝蒸煮液固体粉末按照1g: 15 mL加入到甘氨酸–NaON缓冲液中，调pH至9.5，于50 ℃保温10 min，按照贻贝蒸煮液固体粉末质量的0.8 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.9×105 U/g），酶解4 h；
3）将酶解液加热到90℃灭酶活10 min，6000 r/min离心25 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到活性肽。
①超滤：将上清液调至pH 7.0，采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa组分，即超滤酶解液；
②凝胶层析：将上述超滤酶解液用超纯水配成20 mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用超纯水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物（F3）（图1）；
③高效液相色谱精制： 将上述凝胶制备酶解物（F3）用超纯水配成40 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量20 μL；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 （250×4.6mm，5 μm）；柱温25 ℃；流动相：20%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm）（见图2）。
④结构检测：收集羟基自由基清除活性最高的1个组分经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 661.75 Da（[M+H]+ 662.61
Da）（图3）。
将上述制得的贻贝蒸煮液抗氧化肽Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）进行羟基自由基清除实验和超氧阴离子自由基清除实验。实验结果表明：Pro-Arg-Ser-Arg-Phe（SEQ No：1）对羟基自由基（EC50 0.14 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50 0.39
mg/mL)具有良好的清除作用，适用于抗氧化相关保健食品和药物。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种贻贝蒸煮液活性肽及其制备方法和应用
<130> 2014
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Arg Ser
Arg Phe
1 5
Claims (7)
1.一种贻贝蒸煮液活性肽，其特征在于该活性肽的氨基酸序列为Pro-Arg-Ser-Arg-Phe，分子量为m/z 661.75 Da。
2.一种权利要求1所述的贻贝蒸煮液活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取适量贻贝蒸煮液加入到反渗透膜系统中，于压力2.0~3.0 MPa、温度20~30 ℃、流速0.5~1.0 m/s处理，得贻贝浓缩蒸煮液，贻贝浓缩蒸煮液喷雾干燥得蒸煮液固体粉末；
2）将制备的贻贝蒸煮液固体粉末按照1g:10~15 mL加入到甘氨酸–NaON缓冲液中，调pH至9.0~10.0，于45~55 ℃保温10~15 min，按照贻贝蒸煮液固体粉末质量的0.5~1.0 %加入蛋白酶，酶解3~5 h；
3）将酶解液加热到90~95℃灭酶活10~15 min，4500~6000 r/min离心25~30 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得活性肽；
所述步骤2）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.9×105 U/g。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝，或者翡翠贻贝。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的反渗透膜为三醋酸纤维复合膜。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.0，采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa组分，即超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用超纯水配成20~25 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成30~50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Pro-Arg-Ser-Arg-Phe。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述凝胶为葡聚糖凝胶LH-20；所述反相高效液相色谱条件为：进样量20~25 μL；色谱柱为规格是250×4.6mm，5 μm 的ZORBAX Eclipse Plus C18；柱温为20~25 ℃；流动相：20%的含0.1%三氟乙酸的乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
7.一种权利要求1所述的贻贝蒸煮液活性肽的用途，其特征在于用作制备抗氧化保健食品的用途。
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