CN105061558B - 一种金枪鱼蒸煮液活性肽及其制备方法和糖尿病治疗用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有二肽基肽酶Ⅳ（DPP‑Ⅳ）抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽及其制备方法和用途，该活性肽的氨基酸序列为Cys‑Tyr‑Trp‑Gln‑Pro‑Ile（CYWQPI），ESI‑MS测定分子量为808.15 Da。金枪鱼蒸煮液经超滤、酶解和色谱制备，得活性肽Cys‑Tyr‑Trp‑Gln‑Pro‑Ile（CYWQPI）。本发明制备工艺科学合理，制备的活性肽具有显著的二肽基肽酶Ⅳ（DPP‑Ⅳ）抑制活性，可用于糖尿病治疗相关的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种金枪鱼蒸煮液活性肽，本发明还涉及该活性肽的制备方法，本发明还涉及该活性肽在糖尿病治疗药物方面的用途。
背景技术
糖尿病分为两种类型：胰岛素依赖型Ⅰ型和非胰岛素依赖型Ⅱ型，而Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。目前，随着对糖尿病病理生理机制的深入研究，针对不同病理生理环节的药物开发越来越多。二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂就是目前开发的一种新颖、有效的降糖药之一。它能有效抑制DPP-Ⅳ的活性，增强肠促胰岛素活性，从而降低血糖，目前已成为糖尿病药物治疗新的焦点。
金枪鱼年产量超过600万吨，占公海渔业总产量的70%以上。金枪鱼罐头制备时，蒸煮是关键步骤之一，导致部分蛋白质溶解在蒸煮液中。目前，蒸煮液基本直接排掉，不仅造成蛋白质资源浪费，还会污染环境。因此，采用合理的技术，对金枪鱼蒸煮液中的蛋白资源加以回收利用，可有效提高金枪鱼原材料的利用率，创造经济效益，同时还可以保护环境，具有重要的意义。
目前，申请人研究发现，以金枪鱼蒸煮液为原料，利用超滤技术浓缩蒸煮液，以酶解技术制备具有二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制活性的活性肽的工艺研究处于空白阶段，而相关活性肽的应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼蒸煮液活性肽，该活性肽具有较强的二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制活性。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽在糖尿病治疗药物方面的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼蒸煮液活性肽，其特征在于该活性肽的氨基酸序列为Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI），ESI-MS测定分子量为808.15 Da。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取适量金枪鱼蒸煮液，用0.02~0.10 μm微滤膜去除颗粒杂质后，用膜孔径为10~50 kDa的聚醚砜膜，于压力125~150 kPa、温度25~30 ℃、pH 7.0~8.0、流速1.5~3.0 mL/s的条件下进行超滤处理，得金枪鱼浓缩蒸煮液；
2）将制备的金枪鱼浓缩蒸煮液于30~35 ℃保温10 min，按照1mg蛋白酶:3~5 mL浓缩蒸煮液的比例加入蛋白酶，酶解4~6 h；
3）将酶解浓缩蒸煮液依次经超滤和层析，得到活性肽。
作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼或鲣鱼。
作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为蛋白酶XXIII，酶活力≥4.0×103 U/g。
作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将酶解浓缩蒸煮液采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa组分，即超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用超纯水配成40~50 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析（2.5cm×50 cm）分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPP-Ⅳ抑制活性最强组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成80~100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据DPP-Ⅳ抑制活性得1个高活性多肽Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI）。
优选，所述凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25。
再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量10~20 μL；色谱柱为ZORBAX Eclipse PlusC18（250×4.6mm，5 μm）；流动相20%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.8~1.5 mL/min；紫外检测波长215 nm。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼蒸煮液活性肽的应用，其特征在于金枪鱼蒸煮液活性肽Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI）对DPP-Ⅳ具有良好的抑制作用，可应用于治疗糖尿病相关的药物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用超滤膜浓缩金枪鱼蒸煮液，显著提高了蒸煮液的浓缩效率，并使其蛋白质得以最大程度的保留；酶解过程选用蛋白酶XXIII作为酶解用酶，使活性肽最大程度地释放出来；制备的活性肽是金枪鱼蒸煮液中的蛋白经酶水解制得，对DPP-Ⅳ抑制作用显著，可应用于糖尿病治疗相关的药物。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析图；
图2是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-25制备酶解物（F4）的RP-HPLC图；
图3是本发明活性肽Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI）的结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼蒸煮液"超滤浓缩"酶解"超滤"凝胶过滤层析"HPLC制备"活性肽。
实施例：
1）取适量鲣鱼蒸煮液，用0.05 μm微滤膜去除颗粒杂质后，用膜孔径为50 kDa的聚醚砜膜，于压力130 kPa、温度30 ℃、pH 7.5、流速2.5 mL/s的条件下进行超滤处理，得浓缩蒸煮液；
2）将制备的浓缩蒸煮液于30 ℃保温10 min，按照1mg蛋白酶:3 mL浓缩蒸煮液的比例加入蛋白酶XXIII（酶活力≥4.0×103 U/g），酶解5 h；
3）将酶解浓缩蒸煮液依次经超滤和层析，得到活性肽。
①超滤：将酶解浓缩蒸煮液采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa组分，即超滤酶解液；
②凝胶柱层析：将上述超滤酶解液用超纯水配成45 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析（2.5 cm×50 cm）分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPP-Ⅳ抑制活性最强组分为凝胶层析酶解物（F4）（图1）；
③高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量20 μL；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 （250×4.6mm，5 μm）；流动相20%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长215nm）（见图2）。
④结构测定：收集DPP-Ⅳ抑制活性最高的1个组分经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI），ESI-MS测定分子量为808.95 Da。
将上述制得的金枪鱼活性肽Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI）进行DPP-Ⅳ抑制活性实验。实验结果表明：Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile（CYWQPI）对DPP-Ⅳ（IC50 14.0 μM)具有良好的抑制作用，可应用于治疗糖尿病相关的药物。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种金枪鱼蒸煮液活性肽及其制备方法和糖尿病治疗的用途
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Cys Tyr Trp Gln Pro Ile
1 5
Claims (1)
1.一种具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的金枪鱼蒸煮液活性肽，其特征在于该活性肽的氨基酸序列为Cys-Tyr-Trp-Gln-Pro-Ile，ESI-MS测定分子量为808.15Da。
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