CN103849671A - 一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，将富含蛋白的尾段、鱼头等下脚料与蒸煮液混合粉碎，经离心获得可直接酶解的蛋白源；添加1%-1.5%（w/v）风味蛋白酶，调节pH为6.0、温度为50℃，水解5h后，依次经离心、超滤、浓缩和冷冻干燥，即得到抗氧化肽。通过本发明制备的鲭鱼酶解多肽，具有良好的抗氧化活性。本发明以鲭鱼罐头加工副产物为原料，利用酶解方法制备抗氧化肽，实现了水产品加工副产物的绿色环保、高值化利用，而且制备工艺简单，制得的抗氧化肽活性强。

Description

一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法

技术领域

 本发明属于功能性食品加工技术或生物制药技术领域，具体涉及一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法。

背景技术

    （1）我国水产加工蒸煮液及副产物产量巨大亟待开发

    《2011渔业统计年鉴》显示，我国大陆地区2010年出口鱼罐头9.8万吨，在水产罐头尤其是鱼罐头生产中，会产生大量蒸煮液和下脚料，每年我国鱼类加工中总计有近百万吨蒸煮液亟待开发，而低值处理作饲料或抛弃的下脚料则达几百万吨。目前企业因为缺乏有效的技术手段，多数采用直接排放，对我国水体环境持续造成污染和破坏；而这些蒸煮液里富含优质鱼油和蛋白，未能得到高效利用，也增加了鱼罐头等产品的生产成本，成了制约鱼类加工企业发展的重要因素之一。

    鱼类加工蒸煮液及下脚料中蛋白的回收和加工能给企业带来很高的直接经济收益。研究表明，金枪鱼蒸煮液中蛋白含量达4%，每年台湾省光金枪鱼罐头加工所产生的蒸煮液中就至少含有400吨优质蛋白。鱼类加工下脚料中含有的蛋白含量更是可高达20%以上。鱼类加工蒸煮液及下脚料中的蛋白是生物活性肽的优质来源，水产蛋白源生物活性肽具有多种生理功能。因此回收蒸煮液和下脚料中蛋白，酶解蛋白制备生物活性肽，有助于鱼类加工企业实现蒸煮液和下脚料的环保化、高值化开发，延长鱼类加工企业产业链，提升企业的竞争力，促进产业升级，为低碳经济发展作贡献。

（2）国内外技术发展现状与趋势

目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3种：溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。由于酶水解法没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为食品和制药工业的首选方法。在酶法制备的过程中若要获得理想的提取率，蛋白酶的选择、酶解条件的选择、分离技术这三方面至关重要。

①水解酶的选择

目前在工业生产上应用比较广泛的蛋白酶主要有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等内肽酶。由于不同的蛋白酶酶切位点不同，同一蛋白片段在使用不同蛋白酶酶解后，所得的产物生物性质将差异很大，因此开发特定功能的生物活性肽时要根据要求选择合适的一种或几种蛋白酶。

②酶解条件的研究

酶解的时间、最适pH、最适温度以及加酶量、料液比是影响最终多肽得率的重要因素。首先，酶解时间对多肽得率至关重要，在酶解过程中多肽得率呈现了4个阶段：迅速上升阶段，缓慢增长阶段，稳定阶段，轻微下降阶段。其中稳定阶段多肽含量最高。因此，在酶解过程中，必须掌握好酶解时间。其次，蛋白酶的最适作用温度、pH对多肽得率影响显著。在不同的反应体系中，要根据底物浓度、种类及缓冲液等因素来设定蛋白酶的最适作用温度、pH等反应条件。

③酶解产物的分离纯化研究

酶法水解后蛋白质分解成长度不一的肽链，但生物活性肽的分子量大小在很大程度上决定其生物特性，所以要获得特定功能特性的生物活性肽，分子量是较重要的因素之一。酶法水解后如何提纯是酶法制备工艺的重中之重，目前常用的分离纯化方法有超滤法、离子交换层析法、凝胶过滤柱层析、毛细管电泳、吸附分离、反渗透，以及一些方法的联用技术。超滤法分离技术是通过采用适当规格的超滤膜来分离纯化出理想分子量大小的肽类，超滤法不但可以纯化多肽而且对多肽起到一定的浓缩作用，这种方法操作简单，因此成为目前众多研究者的首选方法。但超滤法一般得到特定分子量的多肽片段，要想获得单一成分，还需要通过交换层析技术与其它色谱技术相结合，然后通过电泳、氨基酸分析仪、质谱等来检测其纯度。

   目前实验室制备生物活性肽的方法还不适合工业化生产，在选择合适的蛋白酶条件下，应通过控制酶解过程各个环节来实现。目前已报道两种制备海洋生物活性肽的较有效方法：一是可以使用一个三酶系统使酶进行连续水解；二是将多步循环膜反应器和超滤膜系统联合使用，使酶连续水解。多步循环膜反应器技术装备和超滤膜系统的联用是近年来一种新兴的分离生物活性物质的方法，具有广阔的应用前景。

④利用酶解鱼罐头副产物制备生物活性肽的国内外技术发展现状与趋势

有关鱼罐头加工副产物中蛋白深度开发的研究工作目前开展的还较少，还缺乏成功完成产业化开发的报道。台湾学者对金枪鱼罐头加工中的蒸煮液，通过酶解方法制备生物活性肽，从抗氧化和降血压活性两个方面开展了较多试验性研究工作；温州农科院郑晓杰等对鳀鱼蒸煮液的真空浓缩工艺进行了研究；中国水产科学研究院南海水产研究所的周晓蕾等研究了超滤法浓缩鳀鱼加工蒸煮液的工艺，温州市农业科学研究院食品科学研究所的徐静等将鳀鱼蒸煮液用蛋白酶酶解，优化了酶解工艺，但尚未就酶解产物开展理化或功能性研究。总体来说，目前对鱼类加工蒸煮液及下脚料的利用还比较有限，对蛋白的高效回收还少有涉及，对蛋白的深加工还比较缺乏，研究工作还基本处于实验室阶段，酶解鱼类加工蒸煮液及下脚料制备生物活性肽的产业化开发还有待开展。

（3）对产业发展的影响

项目首先是解决困扰水产加工业尤其是鱼类加工业的严重环境污染问题；同时，利用水产加工副产物生产生物活性肽，将为整个产业带来高额附加值。《中国保健食品产业发展蓝皮书》显示，2011年我国保健食品销售额达1000亿元，且呈现出稳步增长的发展态势。和世界其他地区和国家的保健品市场相比，中国保健食品市场发展空间还很大。据统计：中国消费者平均用于保健品方面的花费占其总支出的0.07%，而欧美国家的消费者平均用于保健品方面的花费占其总支出的25%，相差甚远，这充分说明中国保健品市场的可发展潜力巨大。本项目中生产的抗氧化生物活性肽，可用于生产安全性好、功能丰富、实用性强的保健品，其市场潜力巨大。

鲭鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一。在鲭鱼罐头加工过程中产生大量的蒸煮液以及鱼头、鱼尾等下脚料，这些副产物中的蛋白含量很高，可以作为良好的蛋白质来源。综合、高效利用鲭鱼罐头副产物具有重要的意义，对鱼罐头产业的可持续发展也具有重要的意义。本项目的实施，将推动具有自主知识产权的成套技术、装备研制，突破国外技术壁垒，填补我国行业空白，降低环境污染，提高资源综合利用率，延长鱼类加工业产业链，提高鱼类加工业行业的利润，提升企业的创新能力和竞争力，对推进鱼类加工行业鱼罐头加工副产物的高值化利用及其关键共性技术研发具有重要意义。

发明内容

    本发明提供一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，高效利用鱼类加工下脚料及蒸煮液，制备具有抗氧化能力的生物活性肽。

本发明采用的技术方案为：

一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

      1)以鲭鱼罐头加工产生的副产物蒸煮液以及下脚料作为原料，混合粉碎后通过离心去除上层油；

2)将步骤1）的溶液置于酶解罐中，添加重量体积比为1%-1.5%（w /v）的风味蛋白酶，调节pH为6.0，温度为50℃，水解5h，得水解液；

      3)将步骤2)所得的酶解产物经灭酶处理得酶解液，将酶解液依次经离心、超滤、浓缩和冷冻干燥，即得到抗氧化肽。

所述步骤1)中的离心条件为：4000 r/min、15 ℃、5 min。

所述步骤1)中的下脚料为鱼头或鱼尾。

 所述步骤3)中的灭酶处理条件为:将步骤2)所得的酶解产物升温至95-100℃，并于此温度保持10-15min，再冷却至0-15℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。

所述步骤3)的超滤的具体过程为:将所述酶解液于0.18MPa的工作压力和45℃的工作温度下采用截留分子量为l0 KDa超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液；

所述冷冻干燥时间为22-24h。

   本发明具有以下显著优点：

   本发明以鲭鱼罐头加工下脚料及蒸煮液为原料，制备抗氧化活性肽，来源丰富，生产成本低，且工艺简便，绿色环保。选用风味蛋白酶酶解获得的生物活性肽具有较高的抗氧化活性，且安全无毒副作用，可广泛应用于食品、保健品工业生产中，具有很好的应用前景。同时，本发明实现了鱼类加工过程中产生的下脚料和蒸煮液的高值化利用，提高了其附加值，有利于鱼类加工产业的可持续发展。

附图说明

图1 DPPH自由基清除率随酶解液浓度的变化曲线。

图2 DPPH自由基清除率随维生素C浓度变化曲线。

图3 羟自由基清除率随酶解液浓度变化曲线。

图4 羟自由基清除率随维生素C浓度变化曲线。

图5 还原力吸光值随酶解液浓度变化。

图6 还原力吸光值随维生素C浓度变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，制备流程如下：鲭鱼加工下脚料及蒸煮液→均质去油→调节pH值→加酶→酶解→沸水浴灭酶10min→离心（4000r/min、10min）→最优条件下酶解得到的上清液→浓缩→冷冻干燥→抗氧化肽

1、称取鲭鱼加工下脚料鱼尾及蒸煮液混合物100g，均质后通过离心去除上层油，将混合液放入酶解罐中，调节pH值至6.0，温度为50℃，添加混合液质量1%的风味蛋白酶，搅拌酶解5h后得酶解产物；

2、将步骤1所得的酶解产物升温至100℃，并于此温度保持15min，再冷却至15℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液，离心条件为4000 r/min、15℃、5 min；

3、将离心后酶解液于0.18MPa的工作压力和45℃的工作温度下采用截留分子量为l0 KDa的超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液；

4、将超滤酶解液浓缩后冷冻干燥24h，即得到抗氧化肽。

5、将通过上述步骤所制得的抗氧化肽进行DPPH自由基、羟自由基清除实验以及还原力测定实验，实验结果表明本发明制备的抗氧化肽对DPPH自由基（IC₅₀值为31.35 mg/mL）和羟自由基（IC₅₀值为9.807 mg/mL）具有较好的清除能力，并具有较强的还原能力（IC₅₀值为7.019 mg/mL）。

 以上为本发明的一个具体实施例，但并只用以限定本发明，根据本发明内容所得到的变形均应认为是本发明的保护内容。

Claims (6)

1.一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以鲭鱼罐头加工产生的副产物蒸煮液以及下脚料作为原料，混合粉碎后通过离心去除上层油；

2)将步骤1）的溶液置于酶解罐中，添加重量体积比为1%-1.5%的风味蛋白酶，调节pH为6.0，温度为50 ℃，水解5h，得水解液；

3)将步骤2)所得的酶解产物经灭酶处理得酶解液，将酶解液依次经离心、超滤、浓缩和冷冻干燥，即得到抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于：所述步骤1)中的离心条件为：4000 r/min、15 ℃、5 min。

3.根据权利要求1所述的一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于：所述步骤1)中的下脚料为鱼头或鱼尾。

4.根据权利要求1所述的一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于：所述步骤3)中的灭酶处理条件为：将步骤2)所得的酶解产物升温至95-100℃，并于此温度保持10-15min，再冷却至0-15℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。

5.根据权利要求1所述的一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于所述步骤3)的超滤的具体过程为：将所述酶解液于0.18MPa的工作压力和45℃的工作温度下采用截留分子量为l0 KDa超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液。

6.根据权利要求1所述的一种鲭鱼罐头加工副产物酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于：所述冷冻干燥时间为22-24h。

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