CN103540638A - 一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其方法是：将富含蛋白的头尾段等副产物与蒸煮液组合粉碎，然后经同步三相分离，获得可直接酶解的蛋白源后，添加风味蛋白酶，在pH=6.5，50℃条件下酶解4h，酶解液再经超滤、活性炭吸附、脱盐进行纯化，并经喷雾干燥制备肽粉，检测其多种抗氧化活性，通过上述工艺获得的肽粉对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基具有良好的清除率，其IC50分别为3.55mg/ml、1.39mg/ml和0.61mg/ml，是优异的抗氧化剂。本发明制备的肽粉为淡黄色、无苦味、微鱼腥味，分子量（>90.1%）可控制为≤10000Da，多肽总蛋白质（以干基计）为88.6%，灰分为7.2%。

Description

一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法

技术领域

本发明属于海洋生物工程酶法生产工艺技术，是一种酶法水解鲣鱼制备抗氧化肽粉的工艺方法。

背景技术

目前，水产加工业已经成为我国渔业经济重要的一环。尤其是水产罐头加工出口，为我国提供了大量的就业机会、大幅增加了个人收入和外汇来源。在水产罐头尤其是鱼罐头生产中，会产生大量蒸煮液和头尾段等副产物，每年我国鱼类加工中总计有近百万吨蒸煮液亟待开发，而低值处理作饲料或抛弃的头尾段等副产物则达几百万吨。鱼类加工蒸煮液及下脚料副产物中的蛋白是生物活性肽的优质来源。研究表明，金枪鱼蒸煮液中蛋白含量达4%，每年台湾省光金枪鱼罐头加工所产生的蒸煮液中就至少含有400吨优质蛋白。鱼类加工下脚料中含有的蛋白含量更是可高达20%以上。

鲣鱼，属鲈形总目、金枪鱼亚目、金枪鱼科、舵鲣亚科、鲣属，又名正鲣、炸弹鱼、坚鱼、松鱼、飞虎鱼。鲣鱼是大洋性重要经济鱼。鲣鱼可供鲜食或制成咸干品，世界主要渔业国利用鲣鱼加工成罐头制品，在欧美市场十分畅销。鲣鱼分布范围较广，在印度洋、太平洋和大西洋水温高于15摄氏度以上的水域，都有鲣鱼的踪迹，并且储量丰富、开发利用前景乐观。2005年来,仅中西太平洋的鲣鱼的平均产量就达l25万吨/年。刘承初等研究表明自溶酶解法是回收鱼类加工废弃物中蛋白质成分的一种有效的方法。王玉明等的研究表明鲣鱼肝脏酶解物对高果糖大鼠具有明显的降压活性。然而，酶解鲣鱼罐头加工蒸煮液及头尾段副产物制备抗氧化肽方面的研究尚属空白。

目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3种：溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。由于酶水解法没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为食品和制药工业的首选方法。在酶法制备的过程中若要获得理想的提取率，蛋白酶的选择、酶解条件的选择、分离技术这三方面至关重要。

目前在工业生产上用酶法制备生物活性肽应用比较广泛的蛋白酶主要有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等内肽酶。由于不同的蛋白酶酶切位点不同。同一蛋白片段在使用不同蛋白酶酶解后，所得的产物生物性质将差异很大。如胰蛋白酶只催化水解碱性氨基酸所形成的肽键，底物特异性较窄，所以酶切位点相对较少，酶切片段较大；木瓜蛋白酶能作用于蛋白质中L-赖氨酸、甘氨酸、卜精氨酸和b瓜氨酸等参与形成的肽键.底物特异性较宽，所以其酶切位点较为广泛，所得酶切片段分子量相对较小。因此，在开发特定功能的生物活性肽时要根据要求选择合适的一种或几种蛋白酶。

酶解时间、蛋白酶最适pH、蛋白酶最适温度和加酶量，以及料液比是影响最终多肽得率的重要因素。首先，酶解时间对多肽得率至关重要，在酶解过程中多肽得率呈现了4个阶段：迅速上升阶段，缓慢增长阶段，稳定阶段，轻微下降阶段。其中稳定阶段多肽含量最高。国内外许多酶法制备海洋生物活性肽的研究已证实这种蛋白酶解曲线。因此，在酶解过程中，必须掌握好酶解时间。其次，蛋白酶的最适作用温度、pH对多肽得率影响显著。在不同的反应体系中，要根据底物浓度、种类及缓冲液等因素来设定蛋白酶的最适作用温度、pH等反应条件。

近年来大量的研究表明，从各种海洋生物蛋白水解液中分离得到的多肽，具有潜在的抗氧化能力。目前国内外报道已从乌贼、牡蛎、蓝贻贝、长尾鳕、竹荚鱼及鳕鱼等海洋动物中分离得到抗氧化活性肽。这些海洋生物抗氧化活性肽能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤。

发明内容

本发明的目的是提出一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的酶解工艺方法，优化酶解工艺参数，以提高生物活性肽的回收率，获得分子量较小且具有良好抗氧化活性的肽粉。

本发明是按以下技术方案实现的，

一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，包括如下步骤：

（1）鲣鱼罐头加工副产物→组合粉碎；下脚料与蒸煮液的重量比比例范围为1-3:1，粉碎至40目-60目

（2）三相分离，去除油相；

（3）酶解：并使混合液温度升至50℃搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min;然后加入风味蛋白酶（Flavourzyme），启动酶解反应，加酶量范围为1000-5000U/g，酶解温度为45-55℃，连续搅拌，酶解液起始pH值6-7，酶解时间为3-5h，得酶解产物；

（4）灭酶：

（5）超滤：将酶解液先用0.45um的中空纤维膜进行微滤，取滤液；微滤后的酶解液经10000Da的超滤膜超滤后，其透过液再用1000Da的膜超滤，滞留液。（6）脱腥脱色。

步骤（1）中，下脚料与蒸煮液的重量比比例范围为1-3:1，粉碎至40目-60目。鱼类加工中蒸煮液产量大，但里面蛋白含量一般在4-8%，直接酶解不具有经济效益，而采用浓缩后酶解，会产生大量能耗，本发明将富含蛋白的尾段、鱼头等下脚料与蒸煮液组合粉碎，然后经同步三相分离，获得可直接酶解的蛋白源，工艺更经济，流程更简洁。

酶法制备生物活性肽非常关键的技术之一是酶制剂的选择。蛋白质原料最大可能的抽提并彻底水解为小肽，需要成熟的前处理工艺和降解蛋白能力强大的酶产品。功能肽是否具有生理活性取决于蛋白降解的酶切位点，酶的酶切位点还决定了功能肽产品的风味和口感。不同的蛋白酶在水解蛋白质分子时，由于其底物专一性的不同而会给出不同的蛋白质降解产物。如果酶制剂选择不适当，就会产生带有苦味的肽片段，而去苦味是很困难的。在酶制剂的选择上，本发明通过大量的前期工作，最后确定的主要用酶是酶解效果好且性价比高的食品级工业用酶，因而可以得到预期的分子量范围的小肽。而且，这种工业用酶价格相对比较便宜。通过使用合适的蛋白酶和优化的酶解工艺，获得了口感好和生理功能强的功能肽产品。本发明采用的为南宁庞博生物工程有限公司的风味酶，其产品号为PBF-1M。

在本发明的较佳实施例中，步骤（4）为：将酶解产物于80-95℃水浴中灭酶10-15min，然后冷却从而终止酶反应，接着在4000-8000r/min下离心10-20min后取上清液作为酶解液；

在本发明的较佳实施例中，步骤（5）10000Da的超滤膜的超滤条件为45℃、pH7.0、压力0.18MPa。

在本发明的较佳实施例中，步骤（6）为脱腥脱盐脱色采用活性炭：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0；

在本发明的较佳实施例中，还包括步骤（7）喷雾干燥→抗氧化肽。

在本发明的较佳实施例中，步骤（7）为脱色液50℃下真空浓缩，浓缩液经喷雾干燥，进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s，得抗氧化肽粉，所得肽粉为浅黄色，无苦味、微鱼腥味。

在本发明的最佳实施例中，风味蛋白酶最适加酶量为：1200U/g。优化酶解工艺参数为：酶解温度：50℃；酶解时间：4hr；酶解液起始pH值6.5；超滤处理参数为：其超滤的最佳条件是45℃、pH7.0、压力0.18MPa、物料初始浓度6%，在此条件下，酶解液经10000Da的膜超滤后，其透过液再用1000Da的膜超滤；活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0。活性炭吸附参数为：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度50℃、时间40min，pH6.5。喷雾干燥参数为：进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s。

本发明以鲣鱼罐头加工蒸煮液及头尾段副产物为原料，按比例进行组合粉碎，加入风味蛋白酶混合，在优化的酶解工艺参数（时间、温度、pH）条件下进行酶解，将所得的酶解产物经灭酶处理得酶解液，将酶解液依次经超滤、脱腥脱色、喷雾干燥后，得到生物活性肽。通过测定所获得的肽粉对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率，确定其抗氧化活性。

本发明与已有相关技术相比，具有以下特点：

1、鲣鱼加工副产物产量大，含有丰富的蛋白质，是生物活性肽的优质来源，原料价格低廉，来源稳定，进行酶解处理可以实现环保化、高值化开发；

2、筛选优化了利用鲣鱼加工副产物制备生物活性肽的酶制剂、酶解工艺参数及分离纯化方法，生物活性肽回收率高，实施过程中所需要的酶反应器、离心、超滤、干燥设备等技术成熟度高、可行性强。

3、通过酶制剂选择、酶解参数调控、离心超滤等纯化方法，可得分子量（＞90.1%）小于10000Da的生物活性肽粉。

4、得到的生物活性肽具有良好的抗氧化活性，对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的IC50分别为3.55mg/ml、1.39mg/ml和0.61mg/ml。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种酶解鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，制备流程如下:鲣鱼罐头加工副产物→组合粉碎→三相分离→酶解→超滤→脱腥脱盐脱色→喷雾干燥→抗氧化肽。

实施例1

1.针对9-12月捕获的鲣鱼，将鱼罐头加工产生的鱼头、尾段副产物与蒸煮液按2:1比例混合，进行组合粉碎；

2.利用三相油水分离器进行三相分离，去除油相；

3.将去除鱼油后的组分搅匀，并使混合液温度升至50℃搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min;然后加入风味蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司，其产品号为PBF-1M）启动酶解反应，加酶量为1200U/g，酶解温度为50℃，连续搅拌，酶解液起始pH值6.5,酶解时间为4hr，得酶解产物。

4.将步骤3)所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经超滤、脱盐等，得抗氧化肽，具体过程为:①灭酶:将酶解产物于95℃水浴中灭酶lOmin，然后冷却从而终止酶反应，接着在5000r/min下离心15min后取上清液作为酶解液；②超滤:将酶解液先用0.45um的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在45℃、pH7.0、压力0.18MPa条件下，经10000Da的膜超滤超滤后，其透过液再用1000Da的膜超滤，取滞留液；③脱色脱腥干燥：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0；脱色液50℃下真空浓缩，浓缩液经喷雾干燥，进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s，得抗氧化肽粉。所得肽粉为浅黄色，无苦味、微鱼腥味。

5.最后进行理化和抗氧化活性测定。产品执行的质量标准参考GB/T22492-2008《大豆肽粉》和GB/T22493-2008《大豆蛋白粉》。抗氧化活性则测定对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率。

测定方法见附件1、2。

测试结果：对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的IC50分别为3.55mg/ml、1.39mg/ml和0.61mg/ml。

实施例2

1.针对9-12月捕获的鲣鱼，将鱼罐头加工产生的鱼头、尾段副产物与蒸煮液按3:1比例混合，进行组合粉碎；

2.利用三相油水分离器进行三相分离，去除油相；

3.将去除鱼油后的组分搅匀，并使混合液温度升至50℃搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min;然后加入风味蛋白酶启动酶解反应，加酶量为1500U/g，酶解温度为48℃，连续搅拌，酶解液起始pH值6.5,酶解时间为5hr，得酶解产物。

4.将步骤3)所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经超滤、脱盐等，得抗氧化肽，具体过程为:①灭酶:将酶解产物于95℃水浴中灭酶l5min，然后冷却从而终止酶反应，接着在5000r/min下离心15min后取上清液作为酶解液；②超滤:将酶解液先用0.45um的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在45℃、pH7.0、压力0.18MPa条件下，经10000Da的膜超滤超滤后，其透过液再用1000Da的膜超滤，取滞留液；③脱色脱腥干燥：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0；脱色液50℃下真空浓缩，浓缩液经喷雾干燥，进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s，得抗氧化肽粉。所得肽粉为浅黄色，无苦味、微鱼腥味。

5.最后进行理化和抗氧化活性测定。抗氧化活性则测定对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率。

测定方法同实施例1

测试结果：对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的IC50分别为3.54mg/ml、1.38mg/ml和0.63mg/ml。

附件1、肽相对分子质量分布的测定方法

1原理

采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分相对分子质量大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱法测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到肽的相对分子质量大小及分布范围。

A.4.3样品处理

准确称取样品10mg于10mL容量瓶中，加入少许流动相，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，加流动相稀释至刻度，用孔径0.2um-0.5um有机相膜过滤，滤液按A.4.1的色谱条件进行分析。

A.5相对分子质量分布的计算

将A.4.3制备的样品溶液在A.4.1色谱条件下分析后，用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线A.4.2中进行计算，即可得到样品的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一法可计算得到不同肽段相对分子质量的分布情况，按式（1）进行计算:

式中:

X—试样中某相对分子质量肽段所占总肽段的质量分数，%;

A—某相对分子质量肽段的峰面积;

A总—各相对分子质量肽段的峰面积之和，

(其中n表示样品相对分子质量段数)。计算结果保留小数点后一位。

A.6重复性

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过两次测定结果算术平均值的15%。

附件2、抗氧化活性测定

B.1DPPH自由基清除率

B.1.1原理

DPPH自由基是一种稳定的自由基，甲醇溶液呈紫色，在可见光区吸收峰为517nm。当加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光值变小，且吸光值变小的程度与自由基清除率呈线性关系。通过吸光值的测定，计算自由基清除率。清除率越大，抗氧化能力越强，从而可评价某物质清除自由基的能力。

B.1.4.2清除率测定

取不同浓度的样品溶液0.1mL，加入B.2.4.1配制的DPPH溶液3.9mL，摇匀，暗处反应30min后于517nm处测吸光度。按（2）式计算清除率：

式中：A0—空白组吸光值，A1—样品组吸光值。

B.2超氧阴离子自由基清除率

B.2.1原理

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，氧化过程中产生超氧阴离子自由基：O2-·，O2-·会加速邻苯三酚自氧化速率，同时产生有色中间产物，中间产物的积累在一定时间内呈良好的线性关系，有色产物在325nm处有强烈的光吸收。由于自氧化过程的速率依赖于O2-·的浓度，清除O2-·能够抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价样品的超氧阴离子自由基清除能力。

B.2.4操作步骤

B.2.4.1邻苯三酚自氧化曲线制作

取50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2）4.5mL，加入4.2mL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热的0.3mL的邻苯三酚溶液（用10mmol/L的HCl配制），迅速摇匀后，325nm波长下每隔30s测吸光度，邻苯三酚自氧化5min后，计算线性范围内每分钟吸光值的增加值△A0，制作邻苯三酚自氧化曲线。

B.2.4.2清除率测定

用10mmol/L的HCl代替邻苯三酚做空白。加入邻苯三酚之前加入不同的样品溶液，作为待测液，按照B.2.4.1测定每分钟吸光度的增加值△A。按（3）式计算清除率：

式中：

△A0—邻苯三酚自氧化吸光值的增加值，△A—样品组吸光值的增加值。

B.3羟自由基清除率

B.3.1原理

羟自由基氧化水杨酸得到2,3-二羟基苯甲酸，用其在510nm处的吸光值表示·OH的多少。吸光值与·OH的量成正比。反应体系中加入具有清除·OH作用的物质即可降低该吸光值。测定吸光值即可测试样品的·OH清除率。

B.3.4操作步骤

取不同浓度的样品0.5mL，依次加入1.5mL2.0mmol/L的FeSO4溶液，1.5mL6.0mmol/L的H2O2溶液，1.5mL6.0mmol/L的水杨酸溶液。37℃反应30min后冷水冷却，510nm处测吸光度。

式中：

A0—为空白组吸光值，

A1—为样品组吸光值，

A2—为试剂空白吸光值。

Claims (7)

1.一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，包括如下步骤：

（1）鲣鱼罐头加工副产物→组合粉碎，下脚料与蒸煮液的重量比比例范围为1-3:1，粉碎至60目以下；

（2）三相分离，去除油相；

（3）酶解：使混合液温度升至50℃搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min，然后加入风味蛋白酶，启动酶解反应，加酶量范围为1000-5000U/g，酶解温度为45-55℃，连续搅拌，酶解液起始pH值6-7，酶解时间为3-5h，得酶解产物；

（4）灭酶：

（5）超滤：将酶解液先用0.45um的中空纤维膜进行微滤，取滤液；微滤后的滤液再经10000Da的膜超滤，其透过液再用1000Da的膜超滤，取滞留液；

（6）脱腥脱色。

2.如权利要求1所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤（4）为：将酶解产物于80-95℃水浴中灭酶10-15min，然后冷却从而终止酶反应，接着在4000-8000r/min下离心10-20min后取上清液作为酶解液。

3.如权利要求1所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤（5）10000Da的膜超滤条件为45℃、pH7.0、压力0.18MPa。

4.如权利要求1所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤（6）为脱腥脱色采用活性炭：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0。

5.如权利要求1所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于：还包括步骤（7）喷雾干燥→抗氧化肽。

6.如权利要求5所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤（7）为脱色液50℃下真空浓缩，浓缩液经喷雾干燥，进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s，得抗氧化肽粉。

7.如权利要求1所述的一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其特征在于，风味蛋白酶加酶量为：1200U/g；酶解工艺参数为：酶解温度：50℃；酶解时间：4hr；酶解液起始pH值6.5；

超滤处理参数为：其超滤条件是45℃、pH7.0、压力0.18MPa、物料初始浓度6%，在此条件下，酶解液经10000Da的膜超滤后，其透过液再用1000Da的膜超滤；活性炭用量为0.1%(w/w)、温度45℃、时间40min,pH7.0；

活性炭吸附参数为：活性炭用量为0.1%(w/w)、温度50℃、时间40min，pH6.5；

喷雾干燥参数为：进口温度125～140℃、出口温度范围为70～90℃、料液温度50℃、料液流速0.10ml/s。