CN108192942A - 一种提高小分子核桃肽产率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高小分子核桃肽产率的方法。本发明保护一种制备核桃肽的方法，包括如下步骤：(1)采用复合酶对核桃粕进行酶解，收集固相；(2)取固相，采用酸性蛋白酶进行酶解，分别收集液相和固相；(3)取固相，采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解，收集液相；(4)将步骤(2)得到的液相和步骤(3)得到的液相混合，进行酶灭活；(5)完成步骤(4)后，收集液相并脱盐，然后进行干燥，得到核桃肽。本发明采取复合酶对核桃粕中的非蛋白物质进行部分降解，采用酸性蛋白酶和中性偏碱性蛋白酶分步对核桃粕固体物质进行酶解，使得其中的蛋白酶解和提取更加充分，进一步提高核桃蛋白收率以及最终产品中的蛋白含量。
Description
技术领域
本发明涉及食品或保健品加工技术领域，具体涉及一种提高小分子核桃肽产率的方法。
背景技术
核桃粕是核桃油生产的副产品，蛋白含量为40％以上。核桃粕起初多当作饲料销售，附加值较低。近年有厂家用核桃粕作为原料制备小分子核桃蛋白肽产品，宣称其具有增强人体免疫力、抗衰老、抗氧化、恢复疲劳等功能，产品获得较高的经济附加值。
根据调研和相关文献资料发现，目前生产规模的核桃蛋白肽工艺普遍酶解不够充分，具有核桃蛋白收率低(50％左右)、核桃肽产品蛋白含量低(70％左右)的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高小分子核桃肽产率的方法。
本发明首先提供了一种制备核桃肽的方法(方法甲)，包括如下步骤：
(1)采用复合酶对核桃粕进行酶解，收集固相；所述复合酶由两种以上的酶组成且具有降解非蛋白物质的用途；
(2)取步骤(1)得到的固相，采用酸性蛋白酶进行酶解，分别收集液相和固相；
(3)取步骤(2)得到的固相，采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解，收集液相；
(4)将步骤(2)得到的液相和步骤(3)得到的液相混合，进行酶灭活；
(5)完成步骤(4)后，收集液相并脱盐，然后进行干燥，得到核桃肽。
本发明还保护一种以核桃粕为原料制备核桃肽的方法(方法乙)，包括如下步骤：在采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解前，先采用复合酶对核桃粕进行酶解；所述复合酶由两种以上的酶组成的切具有降解非蛋白物质的用途。
本发明还保护一种以核桃粕为原料制备核桃肽的方法(方法丙)，包括如下步骤：在采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解前，进行如下步骤：先采用复合酶对核桃粕进行酶解，然后收集固相并用酸性蛋白酶进行酶解；所述复合酶由两种以上的酶组成的切具有降解非蛋白物质的用途。
以上任一所述复合酶由淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成。
以上任一所述酸性蛋白酶具体可为微生物酸性蛋白酶。
所述中性蛋白酶或碱性蛋白酶具体可为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、诺维信A1calase2.4L蛋白酶或2709碱性蛋白酶。
以上任一所述方法中，采用复合酶对核桃粕进行酶解的方法具体如下：取核桃浆液，调整pH＝5.5，加入以上任一所述复合酶，45℃搅拌酶解2h，调pH＝5.0，45℃搅拌15min。
可采用盐酸调整pH。
所述核桃浆液的制备方法如下：取核桃粕，粉碎至40目，加水浸泡1h后，研磨浸泡后的整个体系，得到所述核桃浆液。所述核桃粕和水的配比关系为：10kg核桃粕：80kg水。
以上任一所述方法中，固相采用酸性蛋白酶酶解的方法具体如下：将固相加入水中充分搅拌分散，调整pH＝3.5，加入以上任一所述酸性蛋白酶，50℃搅拌酶解4h。
可采用盐酸调整pH。所述固相和水的质量比为：1∶3。
采用酸性蛋白酶酶解后收集固相。
以上任一所述方法中，采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解的方法具体如下：将待酶解的固相加入水中充分搅拌分散，调整pH＝7.5-10.5，加入中性和/或碱性蛋白酶，55℃搅拌酶解4h。
当所述中性和/或碱性蛋白酶为木瓜蛋白酶+胰蛋白酶时，调整pH＝8.0。
当所述中性和/或碱性蛋白酶为木瓜蛋白酶时，调整pH＝8.5。
当所述中性和/或碱性蛋白酶为胰蛋白酶时，调整pH＝7.5。
当所述中性和/或碱性蛋白酶为诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶时，调整pH＝8.7。
当所述中性和/或碱性蛋白酶为2709碱性蛋白酶时，调整pH＝10.5。
可采用氢氧化钠调整pH。所述固相和水的质量比为：1∶2。
所述方法甲的步骤(4)中，酶灭活的方法为：将混合后的溶液调整pH＝6.5，95℃保温10min。可采用氢氧化钠调整pH。
所述方法甲的步骤(5)中，收集液相并脱盐前还包括如下步骤：向酶灭活后的体系中加入活性炭(500g，作用是脱腥脱苦)80℃搅拌20min，然后加入硅藻土(200g)，进行澄清过滤(采用过滤面积0.7平方的板框过滤机，过滤压力2.5kg)，收集液相。
所述脱盐的方法为将液相在0.5MPa压力纳滤100min。
以上任一所述方法中，所述核桃粕和所述复合酶的配比关系为10kg核桃粕∶5000-20000U淀粉酶∶8000-12000U纤维素酶∶8000-12000U果胶酶∶1500-2500U木聚糖酶。
所述核桃粕和所述复合酶的配比关系具体可为10kg核桃粕∶5000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶。
所述核桃粕和所述复合酶的配比关系具体可为10kg核桃粕∶10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶。
以上任一所述方法中，所述核桃粕和所述酸性蛋白酶的配比关系为10kg核桃粕∶500-1500万U酸性蛋白酶。
所述核桃粕和所述酸性蛋白酶的配比关系具体可为10kg核桃粕∶1000万U酸性蛋白酶。
以上任一所述方法中，所述核桃粕和所述中性或碱性蛋白酶的配比关系为如下(a)-(e)中的任一种：
(a)10kg核桃粕∶4000万U木瓜蛋白酶∶30万U胰蛋白酶；
(b)10kg核桃粕∶8000万U木瓜蛋白酶；
(c)10kg核桃粕∶50万U胰蛋白酶；
(d)10kg核桃粕∶300AU诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶；
(e)10kg核桃粕∶3000万U 2709碱性蛋白酶。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的核桃肽。
所述核桃肽的分子量小于1100Da(目前一般市售动植物肽产品的分子量一般为2000-3000Da)。
本发明还保护一种复合酶，包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶。
所述复合酶的配比关系为：5000-20000U淀粉酶∶8000-12000U纤维素酶∶8000-12000U果胶酶∶1500-2500U木聚糖酶。
所述复合酶的配比关系具体可为：5000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶。
所述复合酶的配比关系具体可为：10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶。
所述复合酶的用途为制备核桃肽。
本发明还保护一种用于制备核桃肽的酶组合物，包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和中性或碱性蛋白酶。
所述酸性蛋白酶具体可为微生物酸性蛋白酶。
所述中性蛋白酶或碱性蛋白酶具体可为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、诺维信Alcalase2.4L蛋白酶或2709碱性蛋白酶。
所述酶组合物中，酶的配比关系具体可为如下(a)-(e)中的任一种：
(a)5000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶∶1000万U酸性蛋白酶∶4000万U木瓜蛋白酶∶30万U胰蛋白酶；
(b)10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶∶1000万U酸性蛋白酶∶8000万U木瓜蛋白酶；
(c)10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶∶1000万U酸性蛋白酶∶50万U胰蛋白酶；
(d)10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶∶1000万U酸性蛋白酶∶300AU诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶；
(e)10000U淀粉酶∶10000U纤维素酶∶10000U果胶酶∶2000U木聚糖酶∶1000万U酸性蛋白酶∶3000万U 2709碱性蛋白酶。
以上任一所述核桃粕的蛋白含量(质量百分含量)为45％-80％，具体可为55％。
核桃粕中除了蛋白质，还含有多糖、膳食纤维、果胶等成分，这些成分和蛋白质结合在一起，阻碍了蛋白质的溶出和蛋白酶对蛋白质的降解，本发明采取复合酶对核桃粕中的非蛋白物质进行部分降解，促进蛋白质的溶出，同时在蛋白酶解提取过程中，采用酸性蛋白酶和中性偏碱性蛋白酶分步对核桃粕固体物质进行酶解，使得其中的蛋白酶解和提取更加充分，进一步提高核桃蛋白收率以及最终产品中的蛋白含量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
核桃粕：石家庄市康福寿核桃油加工有限公司，蛋白含量55％(质量百分含量)。
淀粉酶：山东隆大生物工程有限公司，2000U/g；酶活力定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于60℃、pH＝6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量。
纤维素酶：山东隆大生物工程有限公司，5000U/g；酶活力定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在50℃、pH＝4.8条件下，1h水解纤维素产生1mg葡萄糖所需的酶量。
果胶酶：宁夏夏盛实业集团有限公司，20000U/g；酶活力定义：每小时每毫升酶液在50℃、pH＝4.8条件下产生1.0mg还原糖(半乳糖醛酸为准)所需的酶量。
木聚糖酶：湖南尤特尔生化有限公司，20万U/g；酶活力定义：每小时每毫升酶液在50℃、pH＝4.8条件下产生1.0mg还原糖(木糖)所需的酶量。
微生物酸性蛋白酶：山东隆大生物工程有限公司，5万U/g；酶活力定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于40℃、pH＝3.0条件下，每分钟水解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量。
木瓜蛋白酶：山东隆大生物工程有限公司，40万U/g；酶活力定义：在37℃、pH＝7.0条件下，每分钟水解酪蛋白释出的可溶物在275nm波长吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时所需的酶量。
胰蛋白酶：山东隆大生物工程有限公司，4000U/g；酶活力定义：在37℃、pH＝8.0条件下，每分钟水解酪素产生1ug酪氨酸所需的酶量。
诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司，2.4AU/g；酶活力定义：在最适条件下，每分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
2709碱性蛋白酶：南宁东恒华道生物科技有限责任公司，15万U/g。酶活力定义：在40℃，pH＝10.5条件下，每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸所需的酶量。
实施例1、核桃多肽的提取
一、方法一
1、取核桃粕(蛋白含量55％)10kg，粉碎至40目，加至80kg水中浸泡1h，然后胶体磨研磨浸泡后的整个体系得到核桃浆液，使用稀盐酸调整pH至5.5，加入淀粉酶5000U、纤维素酶1万U、果胶酶1万U和木聚糖酶2万U，45℃搅拌酶解2h，用盐酸调节pH至5.0，45℃搅拌15min，采用蝶式离心机进行固液分离，收集固体沉淀。
2、取步骤1收集的固体沉淀，称重，加至三倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至3.5，加入微生物酸性蛋白酶1000万U，50℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，分别收集上清液(第一次酶解液)和固体沉淀。
3、取步骤2收集的固体沉淀，称重，加至两倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至8.0，加入木瓜蛋白酶4000万U和胰蛋白酶30万U，55℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，收集上清液(第二次酶解液)。
4、将步骤2得到的上清液(第一次酶解液)和步骤3得到的上清液(第二次酶解液)混合，使用氢氧化钠调整pH至6.5，95℃保温10min(使酶失活)，向体系中加入活性炭500g并80℃搅拌20min(加入活性炭的作用是脱腥脱苦)，然后加入200g硅藻土，采用过滤面积0.7平方的板框过滤机进行澄清过滤，过滤压力2.5kg，得到的清液在0.5MPa压力纳滤100min脱盐，双效蒸发浓缩后，进行喷雾干燥，得到4.87kg粉末，采用凯氏定氮法测其蛋白含量达到85％，提取蛋白收率达到75.3％(成品中蛋白量与原料中蛋白量的比例)，经过高效液相色谱凝胶柱测得其平均分子量为550Da(方法参照“GB/T22729-2008海洋鱼低聚肽粉”中分子量测定方法)，为小分子核桃蛋白肽。
二、方法二
1、取核桃粕(蛋白含量55％)10kg，粉碎至40目，加至80kg水中浸泡1h，然后胶体磨研磨浸泡后的整个体系得到核桃浆液，使用盐酸调整pH至5.5，加入淀粉酶2万U、纤维素酶1万U、果胶酶1万U和木聚糖酶1万U，45℃搅拌酶解2h，用稀盐酸调节pH至5.0，45℃搅拌15min，采用蝶式离心机进行固液分离，收集固体沉淀。
2、取步骤1收集的固体沉淀，称重，加至三倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至3.5，加入微生物酸性蛋白酶1000万U，50℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，分别收集上清液(第一次酶解液)和固体沉淀。
3、取步骤2收集的固体沉淀，称重，加至两倍质量的水中充分搅拌分散，使用氢氧化钠调整pH至8.5，加入木瓜蛋白酶8000万U，55℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，收集上清液(第二次酶解液)。
4、将步骤2得到的上清液(第一次酶解液)和步骤3得到的上清液(第二次酶解液)混合，使用氢氧化钠调整pH至6.5，95℃保温10min灭酶，向酶解液中加入活性炭500g，80℃搅拌20min脱腥脱苦，然后采用过滤面积0.7平方的板框过滤机进行澄清过滤，过滤压力2.5kg，得到的清液在0.5MPa压力纳滤100min脱盐，双效蒸发浓缩后，进行喷雾干燥得到4.73kg粉末，采用凯氏定氮法测其蛋白含量达到84.5％，提取蛋白收率达到72.7％(成品中蛋白量与原料中蛋白量的比例)，经过高效液相色谱凝胶柱测得其平均分子量为833Da(方法参照“GB/T22729-2008海洋鱼低聚肽粉”中分子量测定方法)，为小分子核桃蛋白肽。
三、方法三
1、取核桃粕(蛋白含量55％)10kg，粉碎至40目，加至80kg水中浸泡1h，然后胶体磨研磨浸泡后的整个体系得到核桃浆液，使用盐酸调整pH至5.5，加入淀粉酶2万U、纤维素酶1万U、果胶酶1万U和木聚糖酶1万U，45℃搅拌酶解2h，用稀盐酸调节pH至5.0，45℃搅拌15min，采用蝶式离心机进行固液分离，收集固体沉淀。
2、取步骤1收集的固体沉淀，称重，加至三倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至3.5，加入微生物酸性蛋白酶1000万U，50℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，分别收集上清液(第一次酶解液)和固体沉淀。
3、取步骤2收集的固体沉淀，称重，加至两倍质量的水中充分搅拌分散，使用氢氧化钠调整pH至7.5，加入胰蛋白酶50万U，55℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，收集上清液(第二次酶解液)。
4、将步骤2得到的上清液(第一次酶解液)和步骤3得到的上清液(第二次酶解液)混合，使用稀氢氧化钠调整pH至6.5，95℃保温10min灭酶，向酶解液中加入活性炭500g，80℃搅拌20min脱腥脱苦，然后采用过滤面积0.7平方的板框过滤机进行澄清过滤，过滤压力2.5kg，得到的清液在0.5MPa压力，纳滤100min脱盐，双效蒸发浓缩后，进行喷雾干燥得到4.9kg粉末，采用凯氏定氮法测其蛋白含量达到85.3％，提取蛋白收率达到76％(成品中蛋白量与原料中蛋白量的比例)，经过高效液相色谱凝胶柱测得其平均分子量为590Da(方法参照“GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉”中分子量测定方法)，为小分子核桃蛋白肽。
四、方法四
1、取核桃粕(蛋白含量55％)10kg，粉碎至40目，加至80kg水中浸泡1h，然后胶体磨研磨浸泡后的整个体系得到核桃浆液，使用盐酸调整pH至5.5，加入淀粉酶2万U、纤维素酶1万U、果胶酶1万U和木聚糖酶1万U，45℃搅拌酶解2h，用稀盐酸调节pH至5.0，45℃搅拌15min，采用蝶式离心机进行固液分离，收集固体沉淀。
2、取步骤1收集的固体沉淀，称重，加至三倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至3.5，加入微生物酸性蛋白酶1000万U，50℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，分别收集上清液(第一次酶解液)和固体沉淀。
3、取步骤2收集的固体沉淀，称重，加至两倍质量的水中充分搅拌分散，使用氢氧化钠调整pH至8.7，加入诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶300AU，55℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，收集上清液(第二次酶解液)。
4、将步骤2得到的上清液(第一次酶解液)和步骤3得到的上清液(第二次酶解液)混合，使用氢氧化钠调整pH至6.5，95℃保温10min灭酶，向酶解液中加入活性炭500g，80℃搅拌20min脱腥脱苦，然后采用过滤面积0.7平方的板框过滤机进行澄清过滤，过滤压力2.5kg，得到的清液在0.5MPa压力纳滤100min脱盐，双效蒸发浓缩后，进行喷雾干燥得到4.97kg粉末，采用凯氏定氮法测其蛋白含量达到84.1％，提取蛋白收率达到76％(成品中蛋白量与原料中蛋白量的比例)，经过高效液相色谱凝胶柱测得其平均分子量为1050Da(方法参照“GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉”中分子量测定方法)，为小分子核桃蛋白肽。
五、方法五
1、取核桃粕(蛋白含量55％)10kg，粉碎至40目，加至80kg水中浸泡1h，然后胶体磨研磨浸泡后的整个体系得到核桃浆液，使用盐酸调整pH至5.5，加入淀粉酶2万U、纤维素酶1万U、果胶酶1万U和木聚糖酶1万U，45℃搅拌酶解2h，用稀盐酸调节pH至5.0，45℃搅拌15min，采用蝶式离心机进行固液分离，收集固体沉淀。
2、取步骤1收集的固体沉淀，称重，加至三倍质量的水中充分搅拌分散，使用盐酸调整pH至3.5，加入微生物酸性蛋白酶1000万U，50℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，分别收集上清液(第一次酶解液)和固体沉淀。
3、取步骤2收集的固体沉淀，称重，加至两倍质量的水中充分搅拌分散，使用氢氧化钠调整pH至10.5，加入2709碱性蛋白酶3000万U，55℃搅拌酶解4h，采用蝶式离心机进行固液分离，收集上清液(第二次酶解液)。
4、将步骤2得到的上清液(第一次酶解液)和步骤3得到的上清液(第二次酶解液)混合，使用氢氧化钠调整pH至6.5，95℃保温10min灭酶，向酶解液中加入活性炭500g，80℃搅拌20min脱腥脱苦，然后采用过滤面积0.7平方的板框过滤机进行澄清过滤，过滤压力2.5kg，得到的清液在0.5MPa压力纳滤100min脱盐，双效蒸发浓缩后，进行喷雾干燥得到5.06kg粉末，采用凯氏定氮法测其蛋白含量达到83.3％，提取蛋白收率达到76.6％(成品中蛋白量与原料中蛋白量的比例)，经过高效液相色谱凝胶柱测得其平均分子量为875Da(方法参照“GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉”中分子量测定方法)，为小分子核桃蛋白肽。
Claims (10)
1.一种制备核桃肽的方法，包括如下步骤：
(1)采用复合酶对核桃粕进行酶解，收集固相；所述复合酶由两种以上的酶组成且具有降解非蛋白物质的用途；
(2)取步骤(1)得到的固相，采用酸性蛋白酶进行酶解，分别收集液相和固相；
(3)取步骤(2)得到的固相，采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解，收集液相；
(4)将步骤(2)得到的液相和步骤(3)得到的液相混合，进行酶灭活；
(5)完成步骤(4)后，收集液相并脱盐，然后进行干燥，得到核桃肽。
2.一种制备核桃肽的方法，包括如下步骤：在采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解前，先采用复合酶对核桃粕进行酶解；所述复合酶由两种以上的酶组成的切具有降解非蛋白物质的用途。
3.一种制备核桃肽的方法，包括如下步骤：在采用中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶进行酶解前，进行如下步骤：先采用复合酶对核桃粕进行酶解，然后收集固相并用酸性蛋白酶进行酶解；所述复合酶由两种以上的酶组成的切具有降解非蛋白物质的用途。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述复合酶由淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成。
5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述核桃粕和所述复合酶的配比关系为10kg核桃粕：5000-20000U淀粉酶：8000-12000U纤维素酶：8000-12000U果胶酶：1500-2500U木聚糖酶。
6.如权利要求1或3所述的方法，或，权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述核桃粕和所述酸性蛋白酶的配比关系为10kg核桃粕：500-1500万U酸性蛋白酶。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：所述中性蛋白酶或碱性蛋白酶具体可为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、诺维信Alcalase 2.4L蛋白酶或2709碱性蛋白酶。
8.权利要求1至7任一所述方法制备得到的核桃肽。
9.一种复合酶，包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶。
10.一种用于制备核桃肽的酶组合物，包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和中性或碱性蛋白酶。
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