CN111836625A - 制备木葡聚糖-寡糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备寡糖的方法，该寡糖尤其可以用作食物添加剂，以降低食物产品的卡路里含量、使食物产品增甜、提高食物产品的纤维含量、改善食物产品的质地以及刺激肠道微生物组细菌。此外，它们还可以应用于动物饲料或其他应用领域。更具体地，本发明涉及将木葡聚糖多糖高温水解为确定的木葡聚糖寡糖。本发明还涉及用本发明的方法生产的寡糖水解产物，以及涉及所述寡糖水解产物在人类和/或动物营养中作为益生元或其他用途的用途。还提供了新型内切葡聚糖酶，其用于本发明的方法以及其他应用。

Description

制备木葡聚糖-寡糖的方法

技术领域

本发明涉及一种制备寡糖的方法，该寡糖尤其可以用作食物添加剂，以降低食物产品的卡路里含量、使食物产品增甜、提高食物产品的纤维含量、改善食物产品的质地以及刺激肠道微生物组细菌。此外，它们还可以应用于动物饲料或其他应用领域。更具体地，本发明涉及将木葡聚糖(xyloglucan)多糖高温水解为确定的木葡聚糖寡糖(xyloglucanoligosaccharide)。本发明还涉及用本发明的方法生产的寡糖水解产物，以及涉及所述寡糖水解产物在人类和/或动物营养中作为益生元或其他用途的用途。还提供了新型内切葡聚糖酶，其用于本发明的方法以及其他应用。

背景技术

通常，脂肪、油、淀粉、碳水化合物、糖以及由其衍生的产品广泛用于加工食物中。这些成分在食物的外观、味道、口感和其他感官品质方面具有至关重要的功能意义。但是，它们可以在肠道通过过程中被人体代谢，因此大大增加了此类食物的卡路里含量。近来，消费者的健康意识越来越强。因此，许多个体试图将高卡路里食物和含有高脂肪水平食物的摄入最小化。消费者要求卡路里降低且低脂肪形式的传统加工食物。通过添加非消化性寡糖，可以减少糖和脂肪的量，而不会损失加工食物的感官品质。

诸如European Agency for Food Safety(EFSA Journal,2010)和American Foodand Drug Agency(FDA)(https://www.accessdata.fda.gov/scripts/InteractiveNutritionFactsLabel/factsheet s/Dietary_Fiber.pdf)之类的监管机构承认膳食纤维每日摄入量的重要性，并建议以每天25克作为成人平均每天的建议摄入量。然而，研究表明，目前平均膳食纤维摄入量约为每天18克(Hoy and Goldman,2014)。因此，对食物添加剂的需求不断增长，以通过增加纤维含量而不会对感官品质产生不利影响来功能替代加工食物的赋予卡路里/脂肪的内容物。本发明解决了该问题，以提供一种满足上述要求并克服现有技术障碍的添加剂。专利申请WO1991011112A1描述了一种以高浓度添加的酶在45-50℃之间的温度酶促木葡聚糖水解为寡糖的方法。此外，除了具有高聚合度(DP 7-9)的所需寡糖以外，该方法还产生超过15％的小寡糖和单体糖，这些小寡糖和单体糖必须在第二下游方法步骤中除去。本发明精心选择了酶，且由于高温避免了较小的寡糖和单体糖的产生并提高了方法效率。

发明内容

本发明通过权利要求1的方法解决了该问题。出乎意料地发现，木葡聚糖源(诸如罗望子(tamarind)果仁粉)的高温水解提供了低卡路里的食物添加剂，该添加剂可以用于代替目前加工食物中赋予卡路里的内容物，同时增加纤维含量，而不会对感官品质产生不利影响。进一步出乎意料地发现，使用高温步骤和具有高温谱(profile)的酶简化了木葡聚糖-多糖水解，提高了整体性能并避免了额外的纯化步骤。本发明的方法可以只用一种酶进行，因为精心选择的特异性酶在高于50℃的温度表现出木葡聚糖酶活性，即使在700g/l或更高的高底物量时也足以完全水解木葡聚糖-多糖。

所述酶可为例如内切葡聚糖酶，例如选自属于糖苷水解酶(GH)家族5、9、12、16、44或74的内切葡聚糖酶。

本发明还提供了一种与选自SEQ ID NO：1至4的多肽具有至少75％序列相同性的细菌酶。所述酶在高于50℃的温度时适当地表现出木葡聚糖酶活性。

本发明还提供了一种与选自SEQ ID NO：1至4的多肽具有至少75％序列相同性的细菌酶，其在高DP7-DP9浓度存在时表现出木葡聚糖酶活性。

本发明还提供了一种木葡聚糖水解产物，其用本发明的方法生产。所述木葡聚糖水解产物的特征在于其基本上包含DP7至DP9木葡聚糖-寡糖(XGOS)的混合物。

本发明还涉及所述木葡聚糖水解产物用于生产食物产品的用途。本发明还涉及该木葡聚糖水解产物和包含其的食物产品用于人类营养。

本发明还涉及所述木葡聚糖水解产物用于生产饲料产品的用途。本发明还涉及该木葡聚糖水解产物和包含其的饲料产品用于动物营养。

还提供了用本发明的方法生产的木葡聚糖水解产物和包含其的食物产品，用于改善人体健康，诸如作为饱腹剂降低进餐后的血糖水平或减少食物中的卡路里。

具体实施方式

在一优选实施方案中，本发明提供了一种从木葡聚糖源生产木葡聚糖-寡糖(XGOS)的方法，所述方法包含在高于50℃的温度用酶将木葡聚糖进行酶促水解，该酶在高于50℃的温度表现出木葡聚糖酶活性。

优选的木葡聚糖源是食物产品生产的副产物，最优选包含罗望子的产物流(即衍生自罗望子的产物)，其包含其级分诸如罗望子果仁粉、脱脂罗望子果仁粉或罗望子种子。

根据本发明的替代木葡聚糖源为例如胡椒草、油菜籽、苹果、越桔、蓝莓和橄榄，其包含其级分，尤其是种子和细胞壁，或包含显著木葡聚糖多糖含量的任何其他来源。显著含量是指木葡聚糖含量高于5％。用本文所述方法进行的这些木葡聚糖的碳水化合物水解产物主要包含聚合度(DP)在6至11之间的寡糖。

罗望子木葡聚糖水解产物的独特之处在于，与其他碳水化合物水解产物不同，其主要包含(通常>65％70％，优选>75％，更优选>80％或>85％，最优选>90％或>95％)聚合度(DP)在7至9之间的寡糖。

罗望子多糖得自罗望子树的种子，Tamarindus indica(苏木亚科(subfamilyCaesalpinioideae)，豆科(family Fabaceae))，是一种常见的林木，可能起源于热带非洲，广泛种植于热带和亚热带的干旱地区(主要是南亚和东亚、南美、地中海)，主要在印度、缅甸、孟加拉国和斯里兰卡。罗望子形成不开裂的豆类果实，10-15厘米长的豆荚，内含种子，种子由约55％的果肉、34％的种子(含65％的木葡聚糖多糖)和11％的壳和纤维组成。罗望子种子是口香糖的商业来源，并已发现包括食物在内的许多商业应用。1988年，仅印度一年就生产了300.000吨罗望子(Kumar and Bhattacharya,2008)，其分别转化为约100.000吨罗望子种子和超过66.000吨木葡聚糖。

在本发明的一优选实施方案中，表现出木葡聚糖酶活性的酶为内切葡聚糖酶。更优选地，所述内切葡聚糖酶具有50℃以上的活性谱。其优点为木葡聚糖多糖(诸如罗望子多糖)被有效地水解以产生包含DP7、DP8和DP9寡糖的寡糖混合物。高温的其他优点为木葡聚糖源的溶解度提高，并且避免了微生物污染。

木葡聚糖是一种由β-葡聚糖主链组成的多糖，该主链由纤维四糖单元(四个β-1,4-连接的D-吡喃葡萄糖残基)组成，因此，从糖链的非还原端看，前三个糖苷残基在C6位通过糖苷键与α-D-吡喃木糖苷(xylopyranosidic)残基的C1位连接。第二和/或第三木糖残基可再次在C2位与β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranosidic)残基的C1位连接。第四个糖苷残基未修饰。

罗望子木葡聚糖的水解产生寡糖DP7：XXXG，DP8：XXLG和XLXG以及DP9：XLLG，其中G表示未修饰的主链葡萄糖残基，X表示被木糖修饰的主链葡萄糖残基，以及L表示被木糖和半乳糖修饰的主链葡萄糖残基；字母代码命名规则根据Fry et al.(1993)，如图1所总结。在某些情况下，罗望子木葡聚糖中很少见而其他植物来源的木葡聚糖中则更常见的是，侧链略有不同，并可能会产生与图1中所述的那些不同的产物：在大多数情况下，在第三个葡萄糖残基上，每个四聚体中的木糖残基之一可能会丢失，从而导致所得寡糖的组成有所不同，其取决于分裂酶的水解偏好；半乳糖苷残基可被α-L-呋喃阿拉伯糖苷(arabinofuranosidic)残基代替，或者进一步用不同的糖残基(诸如另一个半乳糖苷残基或L-吡喃岩藻糖苷(fucopyranosidic)残基)修饰；主链糖苷残基也可用α-L-呋喃阿拉伯糖苷(arabinofuranosidic)残基代替木糖进行修饰；木糖残基也可以以β-构型连接。通常，糖残基是O-乙酰化的。此外，在罗望子木葡聚糖和其他来源的木葡聚糖中很少出现的是，三个木糖修饰的葡萄糖主链残基之一可在C2位修饰，另外还修饰了α-L-阿拉伯糖苷残基(Vincken et al.,1996)。

木葡聚糖水解的酶很少；然而，水解是通过具有不同切割特异性的多种酶类型进行的，几乎所有酶都在未修饰的糖苷残基的还原端。木葡聚糖中的侧链在一定程度上保护该聚合物免于快速降解，这是由于环境中侧链切割活性的缺乏和每种不同侧链糖都需要独特的活性所致。

木葡聚糖聚合物内的糖苷糖键可以被某些水解酶类切割。这种酶称为水解酶，通过在反应中添加水分子来切割糖苷键，该反应可以写为：A–B+H₂O→A–OH+B–H，其中A和B为糖分子。这些水解酶类对所涉及的糖的类型和键的类型而言是特异的，从而两个葡萄糖分子之间的β-1,4-键被具有β-1,4-葡聚糖酶活性的酶切割。当该酶以统计学方式将一个长聚合分子(诸如存在于木葡聚糖的主链中)内的任何β-1,4-糖苷键切割时，该酶称为内切葡聚糖酶(例如一种纤维素酶)。内切葡聚糖酶通常仅在聚合物中两个或多个连续的葡萄糖残基未被取代时才具有活性(诸如在纤维素中)。然而，仅罗望子木葡聚糖主链的每第4个残基未被取代，因此大多数内切葡聚糖酶(例如大多数商业纤维素酶制备物中的那些)对罗望子木葡聚糖无活性。那些对罗望子木葡聚糖具有活性的特殊内切葡聚糖酶(主要在糖苷水解酶家族GH5和GH9中)必须通过实验选择；这些酶降解未取代的糖苷残基任一侧的β-1,4-糖苷键，即使另一个葡萄糖残基被取代也是如此。另外，一些其他水解酶家族(例如GH12、GH16、GH44或GH74)中包含的特异性内切葡聚糖酶能够降解木葡聚糖。

除了对木葡聚糖的酶活性外，合适的酶即使在70％(wt/vol)或更高的高底物量时也能达到完全水解，从而导致高寡糖浓度，其特征在于有利的终产物抑制谱。Wong et al.,2010表征了GH5内切葡聚糖酶，其被XXXG寡糖线性非竞争性抑制，Ki为1.46±0.13mM。在包含GH5、GH9、GH12、GH16、GH44和GH74的GH家族中可以发现具有更合适的终产物抑制谱Ki为5mM或更高的酶。

在本发明方法的一优选实施方案中，木葡聚糖(诸如罗望子多糖)的高温转化为主要包含DP7-DP9寡糖的水解产物是通过选自细菌或真菌来源的水解外酶的内切葡聚糖酶的作用来完成的。酶促水解可以在含有宽范围多糖浓度的罗望子多糖的水溶液中完成。因此，该反应可以通过将罗望子多糖溶解于水溶液中进行，其浓度为约1重量％至仅受多糖溶解度和溶液粘度限制的浓度。

合适的内切葡聚糖酶可以选自各种各样的细菌和真菌来源。其也可衍生自宏基因组DNA。将选定的内切葡聚糖酶的基因克隆至合适的测试表达系统中，并在其中表达，该测试表达系统包含大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌种(Bacillus sp.)和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。然后针对所需的罗望子多糖水解对各个酶进行测试，从而产生(优选)DP7-DP9寡糖。优选的内切葡聚糖酶基因优选从得自嗜热微生物的DNA或宏基因组DNA中选择和分离。嗜热微生物是在42℃以上具有最佳生长范围的微生物(Lengeler et al.)。这些基因包括来自细菌的组的热稳定酶，这些细菌包含以下细菌属：热酸菌属(Acidothermus)，热解纤维素果汁杆菌属(Caldicellulosiruptor)，暖发菌属(Caldithrix)，梭菌属(Clostridium)，异常球菌属(Deinococcus)，Herbinix，Herbivorax，Ignavibacterium，Lachnoclostridium，亚栖热菌属(Meiothermus)，红嗜热盐菌属(Rhodothermus)，热厌氧单胞菌属(Thermanaeromonas)，Thermanaerovibrio，高温厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)，热杆菌属(Thermobacillus)，高温双岐菌属(Thermobifida)，嗜热双孢菌属(Thermobispora)，高温单孢菌属(Thermomonospora)，Thermosediminibacter和热袍菌属(Thermotoga)。

在许多情况下，衍生自嗜常温菌的细胞外产生的酶甚至在高温也可具有高稳定性，并且潜在地适合用于本发明的方法。因此，选择合适的内切葡聚糖酶的另一种方法为选择衍生自嗜常温或嗜冷微生物的酶。嗜常温微生物在20至42℃的温度生长最佳，而嗜冷微生物在20℃以下的温度生长(Lengeler et al.)。这种内切葡聚糖酶应包含在本发明中。

此外，可以通过遗传工程将内切葡聚糖酶(例如衍生自嗜常温细菌的内切葡聚糖酶)的酶活性向更高的温度改善。因此，选择合适的内切葡聚糖酶的另一种方法为选择衍生自嗜常温或甚至嗜冷微生物的酶，并通过遗传工程改善其对更高温度的酶活性。这种内切葡聚糖酶应包含在本发明中。

属于GH家族5、9、12、16、44或74的内切葡聚糖酶可衍生自嗜常温或嗜冷微生物，诸如属于包含以下属的组的嗜常温或嗜冷细菌：Acaryochloris，醋弧菌属(Acetivibrio)，厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)，产酸丙酸杆菌属(Acidipropionibacterium)，酸杆菌属(Acidobacterium)，异壁放线菌属(Actinoalloteichus)，游动放线菌属(Actinoplanes)，多态放线菌属(Actinopolymorpha)，束丝放线菌属(Actinosynnema)，气单胞菌属(Aeromonas)，农杆菌属(Agrobacterium)，土壤球菌属(Agrococcus)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，噬冷菌属(Algoriphagus)，脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)，别弧菌属(Aliivibrio)，另枝菌属(Alistipes)，嗜碱菌属(Alkaliphilus)，Alkalitalea，Allokutzneria，交替赤杆菌属(Altererythrobacter)，交替单胞菌属(Alteromonas)，双芽孢杆菌属(Amphibacillus)，无枝酸菌属(Amycolatopsis)，鱼腥藻属(Anabaena)，厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)，产液菌属(Aquiflexum)，Arachidicoccus，原囊菌属(Archangium)，装甲菌门(Armatimonadetes)，Arsenicicoccus，节杆菌属(Arthrobacter)，节旋藻属(Arthrospira)，不粘柄菌属(Asticcacaulis)，Auraticoccus，气单胞菌属(Aureimonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，拟杆菌属(Bacteroides)，Barnesiella，蛭弧菌属(Bdellovibrio)，获山氏菌属(Beutenbergia)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，芽绿菌属(Blastochloris)，芽球菌属(Blastococcus)，布劳特氏菌属(Blautia)，包西氏菌属(Bosea)，慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)，短波单胞菌属(Brevundimonas)，布鲁氏菌属(Brucella)，伯克氏菌属(Burkholderia)，丁酸弧菌属(Butyrivibrio)，眉藻属(Calothrix)，细链孢菌属(Catenulispora)，柄杆菌属(Caulobacter)，西地西菌属(Cedecea)，纤维素单胞菌属(Cellulomonas)，噬纤维菌属(Cellulophaga)，Cellulosilyticum，Cellulosimicrobium，纤维弧菌属(Cellvibrio)，管孢藻属(Chamaesiphon)，Chitinophaga，绿屈挠菌属(Chloroflexus)，Chondrocystis，色杆菌属(Chromobacterium)，Chthonomonas，棒形杆菌属(Clavibacter)，梭菌属(Clostridium)，Cnuibacter，山冈单胞菌属(Collimonas)，科尔韦尔氏菌属(Colwellia)，康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)，粪球菌属(Coprococcus)，珊瑚球菌属(Corallococcus)，发毛针藻属(Crinalium)，正黄球菌属(Croceicoccus)，短小杆菌属(Curtobacterium)，蓝菌属(Cyanobium)，蓝丝菌属(Cyanothece)，圆杆菌属(Cyclobacterium)，筒孢藻属(Cylindrospermum)，噬细胞菌属(Cytophaga)，脱卤素杆菌属(Dehalobacter)，脱卤单胞菌属(Dehalogenimonas)，脱硫盐菌属(Desulfohalobium)，脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，迪基氏菌属(Dickeya)，网团菌属(Dictyoglomus)，Draconibacterium，成对杆菌属(Dyadobacter)，戴氏菌属(Dyella)，Echinicola，Emticicia，剑菌属(Ensifer)，肠杆菌属(Enterobacter)，埃希氏杆菌属(Escherichia)，优杆菌属(Eubacterium)，Fermentimonas，Fibrella，噬纤维菌属(Fibrisoma)，纤维杆菌属(Fibrobacter)，Filimonas，菌毛单孢菌属(Fimbriimonas)，Flammeovirga，黄色土源菌属(Flavisolibacter)，黄杆菌属(Flavobacterium)，Formosa，弗兰克氏菌属(Frankia)，夫列藻属(Fremyella)，叶居菌属(Frondihabitans)，Fuerstia，梭杆菌属(Fusobacterium)，盖丝藻属(Geitlerinema)，芽单胞菌属(Gemmatimonas)，Gemmatirosa，Glaciecola，粘杆菌属(Gloeobacter)，粘球藻属(Gloeocapsa)，谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)，戈登氏菌属(Gordonia)，革兰菌属(Gramella)，Granulicella，颗粒状球菌属(Granulosicoccus)，格里蒙菌属(Grimontia)，Gynuella，河氏菌属(Hahella)，束缚杆菌属(Haliscomenobacter)，盐红螺菌属(Halorhodospira)，滑柱菌属(Herpetosiphon)，Hirschia，Hoeflea，Hoyosella，薄层菌属(Hymenobacter)，生丝微菌属(Hyphomicrobium)，白蚁菌属(Isoptericola)，浮霉菌属(Isosphaera)，紫色杆菌属(Janthinobacterium)，Jeongeupia，姜氏菌属(Jiangella)，琼斯氏菌属(Jonesia)，拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)，动球菌属(Kineococcus)，Kiritimatiella，北里孢菌属(Kitasatospora)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，韩国生工菌属(Kribbella)，Kutzneria，Labilithrix，湖菌属(Lacimicrobium)，乳球菌属(Lactococcus)，Lacunisphaera，Leadbetterella，赖氏细菌属(Leifsonia)，伦茨氏菌属(Lentzea)，细鞘丝藻属(Leptolyngbya)，纤毛菌属(Leptotrichia)，李斯特菌属(Listeria)，泞杆菌属(Lutibacter)，溶杆菌属(Lysobacter)，Mahella，海洋杆菌属(Maribacter)，Maricaulis，Marmoricola，巨单胞菌属(Megamonas)，Melioribacter，中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，细杆菌属(Microbacterium)，产微球茎菌属(Microbulbifer)，微鞘藻属(Microcoleus)，小月菌属(Microlunatus)，小单孢菌属(Micromonospora)，Minicystis，松江菌属(Mitsuaria)，Moorea，Mucilaginibacter，分支杆菌属(Mycobacterium)，粘球菌(Myxobacter)，粘球菌属(Myxococcus)，Nakamurella，Niabella，Niastella，Nitrospirillum，拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)，野野村菌属(Nonomuraea)，念珠藻属(Nostoc)，新鞘脂菌属(Novosphingobium)，苍白杆菌属(Ochrobactrum)，颤藻属(Oscillatoria)，Paenarthrobacter，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，Paludibacter，Paludisphaera，潘多拉菌属(Pandoraea)，泛菌属(Pantoea)，Parabacteroides，Paraoerskovia，果胶杆菌属(Pectobacterium)，片球菌属(Pediococcus)，地杆菌属(Pedobacter)，Pelosinus，Peptoclostridium，嗜胨菌属(Peptoniphilus)，Phaeobacter，发光杆菌属(Photobacterium)，Phycisphaera，浮霉状菌属(Planctomyces)，植物杆菌属(Plantibacter)，Plautia，邻单胞菌属(Plesiomonas)，极地杆菌属(Polaribacter)，多囊菌属(Polyangium)，Pontibacter，普氏菌属(Prevotella)，蛋白杆菌属(Proteiniphilum)，假节杆菌属(Pseudarthrobacter)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)，假地杆菌属(Pseudopedobacter)，假丙酸杆菌属(Pseudopropionibacterium)，假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)，冷弯菌属(Psychroflexus)，劳尔氏菌属(Ralstonia)，拉乌尔菌属(Raoultella)，根瘤菌属(Rhizobium)，红杆菌属(Rhodobacter)，红球菌属(Rhodococcus)，小红卵菌属(Rhodovulum)，胶须藻属(Rivularia)，玫瑰色半光合菌属(Roseateles)，罗氏菌属(Roseburia)，鲁杰氏菌属(Ruegeria)，Rufibacter，瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus)，古字状菌属(Runella)，Saccharophagus，糖丝菌属(Saccharothrix)，需盐杆菌属(Salegentibacter)，盐孢菌属(Salinispora)，血杆菌属(Sanguibacter)，伪枝藻属(Scytonema)，Sediminispirochaeta，月形单胞菌属(Selenomonas)，希瓦氏菌属(Shewanella)，Shinella，Siansivirga，Simiduia，中华单胞菌属(Sinomonas)，中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，Solitalea，堆囊菌属(Sorangium)，Sphaerochaeta，鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)，鞘脂菌属(Sphingobium)，鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)，Sphingopyxis，螺旋体属(Spirochaeta)，螺状菌属(Spirosoma)，Stackebrandtia，斯塔尼尔氏菌属(Stanieria)，Starkeya，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，标桩菌属(Stigmatella)，链霉菌属(Streptomyces)，链孢子囊菌属(Streptosporangium)，聚球菌属(Synechococcus)，集胞藻属(Synechocystis)，互营单胞菌属(Syntrophomonas)，坦纳菌属(Tannerella)，船蛆杆菌(Teredinibacter)，Terriglobus，Thioclava，Thiolapillus，密螺旋体属(Treponema)，疣孢菌属(Verrucosispora)，弧菌属(Vibrio)，黄单胞菌属(Xanthomonas)，王祖农菌属(Zunongwangia)和包含和/或表达GH9、GH12、GH16、GH44或GH74家族的细菌内切葡聚糖酶基因的任何其他属。

或者，属于GH家族5、9、12、16、44或74的内切葡聚糖酶可衍生自真核细胞或生物的组，诸如属于包含以下的真核属的组的真核细胞或生物：Adineta，伞菌属(Agaricus)，葱属(Allium)，链格孢属(Alternaria)，白蚁属(Amitermes)，瓶螺属(Ampullaria)，无兵蚁属(Anoplotermes)，雨虎属(Aplysia)，拟南芥属(Arabidopsis)，Aretaon，节丛孢属(Arthrobotrys)，北美箭竹属(Arundinaria)，曲霉属(Aspergillus)，牧笛竹属(Aulonemia)，Australoplax，Austrothelphusa，Austruca，燕麦属(Avena)，刺竹属(Bambusa)，Bankia，环棱螺属(Bellamya)，贝格竹属(Bergbambos)，桦木属(Betula)，双脐螺属(Biomphalaria)，葡萄孢属(Botrytis)，短颖草属(Brachyelytrum)，芸苔属(Brassica)，伊里安竺属(Buergersiochloa)，山茶属(Camellia)，荠属(Capsella)，辣椒属(Capsicum)，蒺藜草属(Cenchrus)，扁柏属(Chamaecyparis)，红鳌螯虾属(Cherax)，香竹属(Chimonocalamus)，金孢属(Chrysosporium)，丘斯夸竹属(Chusquea)，柑橘属(Citrus)，陆寄居蟹属(Coenobita)，芋属(Colocasia)，Constrictotermes，家白蚁属(Coptotermes)，蚬属(Corbicula)，隐尾蠊属(Cryptocercus)，隐球酵母属(Cryptococcus)，黄瓜属(Cucumis)，石斛兰属(Dendrobium)，牡竹属(Dendrocalamus)，网柄菌属(Dictyostelium)，龙眼属(Dimocarpus)，柿属(Diospyros)，爱胜蚓属(Eisenia)，长肛竹节虫属(Entoria)，前毛虫属(Epidinium)，Euastacus，桉属(Eucalyptus)，大戟属(Euphorbia)，Eurycantha，Extatosoma，榕属(Ficus)，草莓属(Fragaria)，镰刀菌属(Fusarium)，地蟹属(Gecarcoidea)，地丝菌属(Geotrichum)，球白蚁属(Globitermes)，大豆属(Glycine)，树白蚁属(Glyptotermes)，棉属(Gossypium)，灰白蚁属(Grigiotermes)，瓜多竹属(Guadua)，鲍鱼属(Haliotis)，Heloecius，驼孢锈菌属(Hemileia)，橡胶树属(Hevea)，阴阳竹属(Hibanobambusa)，原白蚁属(Hodotermopsis)，大麦属(Hordeum)，须白蚁属(Hospitalitermes)，腐质霉属(Humicola)，肉座菌属(Hypocrea)，Ilyograpsus，莴苣属(Lactuca)，细粘囊孢属(Leptographium)，小球腔菌属(Leptosphaeria)，白环蘑属(Leucoagaricus)，横梗霉属(Lichtheimia)，百合属(Lilium)，蛀木水虱属(Limnoria)，百脉根属(Lotus)，大眼蟹属(Macrophthalmus)，大白蚁属(Macrotermes)，稻瘟病菌(Magnaporthe)，苹果属(Malus)，芒果属(Mangifera)，铁线子属(Manilkara)，澳白蚁属(Mastotermes)，Medauroidea，苜蓿属(Medicago)，瘤黑粉菌属(Melanopsichium)，梨竹属(Melocanna)，Mesocentrotus，锯白蚁属(Microcerotermes)，小白蚁属(Microtermes)，和尚蟹属(Mictyris)，虾夷扇贝属(Mizuhopecten)，微拟球藻属(Nannochloropsis)，象白蚁属(Nasutitermes)，新美鞭菌属(Neocallimastix)，新糠虾属(Neomysis)，新胀蟹属(Neosarmatium)，新白蚁属(Neotermes)，猪笼草属(Nepenthes)，脉孢菌属(Neurospora)，烟草属(Nicotiana)，褐飞虱属(Nilaparvata)，土白蚁属(Odontotermes)，住囊虫(Oikopleura)，独焰鲶属(Olyra)，稻属(Oryza)，墨西哥竹属(Otatea)，滇竹属(Oxytenanthera)，Panesthia，黍属(Panicum)，拟相手蟹属(Parasesarma)，青霉菌属(Penicillium)，近歪白蚁属(Pericapritermes)，围沙蚕属(Perinereis)，鳄梨属(Persea)，Peruphasma，层锈菌属(Phakopsora)，原毛平革菌属(Phanerochaete)，菜豆属(Phaseolus)，环毛蚓属(Pheretima)，毛竹属(Phyllostachys)，云杉属(Picea)，松属(Pinus)，瘤胃壶菌属(Piromyces)，豌豆属(Pisum)，大明竹属(Pleioblastus)，大明竹属(Pleioblastus)，大明竹属(Pleioblastus)，柄孢壳菌属(Podospora)，杨属(Populus)，杨属(Populus)，鼠妇属(Porcellio)，李属(Prunus)，假厚蟹属(Pseudohelice)，茶秆竹属(Pseudosasa)，梨属(Pyrus)，副枝(Ramulus)，萝卜属(Raphanus)，散白蚁属(Reticulitermes)，红酵母属(Rhodotorula)，Rhynchotermes，悬钩子属(Rubus)，甘蔗属(Saccharum)，木蠊属(Salganea)，柳属(Salix)，接骨木属(Sambucus)，赤竹属(Sasa)，思劳竹属(Schizostachyum)，核盘菌属(Sclerotinia)，业平竹属(Semiarundinaria)，Serendipita，Sesarmoides，海马齿属(Sesuvium)，狗尾草属(Setaria)，倭竹属(Shibataea)，蝇子草属(Silene)，华歪白蚁属(Sinocapritermes)，管虫属(Sipyloidea)，茄属(Solanum)，蜀黍(Sorghum)，圆球白蚁属(Sphaerotermes)，孢堆黑粉菌属(Sporisorium)，繁缕属(Stellaria)，Subulitermes，Sucrea，聚白蚁属(Syntermes)，油葫芦属(Teleogryllus)，可可属(Theobroma)，Thermothelomyces，梭孢壳属(Thielavia)，矮竹节虫(Timema)，拟谷盗属(Tribolium)，木霉属(Trichoderma)，小麦属(Triticum)，尾稃草属(Urochloa)，黑粉菌属(Ustilago)，豇豆属(Vigna)，葡萄属(Vitis)，Xanthophyllomyces，玉蜀黍属(Zea)和包含和/或表达GH5、GH9、GH12、GH16、GH44或GH74家族的真核内切葡聚糖酶基因的任何其他属。

迄今已知的包含内切葡聚糖酶基因的细菌和真核属在Carbohydrate-ActiveenZymes Database(CAZy)数据库(http://www.cazy.org)中列出。

为了鉴定和分离编码内切葡聚糖酶的DNA序列，可以使用生物信息学方法筛选任何基因组或宏基因组序列，以获得计算机内转录的阅读框，该阅读框具有相对于来自GH5、GH9、GH12、GH16、GH44或GH74家族的内切葡聚糖酶氨基酸序列的连续序列相似性。基础DNA序列可以使用合适的模板DNA通过PCR进行体外扩增，或合成。合成的DNA的密码子用法可适应于预期表达宿主的密码子用法。或者，基因组或宏基因组DNA通过本领域已知的方法片段化，在表达信号后以合适的方式连接到载体质粒中，转化至预期表达宿主中并在生长培养物中表达，或者在琼脂平板上的合适的固化培养基上划线后或在合适的液体培养基中的混合物中划线后。这些方法是本领域熟知的。可以通过多种方法筛选琼脂平板上的菌落的水解活性。这些方法包括但不限于将底物包括在琼脂培养基中，在细胞铺板之前在琼脂培养基顶部上的一层中，或在铺展在生长的菌落顶部上的覆盖琼脂中。该底物是可溶的或不溶的聚合物内切葡聚糖酶底物，其包含衍生化纤维素诸如羧甲基纤维素(CMC)，β-葡聚糖诸如大麦β-葡聚糖，木葡聚糖，或可溶或不可溶的生色底物诸如β-葡聚糖底物诸如偶氮-CM-纤维素、偶氮大麦β-葡聚糖和偶氮木葡聚糖。温育后，通过清除菌落周围的混浊或用染料(诸如Congo-red或荧光二苯乙烯或伞形酮衍生物)染色和脱色，聚合物底物的清除区(clearing zone)是可见的；温育后，通过溶解不溶物，显色底物的清除区、染色或荧光是可见的。

具有内切葡聚糖酶活性的液体培养物如下所述通过破碎细菌细胞并测量内切葡聚糖酶活性来鉴定。如本领域中已知的，显示活性的培养物中产生内切葡聚糖酶的细胞可能必须被划线用于单细胞分离。如所述重新检查分离的纯培养物的活性。通过本领域熟知的DNA分离和PCR扩增的方法，从鉴定的菌落或培养物中分离出内切葡聚糖酶的基因。

可以通过多种方法确定液体培养物中、培养上清液或酶溶液中内切葡聚糖酶活性的存在，下文列举了这些方法的实例。通过抗体基测定法(诸如ELISA或Western-Blot)，通过SDS-PAGE和考马斯蓝(Coomassie-Blue)或银染色法，或通过任何合适的方法测量蛋白质浓度来检测蛋白质。酶活性可以通过许多其他方法测定，诸如实施例2中所描述的，使用包含CMC、大麦-β-葡聚糖和木葡聚糖的内切葡聚糖酶的模型底物，或包含β-1,4-糖苷键的显色底物。

内切葡聚糖酶活性的特征在于在纤维素的β-葡聚糖分子内的内键上的非进行性(non-processive)水解。水解点统计地分布在底物分子的长度上。“非进行性”是指该酶的下一水解作用不是在相邻位置以连续的方式进行；酶从底物上掉下来并结合在同一分子或另一个分子的不同位置进行下一切割，从而在聚合物分子内的任何位置产生新的切割。内切葡聚糖水解活性，也称为内模(endo-mode)纤维素酶活性，可以通过使用包含β-1,4-葡聚糖键的可溶性聚合物诸如混合键合的β-葡聚糖(例如大麦或地衣中的β-1,3-1,4-葡聚糖)或化学改性的纤维素(诸如羟乙基纤维素或羧甲基纤维素(HEC，CMC)的方法测定。下文描述了这种方法的实例。

酶活性可以通过还原末端的增加，即通过产生新的C1-糖末端，还原半缩醛基团来定量测定。这些可以通过将显色的3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸来定量，可以通过在540nm处的吸光度对其进行光度测量(Wood und Bhat 1988)。另一种方法可以为将通过添加β-1,4-葡糖苷酶产生的寡糖水解，并在ATP和NAD存在的情况下，使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在组合酶测定中定量测定所得的单体葡萄糖。在340nm下对还原的NAD(NADH+)进行光度定量。另一种测定法是将葡萄糖氧化酶与通过过氧化物酶或通过电化学测定所形成的过氧化氢的显色测定结合使用。诸如邻苯二胺的色原体可以用于光度检测。许多商业葡萄糖测定法(诸如GOD/POD)都可用于详细描述的这两种方法。

测定内切葡聚糖酶活性的另一种方法为减少粘性聚合物溶液，诸如从化学改性的纤维素(诸如HEC，CMC)或从包含β-1,4-糖苷键的可溶性β-葡聚糖(诸如大麦混合键-葡聚糖或地衣淀粉)减少粘性聚合物溶液。将CMC与粘度计一起使用是检测具有外切葡聚糖酶活性的混合物中特异性内切葡聚糖酶活性的优选方法。测定粘度随时间的降低。粘度的降低与纤维素酶活性成正比，并且是内切葡聚糖酶定量方法中最敏感的。但是，酶活性是相对的，不能以常规酶活性单位表达。

内切葡聚糖酶活性测定的又一种方法为从显色或荧光衍生的染色纤维素、纤维糊精和/或交联的纤维素衍生物或纤维糊精(诸如AZCL-HE-纤维素，偶氮-α-纤维素，偶氮-Avicel，RedCL-HE-纤维素，4,6-O-亚苄基-2-氯-4-硝基苯基-β-3,1-纤维三糖基-β-吡喃葡萄糖苷，4,6-O-(3-酮丁烯基)-4-硝基苯基-β-D-纤维五糖苷(cellopentaoside)或4,6-O-亚苄基-4-甲基伞形酮基-β-纤维三糖苷)中释放寡糖，如McCleary et al.(1980)或Manganet al.,(2016)所述。这种底物释放出染色的寡糖(该寡糖是可溶性的，有时通过添加一定浓度的乙醇使聚合物沉淀而区分)，或含发色团或荧光团的底物。酶促反应的可溶性产物可以通过光度法或荧光法测定。对于某些测定法，必须添加β-葡糖苷酶。许多商业内切葡聚糖酶测定法可用于详细描述的这种方法。

关于在高于50℃的温度的酶活性的增加的活性谱可以例如通过具有合适的产物分布的内切葡聚糖酶的诱变来实现。适当地，对衍生自嗜常温或嗜冷生物体的内切葡聚糖酶进行诱变。本领域技术人员知晓将突变引入酶中以优化酶特征的原理技术。示例性突变是将半胱氨酸残基引入氨基酸序列，其形成二硫桥以稳定酶抵抗热变性。在另一方面，可以通过随机的、定位诱变或定向进化来实现热稳定性，其中原始氨基酸序列的一个或几个氨基酸被不同于原始序列的氨基酸取代。在另一方面，可以进行原始氨基酸序列中氨基酸、环区或蛋白质结构域的缺失或插入，以增加酶的热稳定性。在另一方面，可以通过包封、酶的化学交联和添加增稳化合物来实现酶的热稳定。这种增稳化合物为例如BSA、甘油和山梨醇。稳定酶的其他方法为化学交联或任何其他方法，其导致高于50℃的合适酶活性。

因此，在一优选实施方案中，本发明方法中所用的具有高于50℃的酶活性的内切葡聚糖酶衍生自真核生物或微生物，诸如细菌或真菌，更优选为微生物，最优选为细菌。

在另一优选实施方案中，在本发明的方法中所用的具有高于50℃的酶活性的内切葡聚糖酶衍生自嗜热微生物，诸如嗜热细菌，或通过遗传工程热稳定。

根据本发明，“衍生”是指按照本领域技术人员熟知的标准技术从野生型生物体中分离出感兴趣的内切葡聚糖酶。“衍生”还包括在合适的宿主或宿主细胞中重组产生感兴趣的内切葡聚糖酶。

在一优选实施方案中，在高于50℃的温度具有酶活性的内切葡聚糖酶的特征在于等于或高于5mM的有利的寡糖终产物抑制常数(Ki)。内切葡聚糖酶可以在现有技术的生产宿主中生产。但是，除了目标内切葡聚糖酶之外，一些生产宿主还表达内源性酶，其可表现出不希望的内源性木葡聚糖酶酶活性。这种不希望的内源酶活性可能导致水解增强、不希望的水解副产物或不希望的寡糖的转糖基作用。增强的水解或转糖基作用可例如导致较小寡糖的量增加，单糖的量增加，寡糖分布更不均匀或寡糖分布不适当，从而降低了目标DP7-DP9 XGOS的产量。因此，建议测试生产宿主的适用性，以避免不希望的木葡聚糖降解或不希望的XGOS分布，其导致DP7-DP9产量降低。在本发明的一优选实施方案中，内切葡聚糖酶和生产宿主能够通过避免副产物的形成来使DP7-DP9 XGOS的产量最大化。对于工业XGOS生产，另外优选使用稳定且全面的内切葡聚糖酶生产方法。最优选地，本发明方法中所用的内切葡聚糖酶是在细菌宿主中重组产生的，该细菌宿主缺乏任何对寡糖(特别是DP7-DP9XGOS)表现出活性的内源酶。从而，可以有效地排除其他酶的不希望的副活性的污染。

一种优选的方法是在对DP7-DP9木葡聚糖寡糖缺乏任何进一步酶活性的细菌表达宿主系统中表达SEQ ID NO：1-4。

最优选的方法是在对DP7-DP9木葡聚糖寡糖缺乏任何进一步酶活性的细菌宿主系统中表达SEQ ID NO：2-4。

最优选的宿主细胞是分泌酶的原核细胞。原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。

革兰氏阳性细菌包括，但不限于，包含以下的属的组：芽孢杆菌属(Bacillus)，链球菌属(Streptococcus)，链霉菌属(Streptomyces)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，肠球菌属(Enterococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，梭菌属(Clostridium)，土芽孢杆菌属(Geobacillus)，大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和密切相关的细菌，诸如在16S rRNA基因中与上述属的16S rRNA基因具有>95％序列相同性的细菌。

革兰氏阴性细菌包括，但不限于以下属：埃希氏杆菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，螺杆菌属(Helicobacter)，黄杆菌属(Flavobacterium)，梭杆菌属(Fusobacterium)，Ilyobacteria，奈瑟氏菌属(Neisseria)，栖热菌属(Thermus)和尿素原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可为任何芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)或土芽孢杆菌属(Geobacillus)细胞。用于生产本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的合适的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞以及密切相关的物种，诸如在16S rRNA基因中与上述芽孢杆菌物种的16S rRNA基因具有>98％序列相同性的芽孢杆菌物种。

细菌宿主细胞也可为任何链球菌属(Streptococcus)细胞。用于生产本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的合适的链球菌属细胞包括，但不限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞也可为任何链霉菌属(Streptomyces)细胞。用于生产本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的合适的链霉菌属细胞包括，但不限于，不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)，阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)细胞。

细菌宿主细胞也可为任何棒杆菌属(Corynebacterium)细胞。用于生产本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的合适的棒杆菌属细胞包括，但不限于，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞。

细菌宿主细胞也可为任何埃希氏杆菌属(Escherichia)细胞。用于生产本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的合适的埃希氏杆菌属细胞包括，但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

宿主细胞也可为真核细胞，诸如哺乳动物，昆虫，植物或真菌细胞。

真菌宿主细胞可为酵母(yeast)细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))，产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于不完全菌纲(Fungi Imperfecti)的酵母(芽生菌目(Blastomycetes))。酵母宿主细胞的组包括，但不限于，假丝酵母(Candida)，汉逊酵母(Hansenula)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，毕赤酵母(Pichia)，酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母(Yarrowia)细胞。

在一优选实施方案中，酵母宿主细胞选自：卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)，道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)，克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)，诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一优选实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一优选实施方案中，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一优选方面，真菌宿主细胞为丝状真菌(filamentous fungal)细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth etal.,1995所定义)。丝状真菌的特征通常特征在于菌丝体壁由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成。营养生长通过菌丝伸长而发生，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而发生的，并且碳分解代谢可为发酵的。

在一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自：支顶孢属(Acremonium)，曲霉属(Aspergillus)，出芽短梗霉属(Aureobasidium)，烟管菌属(Bjerkandera)，拟蜡菌属(Ceriporiopsis)，金孢属(Chrysosporium)，鬼伞属(Coprinus)，革盖菌属(Coriolus)，隐球酵母属(Cryptococcus)，Filibasidium，镰刀菌属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，肉座菌属(Hypocrea)，稻瘟病菌(Magnaporthe)，毛霉属(Mucor)，毁丝霉属(Myceliophthora)，新美鞭菌属(Neocallimastix)，脉孢菌属(Neurospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，青霉菌属(Penicillium)，原毛平革菌属(Phanerochaete)，射脉菌属(Phlebia)，瘤胃壶菌属(Piromyces)，侧耳属(Pleurotus)，裂褶菌属(Schizophyllum)，篮状菌属(Talaromyces)，嗜热子囊菌属(Thermoascus)，梭孢壳属(Thielavia)，弯颈霉属(Tolypocladium)，栓菌属(Trametes)，或木霉属(Trichoderma)细胞。

在一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自：泡盛曲霉(Aspergillusawamori)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自：杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，禾谷镰孢菌(Fusarium cerealis)，克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)，黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)，异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)，合欢木镰孢(Fusarium negundi)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，多枝镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红镰孢(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，拟分枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)，硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)，茄腐镰刀菌(Fusariumtorulosum)，拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)或Fusarium venenatum细胞。在另一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自：Bjerkandera adusta，角孔拟蜡孔菌(Ceriporiopsis aneirina)，角孔拟蜡孔菌(Ceriporiopsis aneirina)，Ceriporiopsiscaregiea，浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)，潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)，Ceriporiopsis rivulosa，微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)，虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)，嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)，Chrysosporium lucknowense，热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)，Chrysosporiummerdarium，Chrysosporium inops，Chrysosporium pannicola，昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)，褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)，灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)，毛云芝菌(Coriolus hirsutus)，特异腐质霉(Humicolainsolens)，柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)，米黑毛霉(Mucor miehei)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，射脉侧菌(Phlebia radiata)，杏鲍菇(Pleurotus eryngii)，Thielavia terrestris，长绒毛栓菌(Trametes villosa)，变色栓菌(Trametes versicolor)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

在最优选的实施方案中，内切葡聚糖酶用于本发明的方法中，其中所述内切葡聚糖酶与具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽具有至少75％的序列相同性。

根据SEQ ID NO：1的内切葡聚糖酶分离自热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)。

在半纤维素降解活性最强的细菌中，从嗜热草料青贮饲料/牛粪沼气反应器中分离出Herbivorax saccincola SR1。其在45-65℃的温度生长，最佳温度为60℃，并发现其可以发酵木聚糖、木葡聚糖和结晶纤维素。Herbivorax saccincola被归类为Ruminococcaceae中的一个新科(Koeck et al.2016)。在细菌的基因组序列中，鉴定了属于GH家族5的序列(Pechtl et al.，待公开)。已将阅读框克隆至大肠杆菌中，并对表达和纯化的基因产物进行了表征。为了本发明的目的，已选择SEQ ID NO：2的内切葡聚糖酶作为合适的酶。因此，在一特别优选的实施方案中，本发明方法中所用的内切葡聚糖酶衍生自新分离的微生物Herbivorax saccincola DSM101079，且基本上由与新分离的SEQ ID NO：2的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成或由与新分离的SEQ ID NO：2的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成。

在另一特别优选的实施方案中，所述内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：4的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽、基本上由与SEQ ID NO：4的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成或由与SEQ ID NO：4的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成，其中在所述内切葡聚糖酶中缺失了dockerin结构域，这导致酶活性增加了7倍。通过缺失dockerin结构域，从SEQ ID NO：2的多肽适当地获得SEQ ID NO：4的多肽。

在另一特别优选的实施方案中，所述内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：3的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽、基本上由与SEQ ID NO：3的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成或由与SEQ ID NO：3的多肽具有至少75％氨基酸序列相同性的多肽组成，其中在所述内切葡聚糖酶中缺失了dockerin结构域，这导致酶活性增加了4倍。通过缺失dockerin结构域，从SEQ ID NO：1的多肽适当地获得SEQ ID NO：3的多肽。

在另一实施方案中，本发明的方法包含水解产物的进一步处理步骤。可以例如利用现有技术方法将水解产物处理以除去固体、盐和杂质。所得的寡糖溶液任选通过活性炭处理或任何其他现有脱色方法进行脱色。最后，纯化的寡糖混合物(其基本上包含DP7-DP9XGOS)可以通过冷冻或喷雾干燥或辊式干燥(roll-drying)进行干燥，以提供一种自由流动的粉末状多功能食物添加剂，可以将其配制并包装以进行分配，或将纯化的寡糖混合物以浓缩液体制剂的形式储存。DP7-DP9 XGOS的其余混合物可以以高水平部分代替加工食物的可代谢碳水化合物成分，而不会损害所得卡路里减少的食物的感官品质。重要的是，在食物产品中使用DP7-DP9 XGOS混合物还可以降低作为风味载体的脂肪含量，而不会影响风味强度。

根据本发明，利用罗望子胚乳多糖的高温和单酶水解来制备多功能食物添加剂。进一步根据本发明，使用在高于50℃的温度具有酶活性谱的内切葡聚糖酶，将罗望子多糖高产率地转化为食物级水解产物，据信该水解产物基本上包含DP7、DP8和DP9 XGOS。通常，内切葡聚糖酶在反应温度为50.5至约80℃，优选为55至75℃，更优选为55至70℃，最优选为55至65℃的范围内具有活性谱。

更优选地，在高于50℃的温度具有活性谱的内切葡聚糖酶选择性地水解罗望子多糖，以产生包含DP7、DP8和DP9 XGOS的寡糖混合物。通常，根据本发明的罗望子多糖的酶促水解持续进行，直到大部分木葡聚糖-多糖水解成DP7-DP9 XGOS。

在一优选实施方案中，在本发明的方法中所用的罗望子多糖底物的最终量等于或大于100g/L，200g/L，300g/L，400g/L，500g/L，600g/L，700g/L和750g/L。

在另一优选实施方案中，在本发明的方法中，相对于木葡聚糖底物，使用0.01％，0.05％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％或0.5％的内切葡聚糖酶。

在另一优选实施方案中，将多于25％，35％，45％，55％，65％和75％或更多的罗望子多糖底物水解以基本上产生DP7-DP9 XGOS。在本发明的上下文中，“基本上产生”是指作为水解产物中所有寡糖的级分的DP7-DP9XGOS的含量为至少50％或更高，优选60％或70％，更优选75％，最优选80％或更高。

进一步优选地，基本上产生DP7-DP9 XGOS的反应时间在72h至12h或更短的范围内，更优选为72h，或60h，48h或36h，最优选24h，12h或更短。

在本发明方法的最优选实施方案中，最终使用的木葡聚糖底物的量为500g/L或更高，酶的浓度低于0.05％，并且在不到24小时的时间内水解基本上产生至少65％的DP7-DP9XGOS。

在一最优选的实施方案中，根据本发明的从木葡聚糖源生产木葡聚糖-寡糖(XGOS)的方法包含以下步骤：

·将木葡聚糖在高于50℃的温度用内切葡聚糖酶酶促水解，该酶在高于50℃的温度表现木葡聚糖酶活性，

·除去固体，

·除去盐，

·除去其他杂质，

·任选地将水解产物脱色，

·通过例如冷冻或喷雾干燥或辊式干燥将水解产物干燥，或以浓缩液体制剂形式储存水解产物。

用于实现必要的罗望子多糖水解的内切葡聚糖酶的量取决于该内切葡聚糖酶的反应条件和活性水平。在最佳条件下，相对于罗望子多糖起始原料，内切葡聚糖酶可以低至0.005％wt/wt的量使用。通常，相对于罗望子多糖起始原料，适于产生水解产物的内切葡聚糖酶的浓度范围为0.005％至0.5％，优选0.01％至0.5％，更优选0.05％至0.5％wt/wt。相对于罗望子多糖起始原料，本发明方法中所用的内切葡聚糖酶的典型量为0.01％，0.05％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％或0.5％wt/wt。反应时间可根据所用的内切葡聚糖酶和水解条件而变化。典型的反应温度范围为50.5至约80℃，优选为55至75℃，更优选为55至70℃，最优选为55至65℃。

因此，在另一最优选的实施方案中，根据本发明的从木葡聚糖源生产木葡聚糖-寡糖(XGOS)的方法包含以下步骤：

·将罗望子多糖在50.5至80℃的温度范围内用内切葡聚糖酶进行酶促水解，该内切葡聚糖酶在50.5至80℃的温度范围内表现木葡聚糖酶活性；

·除去固体，

·除去盐，

·除去其他杂质，

·任选地将水解产物脱色，

·通过例如冷冻或喷雾干燥或辊式干燥将水解产物干燥，或以浓缩液体制剂形式储存水解产物。

在图2中显示了根据本发明的从木葡聚糖源生产木葡聚糖-寡糖(XGOS)的方法的实施方案的步骤。

具体实施方案

在本发明的一更具体的实施方案中，罗望子寡糖的水解可以如下进行：

将罗望子果仁粉(TKP)或脱脂TKP在50.5至70℃，优选50.5至65℃，更优选50.5至60℃的温度范围内，最优选51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃或60℃的温度溶于水或软化水中。TKP的最终浓度分别为1、10、20、30、40、50、60、75％(wt/vol)。通过在所需温度搅拌将TKP加入水中。溶解TKP的一个实例为一步添加TKP以达到最终TKP浓度，另一个实例为定期或连续添加TKP以达到最终TKP浓度。

酶可在水解开始时作为液体或干燥配制的可溶性酶加入。酶促水解的另一个实例为通过与基质结合来固定酶。在一个实例中，在添加TKP之前将酶溶解于液体中。在另一个实例中，将酶添加至溶解的TKP中。

另一个实例为将TKP定期添加到正在进行的TKP水解反应混合物中，以获得高TKP转化率和高产物浓度。

多糖水解反应的进程可以通过为此目的采用的标准分析技术进行监测。这些技术如薄层色谱(TLC)，高效液相色谱(HPLC)及其变体具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)，尺寸排阻色谱(SEC)，核磁共振(NMR)，具有激光诱导荧光检测的毛细管区带电泳(CZE-LIF)，具有飞行时间检测的基质辅助激光解吸电离(MALDI-TOF)以及液相色谱-质谱联用(LC-MS)。HPAEC-PAD可以用于研究本发明的寡糖。HPAEC-PAD特征在于特别高的特异性和灵敏的检测，以及寡糖分离的最高分辨率，并且在大多数情况下可用于产生本发明的结果。此外，HPAEC-PAD不需要预先衍生化，并且可以自动化进行。HPAEC-PAD在强碱性条件下运行。

可将预期以水解产物出现的分析物以适当的浓度溶于水中，以用作定量的参考标准。这些包括除了L-(+)-阿拉伯糖和D-(+)-甘露糖之外的单糖(可得自Sigma Aldrich,St.Louis,USA)，L-(+)-阿拉伯糖和D-(+)-甘露糖可以分别例如从Carl Roth GmbH&Co KG(Karlsruhe,Germany)和Serva Electrophoresis GmbH(Heidelberg,Germany)购得。半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸可以从Merck Millipore GmbH(Düsseldorf,Germany)和SigmaAldrich购得。除纤维二糖(C2)外，所有寡糖均可以从Megazyme(Bray,Ireland)购得，纤维二糖(C2)可以从Applichem GmbH(Gatersleben,Germany)购得。D-甘露醇可以用作内标(ISTD)，并可以从Sigma Aldrich购得。

为了通过HPAEC-PAD进行分析，可以使用Thermo Fisher Scientific(Waltham,USA)的ICS 3000Dionex色谱系统，该系统配备有CarboPac^TMPA1色谱柱(4x 250mm)和PA1-前置柱(4x 50mm)。该系统可以使用PEEK管(内径0.25mm)、GM-4梯度混合器(2mm)、具有0.25μL通道体积的ED电流分析池、pH-Ag/AgCl参比电极、0.002”垫圈和一次性金电极建立。在30℃的柱温，25μL的进样量，1mL/min的流速进行运行。用于分析物分离的合适的洗脱液梯度例如在0分钟用100mM NaOH和7.5mM乙酸钠(NaOAc)开始。后者可在67.5分钟时线性增加至100mM，同时保持100mM NaOH。为了洗涤色谱柱，在每次运行后，用100mM NaOH将NaOAc的浓度增加至650mM，持续4分钟，然后用100mM NaOH重新平衡，持续16.3分钟。使用PAD进行的碳水化合物检测基于波形“standard carbohydrate quad”(波形B)，其被设置为1或2Hz。在分析多糖水解产物之前，用双蒸馏水将样品稀释至XGOS最终浓度在10到200mg/l之间。降解产物可以通过与如上列出的寡糖标准品(每种10-200mg L^-1)进行比较来鉴定。

通过TLC对水解产物的分析可用于多个样品的平行快速分析。TLC可以例如使用Merck Millipore GmbH(Duesseldorf,Germany)的硅胶60板作为固定相以及乙腈-水8:2v/v作为流动相进行。为了染色，将板用5mL染色溶液(100mL丙酮，1g二苯胺，1mL苯胺)和0.5mL85％新鲜添加的磷酸喷雾。喷雾可以使用Sarstedt(Nürmbrecht,Germany)的DESAGAChromaJet DS20进行。随后，将板在120℃显影20分钟。对于每种分析物，每种水解产物和阴性对照的应用体积为例如4.5μL和1μL的1μg/μL原液。

可以通过离心、沉降或倾析从水解反应混合物中分离出包含DP7-DP9XGOS的水解产物。如果需要，可以通过将反应混合物加热至至少90℃，优选在约95℃至100℃之间的温度来使水解产物溶液中的蛋白质组分变性(＝失活)。然后可以通过沉淀、倾析或过滤从水解产物溶液中除去变性的蛋白质组分。上清液中残留的可溶性蛋白可以通过将水解产物溶液应用于常规过滤技术或使水解产物溶液与任何市售离子交换树脂接触而除去。例如，这可以通过用树脂浆化水解产物溶液并过滤，或使水解产物溶液通过装有离子交换树脂的柱子来实现。另一个步骤是用活性炭处理水解产物溶液，这对于处理水解产物溶液是合乎需要的，但并非总是必需的。这可以通过将活性炭(通常以等于溶解的水解产物的重量的约5％至20％的量)添加至水解产物溶液，加热水解产物溶液并且之后使水解产物溶液经过过滤步骤(优选地通过使用过滤助剂诸如硅藻土)来实现。这种处理有效地使水解产物溶液脱色并降低有机杂质的浓度。

可以使用标准碳水化合物分离技术，例如通过溶液干燥技术，优选冻干或喷雾干燥，或通过用溶质，更优选醇，最优选乙醇沉淀，然后过滤，从处理的水解产物溶液中分离粗碳水化合物水解产物，其中过滤可以包括膜过滤。这些步骤可具有额外的效果，诸如脱色和/或灭菌。水解产物寡糖的选择性短链醇沉淀可用于提供包含DP7-DP9 XGOS、基本由DP7-DP9XGOS组成或由DP7-DP9 XGOS组成的水解产物。此外，通过使用超滤或纳滤技术或通过使用(顺序)模拟移动床色谱法可以实现相同的结果。

反应后，可将水解产物寡糖(XGOS)与非多糖物质分离。物理分离的实例为沉降和过滤。分离可以通过自然沉降或沉淀，配备有纤维、织物或膜过滤器的切向流过滤，使用颗粒介质的过滤，快速过滤器或慢速砂过滤器，或多孔陶瓷过滤器进行。分离的其他实例是化学方法，例如凝结、絮凝和沉淀。

含XGOS的水解产物的纯化可通过用吸附剂(诸如粘土、木炭或活性炭)的吸附过程、用合成或有机聚合物树脂和螯合树脂的离子交换过程、用短链醇的溶剂沉淀、电渗析和干燥来实现。此外，在纯化步骤中可以使用包括微滤、超滤、纳滤、反渗透和利用合成膜的渗析的膜工艺。

产物XGOS混合物通常以干燥、自由流动的白色至奶油色粉末分离。或者，处理过的水解产物溶液或浓缩的DP7-DP9糖浆本身可以用作食物或饲料添加剂，用于将XGOS混合物直接引入加工食物配方中。

本发明的方法的优点在于，用内切葡聚糖酶处理的罗望子多糖可产生包含DP7至DP9 XGOS、基本上由DP7至DP9 XGOS组成或由DP7至DP9XGOS组成的产物。在一优选实施方案中，从理论上可获得的DP7-DP9XGOS寡糖的产率为至少50％或更高，优选60％或70％，更优选75％，最优选80％或更高。在另一实施方案中，所述产物(即用本发明的方法生产的XGOS混合物)中的单糖含量低于5％，优选低于4％或3％，更优选低于2％，最优选低于1％，例如0.9％，0.8％，0.7％，0.6％，0.5％或甚至更低。因此，本发明的方法是经济的，因为不需要进一步分离或去除小于DP7的寡糖或除去单糖。固体、盐和着色剂通过诸如色谱或吸附的既定技术进行分离和除去。

本发明还涉及可通过本发明的方法获得的含XGOS的水解产物，特别是涉及包含DP7-DP9 XGOS、基本包含DP7-DP9 XGOS或由DP7-DP9XGOS组成的含XGOS的水解产物。根据本发明的方法制备的XGOS混合物为无味的糖浆或粉末，取决于生产工艺。味道甜，没有明显的其他余味。根据本发明的方法制备的XGOS混合物对于酸降解和热是稳定的。此外，根据本发明的方法制备的XGOS混合物表现出体外代谢稳定性。

根据本发明，提供了一种制备XGOS混合物的方法，该混合物包含DP7-DP9 XGOS、基本上包含DP7-DP9 XGOS或由DP7-DP9 XGOS组成，该DP7-DP9 XGOS通过罗望子木葡聚糖多糖的高温酶促水解产生。已发现当用作加工食物的至少一部分可代谢碳水化合物组分的替代物时，产品罗望子水解产物表现出优越的食物功能特性。因此，在本发明的另一实施方案中，提供了一种加工食物产品，其中其正常代谢的甜味碳水化合物含量的至少一部分被本发明方法制备的XGOS混合物替代(substituted)或代替(replaced)，该XGOS混合物特别是由水解罗望子寡糖制备。通常，约1-2份，优选1-2份的本发明的XGOS混合物代替常规加工食物中每份可代谢碳水化合物。

用途

已经描述了分离的罗望子种子多糖的多种用途(参见Rao and Srivastava,1973)。该多糖具有在宽pH范围内与糖浓缩物形成胶冻的能力。其也已在食物中用作冰淇淋和蛋黄酱中的稳定剂。此外，纺织工业已使用罗望子多糖来对棉和人造丝进行上浆、整理和印花。在化妆品工业中，罗望子多糖已用于制备精油的乳液、剃须膏和洁牙剂。还发现其在压制丸剂和片剂的制造中用作粘合剂，在制备无油脂软膏剂中用作赋形剂，以及在胶体碘胶冻剂的制备中用作胶凝剂。

根据本发明，罗望子多糖水解产物可以用作加工食物的可代谢碳水化合物含量的功能替代品，以提供卡路里降低的加工食物产品。已发现，包含通过罗望子多糖的内切葡聚糖酶水解提供的DP7-DP9 XGOS的组合物可以替代加工食物中多达60％的可代谢碳水化合物，而不会不利地影响改性食物产品的感官品质。此外，在加工食物中使用这种寡糖组合物还可以减少脂肪含量，而对食物质量没有明显影响。更特别地，例如从WO 91/11112A1已知，当罗望子水解产物(DP7-DP9寡糖)替代加工食物组合物中的约10％至约40％的碳水化合物时，脂肪含量可以减少多达25％。因此，将罗望子水解产物用作加工食物中的碳水化合物替代品可显著降低卡路里含量。同样明显地，该水解产物具有比其它本领域公认的碳水化合物水解产物更均匀的组成(显著重量百分比的DP7-DP9 XGOS)，因此其功能性能在各种加工食物产品中高度可预测。用本发明的方法制备的罗望子多糖水解产物(其包含DP7-DP9XGOS、基本上由DP7-DP9 XGOS组成或由DP7-DP9XGOS组成)的另一个优点在于，其不同于本领域公认的食物添加剂胶，该多糖水解产物可以在加工食物中大量使用，而不会因其高粘度而对其加工产生不利影响。

用本发明方法生产的罗望子衍生的DP7-DP9 XGOS混合物可以根据本发明用于生产卡路里降低的食物产品，诸如糖果，口香糖，干蛋糕和饼干混合物(dry cake and cookiemixes)，冷冻乳制品甜点，奶油，营养棒，胶冻状甜点，布丁，烘焙食品和调羹调味料。此外，其可用作填充剂而不会显著增加面糊/产品粘度。已发现该混合物可快速溶于水，形成澄清、几乎无色的溶液。其可以用作合成甜味剂的无卡路里载体。当与合成甜味剂混合并添加至冰茶或热咖啡中时，产品立即溶解。此外，罗望子衍生的XGOS水解产物可以作为甜味增强剂。通过用水解产物替代原始饼干配方中需要的约10％至约40％的糖，可以制备高质量的烘焙饼干。在另一应用中，将罗望子衍生的XGOS水解产物与干奶固体组合以产生人造稀奶油(coffee whitener)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了用本发明的方法生产的XGOS混合物用于生产食物产品的用途，该XGOS混合物包含DP7至DP9 XGOS、基本上由DP7至DP9 XGOS组成或由DP7至DP9 XGOS组成。本发明还提供一种包含用本发明的方法生产的XGOS混合物的食物产品。

在另一实施方案中，本发明提供了用本发明的方法生产的XGOS混合物，其用于营养，例如用于减少食物中的卡路里或改善食物的质地。

在另一实施方案中，本发明提供了用本发明的方法生产的XGOS混合物，其用于人类健康益处，例如用于降低进餐后的血糖水平或作为饱腹剂。还考虑了用本发明的方法生产的XGOS混合物在治疗疾病的方法中的用途，诸如在治疗糖尿病的方法中的用途，所述方法包含将用本发明的方法生产的XGOS混合物施用于需要其的对象。还考虑了用本发明的方法生产的XGOS混合物在制备用于治疗疾病诸如糖尿病的药物中的用途。

用本发明的方法生产的XGOS混合物在动物营养方面也是有利的。因此，本发明提供了用本发明的方法生产的XGOS混合物，其用于动物营养和生产饲料产品。

该寡糖可用作人和/或动物营养中的益生元。因此，本发明提供了用本发明的方法生产的XGOS混合物，其用作益生元，诸如用于刺激肠道菌群。

术语“益生元”应理解为不可消化的、选择性发酵的食物成分，其会引起肠道菌群组成和/或活性发生特定变化，有益于宿主的健康和幸福(Gibson et al.,2004)。益生元尤其可以被认为是结肠的有利细菌诸如双歧杆菌和乳杆菌的食物(aliment)，其能够预防肠道疾病，增强矿物质的吸收，调节脂质代谢和/或刺激免疫系统。

由于已发现可以通过摄入食物成分来调节肠道菌群的平衡，所以已研究了名为“益生元”的许多候选物。大多数是植物来源的碳水化合物。最著名且特性更好的是果聚糖、果糖聚合物(其中通常是从菊苣块茎提取，也从龙舌兰中提取的菊粉)以及通过菊粉水解或通过蔗糖来源的果糖的生物合成而产生的果糖寡糖(FOS)。

其他寡糖也具有或多或少确定的益生元特性：半乳糖寡糖(GOS)或“反式半乳糖寡糖”(TOS)，与母乳中存在的化合物非常接近，大豆低聚糖(SOS)，异麦芽寡糖(IMOS)，乳果糖，棉子糖，木糖寡糖(XOS)等。

尽管已对充分表征的益生元(诸如FOS和GOS)以及大量候选分子进行了大量研究，但到目前为止，仍缺乏将以下特性与健康功能相结合的益生元，这些特性是(潜在的)食物和饮料生产商所追求的：简单且经济的生产方法，非常好的肠耐受性，允许使用足够的浓度以在实践中获得所需的结果，并且对加热过程和食物工业中广泛使用的常规酸性介质具有很高的稳定性。

现有的益生元仅用于有限数量的食物应用中(尤其是人源化乳)，且其浓度不能始终保证在体外/体内甚至临床研究中理论上可能的效果。

如本文所述，根据本发明的方法制备的XGOS混合物对于酸降解和热是稳定的。此外，根据本发明的方法制备的XGOS混合物表现出针对消化酶的体外代谢稳定性。此外，在科学文献中指示，木葡聚糖衍生的寡糖不是肠道微生物组的常见底物；但是相反，所述寡糖能特异性刺激嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和椭圆形拟杆菌(Bacteroidesovatus)(Hartemik et al.,1996)。Larsbrink et al.2014证明所选择的拟杆菌属(Bacteroides)的人类肠道细菌能够代谢木葡聚糖。除了难以证明对健康人有益的益生元作用外，寡糖在食物消耗后在消化和降低餐后血糖反应方面显示出积极作用。EFSA指出，包括FOS、GOS和其他不可代谢的寡糖在内的不可消化的碳水化合物可抵抗小肠中的水解和吸收。EFSA指出，根据有关肠功能的现有证据，EFFFA小组认为，成人每日摄入25克膳食纤维足以满足正常排便(EFSA Journal 2010；8(3):1462)。2014年，EFSA承认，与含糖食物/饮料相比，含寡糖的食物/饮料对减少餐后血糖反应和胰岛素反应具有健康益处。包括FOS和GOS在内的不可消化的碳水化合物对餐后血糖反应无贡献。该观点适用于不可消化的碳水化合物(例如非淀粉多糖、抗性寡糖和抗性淀粉)，这些碳水化合物应代替食物或饮料中的糖以达到要求的效果(EFSA Journal2014；12(10):3838以及EFSA Journal 2014；12(1):3513)。

其他潜在用途包含通过色谱法分离或纯化特定的寡糖或直接使用寡糖混合物。分离的寡糖物质可以进一步衍生化，例如，通过化学衍生化，并用作化合物生产的结构起始点，该化合物可以用作例如生物表面活性剂、气味活性物质、药物或塑料的结构化合物等、表面活性物质、生物活性物质等。

酶

本发明进一步提供了具有SEQ ID NO 1至4的推定氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段、类似物和衍生物。当提及SEQ ID NO 1至4的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指保留与木葡聚糖酶基本相同的生物学功能或活性的多肽。例如，类似物可包括原蛋白(proprotein)，其可通过切割原蛋白部分而活化以产生活性成熟蛋白。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。SEQ ID NO 1至4的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸)取代并且该取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的一种片段、衍生物或类似物，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基团的一种片段、衍生物或类似物，或(iii)其中另外的氨基酸与成熟蛋白融合的一种片段、衍生物或类似物，诸如前导序列或分泌序列，或用于纯化、或用于成熟多肽的底物或复合物结合的序列，或原蛋白序列。这些片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员根据本文的教导为基础所提供的范围内。

本发明的多肽包括SEQ ID NO 1至4的多肽，以及与SEQ ID NO 1至4的多肽具有至少75％的相似性(例如，优选至少50％；并且优选至少70％的相同性)，更优选地与SEQ IDNO 1至4的多肽具有至少85％的相似性(例如，优选至少70％的相同性)，并且最优选与SEQID NO 1至4的多肽具有至少95％的相似性(例如优选至少90％的相同性)的多肽。此外，它们应优选包括含有至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的序列的此类多肽的精确部分。

本发明的多肽的片段或部分可以用作通过肽合成产生相应全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或者部分可用于合成本发明的全长多核苷酸。

在一优选的实施方案中，所述多肽包含与选自SEQ ID NO 1至4的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽，基本上由与选自SEQ ID NO 1至4的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽组成，或由与选自SEQ ID NO 1至4的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽组成，并且表现木葡聚糖酶活性，特别是内切葡聚糖酶活性。

这种酶特别适用于根据本发明的方法处理罗望子多糖。本发明提供的多肽在高温，即在高于50℃的温度，仍表现出足够的内切葡聚糖酶活性以水解罗望子多糖。

本发明的方法和多肽的优点在于它们导致水解产物的产生，该水解产物包含DP7-DP9 XGOS，基本上由DP7-DP9 XGOS组成或由DP7-DP9XGOS组成，而没有显著量的副产物(诸如其他XGOS或单糖)。

本发明还涉及一种核酸分子，其包含编码根据本发明的多肽的核酸序列，特别是编码选自SEQ ID NO：1至4的氨基酸序列的核酸序列。在一优选实施方案中，编码根据本发明的多肽的核酸分子为包含SEQ ID NO：11至14之一、基本上由SEQ ID NO：11至14之一组成或由SEQ ID NO：11至14之一的序列组成的核酸分子。

本发明的“多核苷酸”或者“核酸”可以为RNA的形式或者DNA的形式；DNA应理解为包括cDNA、基因组DNA、重组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。由于遗传密码的冗余或简并性或单核苷酸多态性，编码该多肽的编码序列可以与SEQ ID NO:1至4所示的多肽的编码序列相同，或者可以是编码相同多肽的不同编码序列。例如，它也可以是RNA转录物，该转录物包括SEQ ID NO:1至4中任一个的多肽的编码序列的全长。

编码SEQ ID NO:1至4的多肽的核酸可以包括但不限于单独的多肽的编码序列；多肽的编码序列加上另外的编码序列，诸如前导或分泌序列或原蛋白序列；和多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)加上非编码序列，诸如内含子或该多肽的编码序列的非编码序列5'和/或3'。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”或术语“编码多肽的核酸”应理解为涵盖仅包含本发明的酶(例如选自SEQ ID NO:1至4的多肽)的编码序列的多核苷酸或核酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸或核酸。术语多核苷酸和核酸可互换地使用。

本发明还包括多核苷酸，其中多肽的编码序列可以在同一阅读框中与有助于从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合；例如，可以如此融合前导序列，该前导序列用作控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有这样的前导序列的多肽被称为前蛋白(preprotein)或前原蛋白(preproprotein)，并且可以具有被宿主细胞切割以形成该蛋白的成熟形式的前导序列。这些多核苷酸可具有5'延伸区，使得其编码原蛋白，该原蛋白是成熟蛋白加上在N末端处的另外的氨基酸残基。具有这种前序列(prosequence)的表达产物被称为原蛋白，它是成熟蛋白的无活性形式；然而，一旦前序列被切割，活性的成熟蛋白就会保留下来。另外的序列也可以连接到蛋白质并成为成熟蛋白的一部分。因此，例如，本发明的多核苷酸可编码多肽、或具有前序列的蛋白质、或具有前序列和导肽(presequence)(前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸还可以具有与标记序列在框内融合的编码序列，其允许纯化本发明的多肽。标记序列可以是亲和标签或表位标签，诸如聚组氨酸标签、链霉亲和素标签、Xpress标签、FLAG标签、纤维素或几丁质结合标签、谷胱甘肽S转移酶标签(GST)、血凝素(HA)标签、c-myc标签或V5标签。

HA标签将对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson,I.,等人，Cell,37:767(1984))，而c-myc标签可以是来自人Myc蛋白的表位(Evans,G.I.等人，Mol.Cell.Biol.5:3610-3616(1985))。

认为本发明进一步提供了与上述序列杂交的多核苷酸，其中序列之间具有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％的相同性或相似性，并因此编码具有相似生物活性的蛋白质。此外，如本领域中已知的，当氨基酸序列包含针对序列中每个单独残基的相同或保守的氨基酸取代物时，两个多肽之间存在“相似性”。可以使用序列分析软件(例如，ClustalW at PBIL(

Bioinformatique Lyonnais)http://npsa-pbil.ibcp.fr)测量相同性和相似性。本发明特别提供了这样的多核苷酸，其在严格条件下与上述多核苷酸杂交。

合适的严格条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度或通过杂交温度来定义，并且是本领域熟知的。特别地，可以通过降低盐的浓度，通过增加甲酰胺的浓度和/或通过提高杂交温度来提高严格性。

例如，在高严格性条件下的杂交可在约37℃至42℃采用约50％的甲酰胺，而在降低的严格性条件下的杂交可在约30℃至35℃采用约35％至25％的甲酰胺。在高严格性条件下杂交的一组特定条件采用42℃，50％甲酰胺，5x SSPE，0.3％SDS和200μg/mL切变和变性的鲑鱼精子DNA。对于在降低的严格性下的杂交，可以在35℃的降低温度在35％的甲酰胺中使用如上所述的类似条件。通过计算感兴趣的核酸的嘌呤与嘧啶比率并相应调节温度，可以进一步缩小与特定严格性水平相对应的温度范围。上述范围和条件的变化是本领域熟知的。优选地，仅当序列之间具有至少95％，更优选至少97％的相同性时才应发生杂交。在一个优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码表现出与SEQ ID NO:1至4的蛋白基本相同的生物学功能或活性的多肽。

如上所述，合适的多核苷酸探针可以具有至少14个碱基，优选地30个碱基，并且更优选地至少50个碱基，并如上所述，将与与其具有相同性的本发明的多核苷酸杂交，并且其可能或可能不保持活性。例如，这样的多核苷酸可用作与编码SEQ ID NO:1至4的多肽的多核苷酸分别杂交的探针，例如用于回收这样的多核苷酸，或用作诊断探针，或用作PCR引物。因此，本发明包括与编码SEQ ID NO:1至4的多肽的多核苷酸具有至少70％的相同性，优选至少90％的相同性，更优选至少95％的相同性的多核苷酸，及其片段，该片段优选具有至少30个碱基，更优选至少50个碱基，以及由这些多核苷酸编码的多肽。

如本文可互换使用的，术语“同源性”或“相同性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性，其中相同性是更严格的比较。短语“相同性或同源性百分比”和“相同性或同源性”是指在两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列的比较中发现的序列相似性的百分比。“序列相似性”是指两个或多个多核苷酸序列之间的碱基对序列(如通过任何合适的方法确定)的相似性百分比。两个或多个序列可以在0-100％相似的任何地方，或是其间的任何整数值。可以通过比较每个序列中为了比较目的而可以比对的位置来确定相同性或相似性。当所比较序列中的位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置相同。多核苷酸序列之间的相似性或相同性程度是多核苷酸序列共有的位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。

多肽序列的相同性程度是多肽序列共有的位置处的相同氨基酸的数目的函数。多肽序列的同源性或相似性程度是多肽序列共有的位置处的氨基酸数目的函数。如本文所用，术语“基本上相同”是指至少70％、75％、至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性或同源性。

序列相同性的程度是通过选择一个序列作为查询序列，并使用blastp算法(NCBI)将其与具有从GenBank获取的同源序列用基于互联网的工具ClustalW进行比对来确定的。

如本领域中熟知的，遗传密码是冗余的，因为某些氨基酸由超过一个的核苷酸三联体(密码子)编码，并且本发明包括使用与本文的序列中具体例示的密码子不同的密码子编码相同氨基酸的那些多核苷酸序列。这样的多核苷酸序列在本文中称为“等价”多核苷酸序列。本发明进一步包括上述多核苷酸的变体，其对片段进行编码，诸如SEQ ID NO 1至4的多肽的部分或全部蛋白质、类似物和衍生物。多核苷酸的变体形式可以是多核苷酸的天然等位基因变体或多核苷酸的非天然存在的变体。例如，核酸中的变体可以简单地是由遗传密码的简并性导致的氨基酸的密码子序列差异，或者可以存在缺失变体、取代变体以及添加或插入变体。如本领域已知，等位基因变体是多核苷酸序列的替代形式，其可以具有基本上不改变所编码多肽的生物学功能的一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加。

本发明还包括载体(其包括这样的多核苷酸)、用这样的载体进行遗传工程化的宿主细胞，以及通过使用前述的重组技术来生产SEQ ID NO:1至4的多肽。用这样的载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、接合质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。载体或基因可以在特定或未指定位点整合入染色体。用于重组DNA的基因组整合的方法，诸如同源重组或转座酶介导的整合，是本领域熟知的。可以在常规营养培养基中培养工程化的宿主细胞，所述常规营养培养基经修饰以适合于激活启动子，选择转化体或扩增本发明的基因。培养条件，诸如温度、pH等，是选择用于表达的宿主细胞通常所使用的那些条件，如本领域普通技术人员熟知的。

本发明的多核苷酸可用于通过重组技术产生SEQ ID NO:1至4的多肽。因此，例如，多核苷酸可以包含在多种表达载体中的任何一种中。

可通过各种操作将合适的DNA序列插入到载体中。通常，可以通过本领域已知的操作将DNA序列插入合适的(一个或多个)限制性酶切位点，该操作被认为在本领域技术人员的范围内。

表达载体中的DNA序列可操作地连接至合适的(一个或多个)表达控制序列(启动子)，以引导mRNA合成。作为此类启动子的代表性实例，可以提及：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac、ara、rha或trp，噬菌体λP sub L启动子和其他已知用以控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

更优选地，本发明的多肽可以使用以下工具表达：

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的具体实例为得自以下的启动子：大肠杆菌(E.coli)lac操纵子，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂水解酶(agarase)基因(dagA)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)xylA和xylB基因，以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。其他启动子描述于Scientific American,1980,242:74-94中的“Useful proteinsfrom recombinant bacteria”以及Sambrook et al.,1989，同上。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是得自以下各项的基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(spergillusnidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自编码黑曲霉(Aspergillus niger)中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子已经被编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子得自以下各项的基因：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)，以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，一种被宿主细胞识别而终止转录的序列。该终止子序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3'末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子得自以下各项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子得自以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的核苷酸序列的5'末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。

用于酵母宿主细胞的合适前导得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接到核苷酸序列的3'末端，并且在转录时，被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号的序列。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列得自以下各项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995,MolecularCellular Biology 15:5983-5990。

控制序列也可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端连接并指导编码多肽进入细胞的分泌途径的信号肽。核苷酸序列的编码序列的5'端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码分泌性多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'端可以包含相对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以将引导已表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌到培养基中)的任何信号肽编码序列用于本发明。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自以下各项的基因的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。Simonen和Palva，1993，以及Brockmeie等人，2006描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自以下各项的基因的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

酵母宿主细胞的有用信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他的有用的信号肽编码序列由上文提及的Romanos等人，1992描述。

控制序列也可以是编码位于多肽的氨基末端处的原肽(propeptide)的原肽编码序列。所得多肽已知为原酶或多肽原(或在一些情况下为酶原)。原肽通常是无活性的并且可以通过催化切割或自催化切割来自多肽原的原肽而转化为成熟的活性多肽。原肽编码序列可以得自以下各项的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶以及嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO 95/33836)。

在信号肽序列和原肽序列二者都存在于多肽的氨基末端的情况下，该原肽序列定位成紧邻多肽的氨基末端并且该信号肽序列定位成紧邻该原肽序列的氨基末端。

也可能期望的是加入调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。本文所述的各种核酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(几个)便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的核苷酸序列。可替代地，本发明的多核苷酸序列可以通过将核苷酸序列或包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体来表达。在产生该表达载体时，编码序列位于该载体中，使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是便利地经受重组DNA操作并且可引起核苷酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的(一个或多个)染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。

本发明的载体优选地包含一个或多个(几个)选择性标记，该标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等的基因(Kroll等人，2009-Establishment of a novelanabolism-based addiction system with an artificially introduced mevalonatepathway:Complete stabilization of plasmids as universal application in whitebiotechnology)。这些营养缺陷型包括但不限于在氨基酸生物合成中分别地破坏或缺失丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。营养缺陷表型与感兴趣的基因的表达盒一起是游离互补的。

细菌的选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、met3(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等价物。优选在曲霉属(Aspergillus)细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的(一个或多个)元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以包含指导在(一个或多个)染色体的(一个或多个)精确位置通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的附加核苷酸序列。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选包含足够数量的核酸，诸如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，且最优选800至10,000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列相同性以提高同源重组的可能性。该整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组。

为了自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177以及pACYC184，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991,Gene98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的超过一个拷贝插入宿主细胞以增加基因产物的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性物质的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此包含该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的操作是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989)。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其表达根据SEQ ID NO:1至4之一的多肽。更优选地，所述宿主细胞包含本发明的核苷酸分子，其编码SEQ ID NO:1至4的多肽。更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

本发明在进一步的实施方案中提供了一种产生SEQ ID NO:1至4的多肽的方法，该方法包括在允许产生酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞，并从培养物中回收酶。

产生方法

更优选地，本发明提供了产生本发明的多肽(即SEQ ID NO:1至4的多肽)的方法，包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养产生多肽的细胞；和(b)回收多肽。在一个优选的方面，所述细胞为芽孢杆菌(Bacillus)属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收多肽。

在本发明的产生方法中，在适于使用本领域熟知的方法产生多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中并在允许表达和/或分离多肽的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的操作在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若该多肽分泌到营养培养基中，则该多肽能够从所述培养基中直接回收。若该多肽不分泌至培养基中，则其可从细胞切割液回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于测定如本文中所述的多肽的活性。

所得多肽可使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规操作(包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从营养培养基中回收。

本发明的多肽可以通过本领域已知的各种操作纯化以获得基本上纯的多肽，该各种操作包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳操作(例如，制备型等电点聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,NewYork,1989)。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽(即SEQ ID NO:1至4的多肽)的组合物。优选地，组合物富集这种多肽。术语“富集”表示该组合物的内切葡聚糖酶活性已经提高，例如以至少1.1的富集系数提高。

多肽组合物可以根据本领域已知的方法来制备，并且可以是液体组合物或干燥组合物的形式。组合物中包含的多肽可根据本领域已知并且如以上所述的方来稳定化。

酶制备物

本发明进一步提供了一种包含SEQ ID NO:1至4的多肽的酶制备物，其用于本发明方法中的木葡聚糖多糖的水解。酶制备物优选为液体、粒状或团聚粉末的形式，更优选为粒状或团聚粉末的形式。

粒状或团聚的粉末优选具有窄的粒度分布，其中超过95％(重量)的颗粒在25至500微米的范围内。

颗粒和团聚的粉末可以通过常规方法制备，例如，通过将酶喷到流化床制粒机中的载体上。载体可以由具有适当颗粒大小的颗粒核心组成。载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(诸如氯化钠或硫酸钠)、糖(诸如蔗糖或乳糖)、糖醇(诸如山梨糖醇)、淀粉、水稻、玉米粗粉或大豆。

通过以下附图和实施例进一步描述本发明，这些附图和实施例不应解释为限制本发明的范围。

本文中，

图1显示了罗望子木葡聚糖水解为寡糖DP7至DP9。内切葡聚糖酶可能水解的位点由剪刀符号指示。在XXXG、XXLG、XLXG和XLLG描述了寡糖的结构，其中G表示未修饰的主链葡萄糖残基，X表示被木糖修饰的主链葡萄糖残基，以及L表示被木糖和半乳糖修饰的主链葡萄糖残基；字母代码命名规则按照Fry et al,1993。

图2显示了由罗望子果仁粉生产含DP7-DP9 XGOS的水解产物的本发明方法的典型步骤。

图3显示了用本发明的方法生产的粉末形式的纯化的DP7-DP9 XGOS混合物的照片。

图4显示了所用的内切葡聚糖酶SEQ ID NO：3的活性谱，其取决于pH和温度。相对活性被确定为通过DNSA测定法从大麦β-葡聚糖产生还原糖。

图5分别显示了重组产生的SEQ ID NO：1、2、3和4的SDS-PAGE。将PageRulerPrestained Protein Ladder 10至18kDa(#26616，ThermoFisher Scientific)用作蛋白标准品。

图6分别显示了SEQ ID NO：1和3的相对酶活性。将SEQ ID NO：1的酶活性设定为100％。令人惊讶的是，与SEQ ID NO：1酶活性相比，SEQ ID NO：3酶活性增加了＞4倍。酶活性：通过DNSA测定法测定的每毫克酶从阿拉伯木聚糖中释放出的微摩尔还原糖。

图7分别显示了SEQ ID NO：2和4的相对酶活性。将SEQ ID NO：2的酶活性设定为100％。令人惊讶的是，与SEQ ID NO：1酶活性相比，SEQ ID NO：4酶活性增加了＞7倍。酶活性：通过DNSA测定法测定的每毫克酶从阿拉伯木聚糖中释放出的微摩尔还原糖。

图8显示了通过0.006％(wt/wt)的SEQ ID NO：3和0.03％(wt/wt dTKP)的酶SEQID NO：2从20％(wt/vol)dTKP中释放XGOS。酶促反应在60℃进行。对于SEQ ID NO：2，在24小时后完全水解，而对于SEQ ID NO：3，在24小时后达到80％以上。

图9显示了通过0.65％(wt/wt dTKP)的SEQ ID NO：3和20％的TKP底物从dTKP释放XGOS。酶促反应在60℃进行。dTKP含有65％(wt/wt)的木葡聚糖，其在1小时内被SEQ ID NO：3完全降解为XGOS DP7-9。

图10显示了用本发明的方法生产的XGOS混合物的水解稳定性：TKP20％(wt/vol)水解，用3％(wt/wt dTPK)SEQ ID NO：3，在60℃进行0-24小时，然后进行HPAEC-PAD分析。随后将HPAEC结果随时间转换为寡糖比率(DP7-DP9)。

图11显示了本发明方法的高底物浓度(高达700g/L)的TKP水解：用0.05％的SEQID NO：3，进行0-72小时。水解度通过HPAEC-PAD分析确认。

实施例

实施例1：编码内切葡聚糖酶的SEQ ID NO:11-14的克隆以及SEQ ID NO:1-4的表达

用作缓冲剂和底物的所有化学品均为至少试剂级的商业产品。

SEQ ID NO：2的克隆：从在55℃用牛粪操作并进料玉米青贮料的20升发酵罐中分离出一种新的降解纤维素的细菌菌株，命名为Herivorax saccincola DSM101079。Herbivorax saccincola在Ruminococcaceae中被归类为一个新科(Koeck et al.2016)。为了对菌株Herbivorax saccincola DSM101079进行基因组测序，总共使用了4μg基因组DNA来构建8-k末端配对(mate-pair)测序文库(Nextera Mate Pair Sample PreparationKit，Illumina Inc.)，并使用Illumina MiSeq系统上的双末端方案对其进行测序。对GenDB中的Herbivorax saccincola DSM101079基因组序列进行分析和解释，并通过Carbohydrate-active-enzyme database dbCAN(Yin et al.,2012)揭示了100多个基因，这些基因预期将编码主要属于糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase，GH)和碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Module，CBM)不同家族的酶。SEQ ID NO：2被鉴定为糖苷水解酶家族5成员的编码序列。

编码内切葡聚糖酶的基因SEQ ID NO：11和12是由重组大肠杆菌(E.coli)菌株产生的。使用引物SEQ ID NO：5-10利用PCR扩增DNA，并使用Gibson Assembly(NEB,Cat.Nr.E2611S)在诱导型T7启动子的控制下将其克隆到NdeI/XhoI线性化的pET24c(+)载体(Novagen，MerckMillipore)中。对于SEQ ID NO：11，使用寡核苷酸引物(SEQ ID NO：5)和(SEQ ID NO：7)。使用寡核苷酸引物(SEQ ID NO：5)和(SEQ ID NO：6)扩增变体SEQ ID NO：13(SEQ ID NO：11的缩短变体)。对于SEQ ID NO：12DNA扩增，使用寡核苷酸引物(SEQ IDNO：8)和(SEQ ID NO：9)。使用寡核苷酸引物(SEQ ID NO：8)和(SEQ ID NO：10)扩增变体SEQID NO：14(SEQ ID NO：12的缩短变体)。转化化学感受态大肠杆菌(E.coli)DH10Β(Invitrogen，Fisher Scientific，Schwerte，Germany)。使用上述引物组合通过菌落PCR选择阳性克隆。对于SEQ ID NO：1-4蛋白表达，用各自的表达载体转化化学感受态大肠杆菌(E.coli)BL21 Star(DE3)(Invitrogen，Fisher Scientific，Schwerte，Germany)。

细胞生长

在受控的并配备有Biostat B Twin DCU(Sartorius AG，Gottingen,Germany)的10L Uni-Vessel中进行含有来自SEQ ID NO 1和3的热纤维梭菌ATCC27405/DSM1237的内切葡聚糖酶基因和Herbivorax saccincola DSM101079基因SEQ ID NO 2和4的重组大肠杆菌菌株的补料分批发酵。在发酵期间在线监测温度、pH、泡沫、浊度、重量和溶解氧。溶解氧(DO％)设定为25％(体积/体积)，并在增加搅拌和恒定气流的情况下保持。泡沫的形成是通过添加消泡剂206(Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)而控制的。通过添加25％(体积/体积)的氢氧化铵溶液和25％(体积/体积)的HPO₄溶液保持pH为6.9。将大肠杆菌菌株在以10L规模的Riesenberg培养基(Korz等人，1995)中培养，进料溶液由1021g/L甘油、20g/LMgSO₄·7H₂O、13mg/L EDTA、4mg/L CoCl₂·6H₂O、23.5mg/L MnCl₂·4H₂O、2.5mg/L CuC1₂·2H₂O、5mg/L H₃BO₃、4mg/L Na₂MoO₄ x 2H₂O、16mg/L Zn(CH3COO)₂·2H₂O、40mg/L柠檬酸Fe(III)组成(Korz等人，1995)。在消耗初始碳水化合物底物后，根据方程式1来控制生长速率，其中m_S是底物的质量流量(g h^-l)，μ_set为期望比生长速率(h^-l)，Y_X/S为生物质/底物收率系数(g g^-1)，m为比维持系数(g g^-1h^-l)，V为培养体积(L)，且X为生物质浓度(g L^-1)：

公式1

接种操作如下：基于冷冻原液，制备了含有足够抗生素的新鲜琼脂平板。利用一个菌落，在含有30mL Lysogeny培养液(Sambrook等人，1989)的锥形烧瓶中进行接种，并在30℃孵育12至15h。将30mL的该第一预培养物用于接种到5L锥形烧瓶中的500mL发酵培养基中，并另外孵育14小时。在10L发酵罐中装入6L发酵培养基，并接种500mL第二预培养物。以50μg/mL添加卡那霉素。通过将甘油进料改为乳糖进料来诱导蛋白质产生。通过在9000rpm和22℃离心1h而在48h后收获细胞。将300g细胞的部分溶于3L切割缓冲剂(50mM MOPS pH7.3、0.1M NaCl、20mM咪唑)中。细胞切割是通过在超声流经腔室中进行超声处理而实现的。通过离心(9000rpm，22℃)分离细胞碎片。通过应用0.2μm过滤盒进行切向过滤并用切割缓冲剂进行三体积洗涤，从残留的细胞或碎片中澄清上清液。通过用30kDa过滤盒进行切向过滤来浓缩酶溶液，然后用三体积的切割缓冲剂进行透析。将GH10木聚糖酶通过固定金属离子亲和色谱法(IMAC)纯化。用含有50mM MOPS pH 7.3、0.25M咪唑、0.1M NaCl和20mM CaCl₂的洗脱缓冲剂来洗脱纯酶。

通过使用12.5％凝胶(Bio-Rad Laboratories GmbH，Muenchen)和考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE监测蛋白质表达。将蛋白质重悬于变性缓冲剂中，并在95℃加热15分钟。将PageRuler Prestained Protein Ladder 10至180kDa(#26616，ThermoFisherScientific)用作分子量标准品。将蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色(Weber and Osbourne1969)。根据Laemmli(1970)进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过使用Pierce^TM BCA Protein Assay Kit(#23225，ThermoFisher Scientific)测定蛋白量。

产生本发明的内切葡聚糖酶SEQ ID NO：1-4的另一种可能性是是用含有DNA的合适载体转化感受态枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株，并根据Park et al.1991培养重组菌株。

实施例2：SEQ ID NO：1-4的表征

通过使用模型底物(诸如大麦-β-葡聚糖(Megazyme))来测定酶比活。内切葡聚糖酶活性定义为从模型底物产生还原糖。一单位酶活性定义为在60℃在一分钟内每毫克酶产生的微摩尔还原糖的量。为了确定酶谱和最佳温度和pH值，内切葡聚糖酶(50ng/反应)在50至80℃的温度范围内，在1％(wt/vol)大麦-β-葡聚糖存在的情况下温育30分钟，该大麦-β-葡聚糖溶解在具有不同pH(范围4.0-8.0)的柠檬酸盐缓冲剂中(溶液A：0.2M柠檬酸，0.1MNaCl；溶液B：0.4M Na₂HPO₄，0.1M NaCl)。通过3,5-二硝基水杨酸(DNSA)法测量还原糖：将50微升样品与75微升DNSA溶液(10g/L DNSA，200g/L K⁺-Na⁺-酒石酸盐，10g/L NaOH，0.5g/LNa₂SO₄，2g/L苯酚)在微量滴定板中混合，在95℃温育5分钟，在冰上冷却，并在540nm处测定吸收度。为了校准，使用0至2mg/mL的葡萄糖溶液。

SEQ ID NO：1-4的温度和pH谱显示出最佳温度为约60℃，最佳pH为5.5-7.5。作为一种代表性的酶，SEQ ID NO：3酶的活性谱示于图4，并证明了高于50℃的宽温度谱。其他SEQ ID NO：1、2和4显示相似的酶谱。如实施例2中所述，SEQ ID NO：11和12代表野生型基因。SEQ ID NO：13和14分别为SEQ ID NO：11和12的变体，其缺少dockerin模块，从而使总蛋白大小减少了约15％(图5)。出乎意料的是，与野生型蛋白SEQ ID NO：1和2相比，SEQ IDNO：3和4的酶比活增加了至少4.5倍(图6和7)。活性增加不能仅通过尺寸减小来解释。所有酶SEQ ID NO：1-4的特征在于酶活性均适合于在高于50℃的温度水解TKP，如图8中SEQ IDNO：2和3所示。

为了评估SEQ ID NO：1-4对TKP水解的适合性，测定了SEQ ID NO：3的Ki值。根据制造商的说明，在偶氮木葡聚糖(Azo-Xyloglucan)(Megazyme)上测量了酶活性。选择1-20g/l的底物浓度，并在木葡聚糖寡糖浓度增加的情况下测量酶活性。使用Lineweaver-Burk图评估抑制模式。使用非竞争性抑制模型，使用GraphPad Prism6对SEQ ID NO：3的实验数据进行非线性回归拟合，得出Ki值为16.75mM(±1.35)。

实施例3：TKP的水解

罗望子果仁粉(TKP)和脱油罗望子果仁粉(dTKP)购自Tamarind Magic，Hyderabad,Phase-IV,3rd Gate,IDA,Cherlapally,Hyderabad-500051,Telangana,India。TKP和dTKP均由约65％(wt/wt)木葡聚糖组成(https://www.altrafine.com/tamarind-kernel-powder/)。

对于XGOS释放，在60℃将20％(wt/vol)的8g TKP或dTKP溶解于40ml软化水中。以相对于底物负荷的3％，0.65％，0.05％，0.03％或0.006％(wt/wt TKP)的所需浓度添加酶。反应混合物在旋转摇床上以125rpm和60℃进行温育。通过在不同时间点取样来监测水解过程。将样品离心，并将上清液在95℃煮沸5分钟以使残留蛋白质变性。为了分析，取出上清液样品，用双去离子水稀释十倍并通过HPAEC-PAD测量。

实施例4：高达700g TKP/l的水解

在60℃将25g/L TKP溶解于软化水中。以相对于700g/L的最终底物负荷以0.05％的所需浓度添加酶。水解过程在配备有三段叶轮的2L搅拌釜反应器(Sartorius AG，

Germany)中在60℃、250至500rpm的搅拌下进行72h。将底物以25g/L/h的速率进料，直到达到最终底物负荷700g/l。为了进行过程监控，在不同时间点从反应器中取样。将样品离心，并将上清液在95℃煮沸5分钟以使残留蛋白质变性。如实施例5所述通过醇沉淀从上清液中分离5mL样品中的XGOS，并称重。为了分析，取出上清液样品，用双去离子水稀释并按照实施例7所述通过HPAEC-PAD进行测量。24小时后达到75％以上的水解度，并且通过将反应时间延长至72小时甚至进一步提高至80％以上。

实施例5：包括乙醇沉淀的XGOS纯化

为了获得纯XGOS粉末(图3)，通过离心分离来自实施例3和4的水解产物以分离TKP/dTKP的不溶性级分(9000rpm，20min，RT)。进一步使用不溶性级分的一个实例可为动物饲料中富含蛋白质的高脂肪基质。上清液首先通过微滤(切向过滤，0.2微米过滤盒)澄清，然后通过超滤(切向过滤，10kDa过滤盒)澄清。通过用乙醇浓度高达90％(vol/vol)的乙醇沉淀并在冰上温育1小时来除去残留的蛋白质、肽、脂肪酸或色素。通过离心除去沉淀物，并浓缩上清液，并通过旋转蒸发回收乙醇。沉淀物通过冷冻干燥、干燥器(desiccator)或喷雾干燥来干燥。

实施例6：无乙醇沉淀的XGOS纯化

为了获得纯XGOS粉末(图3)，通过离心分离来自实施例3的水解产物以分离TKP/dTKP的不溶性级分(9000rpm，20min，RT)。上清液首先通过微滤(切向过滤，0.2微米过滤盒)澄清，然后通过超滤(切向过滤，10kDa过滤盒)澄清。通过使用(顺序)模拟移动床色谱法或纳滤，可实现较大规模的DP7-DP9的浓缩。滤液或提取物通过冷冻干燥、干燥器或喷雾干燥来干燥。

实施例7：寡糖分析

为了通过HPAEC-PAD进行分析，使用Thermo Fisher Scientific(Waltham,USA)的ICS 3000Dionex色谱系统，该系统配备有CarboPac^TMPA1色谱柱(4x 250mm)和PA1-前置柱(4x 50mm)。该系统使用PEEK管(内径0.25mm)、GM-4梯度混合器(2mm)、具有0.25μL通道体积的ED电流分析池、pH-Ag/AgCl参比电极、0.002”垫圈和一次性金电极建立。在30℃的柱温，25μL的进样量，1mL/min的流速下进行运行。用于分析物分离的洗脱液梯度在0分钟用100mMNaOH和7.5mM乙酸钠(NaOAc)开始。后者在67.5分钟时线性增加至100mM，同时保持100mMNaOH。为了洗涤色谱柱，在每次运行后，用100mM NaOH将NaOAc的浓度增加至650mM，持续4分钟，然后用100mM NaOH重新平衡，持续16.3分钟。使用PAD进行的碳水化合物检测基于波形“standard carbohydrate quad”(波形B)，其被设置为2Hz。

在分析多糖水解产物之前，用双蒸馏水将样品稀释至XGOS最终浓度在10到200mg/l之间。降解产物通过与如上列出的寡糖标准品(每种10-200mg L^-1)进行比较来鉴定。

通过TLC对水解产物的分析用于多个样品的平行快速分析。TLC使用MerckMillipore GmbH(Düsseldorf，Germany)的硅胶60板作为固定相以及乙腈-水8:2v/v作为流动相进行。为了染色，将板用5mL染色溶液(100mL丙酮，1g二苯胺，1mL苯胺)和0.5mL 85％新鲜添加的磷酸喷雾。喷雾使用Sarstedt(Nürmbrecht,Germany)的DESAGA ChromaJet DS 20进行。随后，将板在120℃显影20分钟。对于每种分析物，每种水解产物和阴性对照的应用体积为4.5μL和1μL的1μg/μL原液。

使用Megazyme的0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L和0.05g/L的XGOS标准混合物进行定量。

结果：与现有技术(WO1991011112)相反，使用SEQ ID NO：3，在不到1小时的时间内通过0.65％(wt/wt TKP)使酶促TKP(20％wt/vol)水解达到最大DP7-DP9量(图9)。另一结果通过使用浓度低于0.03％(wt/wt TKP)的SEQ ID NO：2酶获得，该浓度足以在24小时内将TKP(20％wt/vol)完全水解为DP7-DP9寡糖(图8)。将SEQ ID NO：3酶浓度进一步降低至0.006％(wt/wt TKP)，获得在24小时内超过80％的充分水解(图8)。

实施例8：峰面积测定

根据实施例3，用3％(wt/wt TKP)SEQ ID NO：3将20％(wt/wt)TKP水解24小时。在15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，8小时和24小时之后取样，并使用实施例7中所述的HPAEC-PAD进行分析。针对DP7、DP8和DP9寡糖分别测定所产生的寡糖的峰面积(nC*min)，并测定每种寡糖的百分比。

结果：TKP完全水解后，DP7、DP8和DP9寡糖之间的比例是稳定的，并且不会随着反应时间的延长而变化。与现有技术(WO1991011112)相反，未观察到任何导致不需要的单糖或XGOS产量的损失的进一步的寡糖降解(图10)。即使使用非常高的酶浓度(3％)，并且在不到1小时的时间内就完成了TKP的完全水解，DP7、8和9寡糖之间的比例随时间稳定(图10)。

实施例9：单糖的检测

多糖木葡聚糖具有β1→4连接的葡萄糖残基的主链，其中大部分被1,6连接的木糖侧链取代。在许多情况下，木糖残基被半乳糖修饰。为了分析木葡聚糖进一步水解为单糖的可能性，专门分析了酶促水解后单体葡萄糖和半乳糖的含量。

如制造商(Megazyme，Ireland)所述，使用乳糖/D-半乳糖检测试剂盒测定XGOS粉末中的残余半乳糖。用Perkin Elmer Lambda 35UV/Vis分光光度计在340nm处进行测量。使用20％(wt/vol)的纯化的XGOS溶液测定半乳糖浓度，其中XGOS如实施例3所述生产，并如实施例6所述纯化，用0.05％SEQ ID NO：3。XGOS溶液中的半乳糖浓度是通过从用半乳糖制备的标准曲线中推断出半乳糖浓度来确定的。制备物中的表观半乳糖含量为72ppm。

如(Kovacevic et al.2014)所述，使用偶联酶测定法，用黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖氧化酶(VII型，Sigma Aldrich)和辣根过氧化物酶(VI型，Sigma Aldrich)来测定XGOS制备物中的残余葡萄糖。该测定在含有2mM ABTS、1.3U/mL葡萄糖氧化酶和0.5U/mL辣根过氧化物酶的0.1M乙酸钠缓冲剂(pH 5.5)中进行，使用20％(wt/vol)的纯化的XGOS溶液作为样品。在Tecan Sunrise酶标仪中追踪410nm处的吸光度变化。在20％(wt/vol)的纯化的XGOS溶液中未检测到葡萄糖。对照实验：通过将葡萄糖添加到相同的TKP溶液中，在20％(wt/vol)纯化的XGOS溶液中的最低可检测到的葡萄糖浓度被测定为54ppm。因此，XGOS制备物中的残余葡萄糖含量低于54ppm。

与现有技术(WO1991011112)相反，所描述的使用酶SEQ ID NO：1-4的水解过程不产生单糖。

实施例10：XGOS的代谢稳定性

使用集成的总膳食纤维测定试剂盒(Megazyme，Ireland)评估寡糖的代谢稳定性。如AOAC Method 2011.25中所述用酶消化XGOS样品，并且如实施例7中所述使用HPAEC-PAD在酶促处理后分析寡糖组成。木葡聚糖-寡糖可耐受猪胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的水解，使XGOS成为可溶性膳食纤维。

实施例11：水含量aW值

使用来自Novasina(Lachen，Switzerland)的Sprint的AW设备在25℃测定水活度(a_W值)。未经乙醇沉淀纯化的寡糖的水含量为0.311。包括乙醇沉淀制备的a_W XGOS值为0.327。

实施例12：XGOS对酸处理的稳定性

对于食物和饲料产品，酸稳定性是必要的。为了测试DP7–DP9 XGOS对酸的稳定性，将10％(wt/vol)XGOS溶解在水(pH 7.0)中，在37℃温育2小时，并与用10mM HCl(pH 2.0)处理并在相同条件下温育的相同量的XGOS进行对比。通过HPAEC-PAD进行分析。观察到在pH7.0和pH 2.0样品之间，寡糖组成无差异。

实施例13：XGOS对热的稳定性

对于制粒、挤出或巴氏灭菌过程，热稳定性是必要的。为了测试DP7–DP9 XGOS对热的稳定性，将10％(wt/vol)XGOS溶解在水(pH 7.0)中，在97℃温育10分钟，并与相同量的未处理XGOS进行对比。通过HPAEC-PAD进行分析。热处理后，观察到少量沉淀，这并不影响XGOS的溶解度。热处理未改变DP7-DP9 XGOS的组成，并且在热处理和未处理的样品中检出的XGOS量相同。未检测到单糖或二糖的增加。将10％(wt/vol)的XGOS溶液在121℃和2bar温育20分钟，超过80％的XGOS留在上清液中。XGOS的组成未改变。此外，单体级分未增加。

参考文献

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Scientific Opinion on the substantiation of a health claim related to

and a reduction of post-prandial glycaemic responses pursuant toArticle 13(5)of Regulation(EC)No 1924/2006.EFSA Journal 2014；12(10):3838.

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序列表

<110> 慕尼黑工业大学

<120> 制备木葡聚糖-寡糖的方法

<130> MTU106WO

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 608

<212> PRT

<213> Clostridium thermocellum

<400> 1

Ala Lys Ile Thr Glu Asn Tyr Gln Phe Asp Ser Arg Ile Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ser Ile Gly Phe Ile Pro Asn His Ser Lys Lys Ala Thr Ile Ala Ala

20 25 30

Asn Cys Ser Thr Phe Tyr Val Val Lys Glu Asp Gly Thr Ile Val Tyr

35 40 45

Thr Gly Thr Ala Thr Ser Met Phe Asp Asn Asp Thr Lys Glu Thr Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Val Tyr Glu Asp Ala Phe Lys Thr Ala Met Leu Gly Met Tyr Leu Leu

100 105 110

Arg Cys Gly Thr Ser Val Ser Ala Thr Tyr Asn Gly Ile His Tyr Ser

115 120 125

His Gly Pro Cys His Thr Asn Asp Ala Tyr Leu Asp Tyr Ile Asn Gly

130 135 140

Gln His Thr Lys Lys Asp Ser Thr Lys Gly Trp His Asp Ala Gly Asp

145 150 155 160

Tyr Asn Lys Tyr Val Val Asn Ala Gly Ile Thr Val Gly Ser Met Phe

165 170 175

Leu Ala Trp Glu His Phe Lys Asp Gln Leu Glu Pro Val Ala Leu Glu

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195 200 205

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210 215 220

Arg Val Ala His Lys Val Ser Thr Arg Asn Phe Gly Gly Phe Ile Met

225 230 235 240

Pro Glu Asn Glu His Asp Glu Arg Phe Phe Val Pro Trp Ser Ser Ala

245 250 255

Ala Thr Ala Asp Phe Val Ala Met Thr Ala Met Ala Ala Arg Ile Phe

260 265 270

Arg Pro Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Glu Lys Cys Ile Asn Ala Ala Lys

275 280 285

Val Ser Tyr Glu Phe Leu Lys Asn Asn Pro Ala Asn Val Phe Ala Asn

290 295 300

Gln Ser Gly Phe Ser Thr Gly Glu Tyr Ala Thr Val Ser Asp Ala Asp

305 310 315 320

Asp Arg Leu Trp Ala Ala Ala Glu Met Trp Glu Thr Leu Gly Asp Glu

325 330 335

Glu Tyr Leu Arg Asp Phe Glu Asn Arg Ala Ala Gln Phe Ser Lys Lys

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Ser Ile Lys Asp Ser Leu Leu Ser Thr Ala Asp Ser Ile Val Arg Thr

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Ser Gln Asn His Gly Tyr Gly Arg Thr Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Trp

405 410 415

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420 425 430

Asn Lys Ile Ser Pro Asn Asn Asp Tyr Val Asn Ala Ala Leu Asp Ala

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545 550 555 560

Arg Tyr Val Leu Lys Ala Val Ser Thr Leu Pro Ser Ser Lys Ala Glu

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<210> 2

<211> 433

<212> PRT

<213> Herbivorax saccincola

<400> 2

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Asn Glu Met Arg Ile Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Leu Asp Ala Ile

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Gly Gly Glu Thr Asn Trp Gly Asn Pro Lys Thr Thr Lys Glu Met Ile

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Asp Lys Val Lys Glu Met Gly Phe Asn Thr Val Arg Phe Pro Val Thr

50 55 60

Trp Gly Gly His Val Gly Pro Ala Pro Asp Tyr Lys Ile Asp Glu Gly

65 70 75 80

Trp Leu Asn Arg Val Glu Glu Val Val Asn Tyr Ala Leu Ser Asn Asp

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Met Tyr Ala Ile Ile Asn Leu His His Glu Asn Ser Trp Leu Val Pro

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Thr Tyr Ala Gln Glu Lys Arg Ser Thr Glu Gln Leu Val Lys Ile Trp

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Glu Thr Met Asn Glu Pro Arg Val Glu Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Pro Glu Asn Arg His Val Ile Asn Asn Phe Asn Leu Ala

165 170 175

Ala Val Asn Thr Ile Arg Ser Thr Gly Gly Asn Asn Ala Lys Arg His

180 185 190

Ile Met Ile Pro Ala His Ala Ala Ser Ala Ile Asp Ile Ala Leu Asn

195 200 205

Asp Leu Val Ile Pro Asn Asn Asp Asp Arg Ile Ile Ile Ser Val His

210 215 220

Asn Tyr Ser Pro Tyr Phe Phe Ala Met Asp Val Asn Gly Thr Ala Ser

225 230 235 240

Trp Gly Ser Asp Tyr Asp Lys Ala Ser Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala

245 250 255

Leu Tyr Asn Arg Phe Ile Lys Asn Gly Arg Ala Val Val Ile Gly Glu

260 265 270

Phe Gly Ser Ile Asn Lys Asn Asn Leu Ser Asp Arg Ile Arg His Ala

275 280 285

Glu Phe Phe Ala Lys Glu Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr Val Ile Trp

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Trp Asp Asn Gly Tyr Asn Glu Gly Gly Lys Ala Glu Ser Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Leu Asp Arg Arg Asn Leu Thr Trp Tyr His Pro Glu Ile Ala Glu Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gly Ala Gly Gly Val Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro Thr

340 345 350

Pro Glu Pro Thr Pro Ser Pro Gly Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Leu

355 360 365

Asn Gly Asp Gly Ile Ile Asn Ser Ile Asp Tyr Asn Leu Leu Asn Arg

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Tyr Ile Leu Glu Val Ile Asp Asp Leu Pro Val Glu Asn Tyr Ser Lys

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Val Ala Asp Leu Asn Gly Asp Gly Val Ile Asn Ser Asn Asp Ala Val

405 410 415

Leu Leu Gly Arg Phe Ile Leu Glu Ile Val Asp Lys Phe Pro Val Asp

420 425 430

Lys

<210> 3

<211> 534

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinat polypeptide

<400> 3

Ala Lys Ile Thr Glu Asn Tyr Gln Phe Asp Ser Arg Ile Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ser Ile Gly Phe Ile Pro Asn His Ser Lys Lys Ala Thr Ile Ala Ala

20 25 30

Asn Cys Ser Thr Phe Tyr Val Val Lys Glu Asp Gly Thr Ile Val Tyr

35 40 45

Thr Gly Thr Ala Thr Ser Met Phe Asp Asn Asp Thr Lys Glu Thr Val

50 55 60

Tyr Ile Ala Asp Phe Ser Ser Val Asn Glu Glu Gly Thr Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Ala Val Pro Gly Val Gly Lys Ser Val Asn Phe Lys Ile Ala Met Asn

85 90 95

Val Tyr Glu Asp Ala Phe Lys Thr Ala Met Leu Gly Met Tyr Leu Leu

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Arg Cys Gly Thr Ser Val Ser Ala Thr Tyr Asn Gly Ile His Tyr Ser

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Gln His Thr Lys Lys Asp Ser Thr Lys Gly Trp His Asp Ala Gly Asp

145 150 155 160

Tyr Asn Lys Tyr Val Val Asn Ala Gly Ile Thr Val Gly Ser Met Phe

165 170 175

Leu Ala Trp Glu His Phe Lys Asp Gln Leu Glu Pro Val Ala Leu Glu

180 185 190

Ile Pro Glu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Phe Leu Asp Glu Leu Lys

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Tyr Glu Ile Asp Trp Ile Leu Thr Met Gln Tyr Pro Asp Gly Ser Gly

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Arg Val Ala His Lys Val Ser Thr Arg Asn Phe Gly Gly Phe Ile Met

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Pro Glu Asn Glu His Asp Glu Arg Phe Phe Val Pro Trp Ser Ser Ala

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Arg Pro Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Glu Lys Cys Ile Asn Ala Ala Lys

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355 360 365

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Asn Lys Ile Ser Pro Asn Asn Asp Tyr Val Asn Ala Ala Leu Asp Ala

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Gly Leu Gly Ile Asn Pro Pro Met Asn Pro His Asp Arg Arg Ser Gly

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<220>

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Asn Glu Met Arg Ile Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Leu Asp Ala Ile

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Trp Leu Asn Arg Val Glu Glu Val Val Asn Tyr Ala Leu Ser Asn Asp

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Met Tyr Ala Ile Ile Asn Leu His His Glu Asn Ser Trp Leu Val Pro

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Thr Tyr Ala Gln Glu Lys Arg Ser Thr Glu Gln Leu Val Lys Ile Trp

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Glu Gln Val Ala Thr Arg Phe Lys Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Ile Phe

130 135 140

Glu Thr Met Asn Glu Pro Arg Val Glu Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Pro Glu Asn Arg His Val Ile Asn Asn Phe Asn Leu Ala

165 170 175

Ala Val Asn Thr Ile Arg Ser Thr Gly Gly Asn Asn Ala Lys Arg His

180 185 190

Ile Met Ile Pro Ala His Ala Ala Ser Ala Ile Asp Ile Ala Leu Asn

195 200 205

Asp Leu Val Ile Pro Asn Asn Asp Asp Arg Ile Ile Ile Ser Val His

210 215 220

Asn Tyr Ser Pro Tyr Phe Phe Ala Met Asp Val Asn Gly Thr Ala Ser

225 230 235 240

Trp Gly Ser Asp Tyr Asp Lys Ala Ser Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala

245 250 255

Leu Tyr Asn Arg Phe Ile Lys Asn Gly Arg Ala Val Val Ile Gly Glu

260 265 270

Phe Gly Ser Ile Asn Lys Asn Asn Leu Ser Asp Arg Ile Arg His Ala

275 280 285

Glu Phe Phe Ala Lys Glu Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr Val Ile Trp

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Trp Asp Asn Gly Tyr Asn Glu Gly Gly Lys Ala Glu Ser Tyr Ala Leu

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Leu Asp Arg Arg Asn Leu Thr Trp Tyr His Pro Glu Ile Ala Glu Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gly Ala Gly Gly Val Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro Thr

340 345 350

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<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic oligonucleotide

<400> 6

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<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic oligonucleotide

<400> 7

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<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic oligonucleotide

<400> 8

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<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 9

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<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 10

gatctcagtg gtggtggtgg tggtgcccag gagacggtgt tggctc 46

<210> 11

<211> 1824

<212> DNA

<213> Clostridium thermocellum

<400> 11

gcaaaaataa cggagaatta tcaatttgat tcacgaatcc gtttaaactc aataggtttt 60

ataccgaacc acagcaaaaa ggcgactata gctgcaaatt gttcaacctt ttatgttgtt 120

aaagaagacg gaacaatagt gtataccgga acggcaactt caatgtttga caatgataca 180

aaagaaactg tttatattgc tgatttttca tctgttaatg aagaaggaac gtactatctt 240

gccgtgccgg gagtaggaaa aagcgtaaac tttaaaattg caatgaatgt atatgaggat 300

gcttttaaaa cagcaatgct gggaatgtat ttgctgcgct gcggcaccag tgtgtcggcc 360

acatacaacg gaatacacta ttcccatgga ccgtgccata ctaatgatgc atatcttgat 420

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tacaacaaat atgtggtaaa cgccggcata accgttggtt caatgttcct ggcgtgggag 540

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gacgggagcg gaagggtggc tcataaagtt tcgacaagga actttggcgg ctttatcatg 720

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gaaaaatgta taaatgcggc aaaagtaagc tatgagtttt tgaagaacaa tcctgcgaat 900

gtttttgcaa accagagtgg attctcaaca ggagaatatg ccactgtcag tgatgcagat 960

gacagattgt gggcggcggc tgaaatgtgg gagaccctgg gagatgaaga ataccttaga 1020

gattttgaaa acagggcggc gcaattctcg aaaaaaatag aagccgattt tgactgggat 1080

aatgttgcaa acttaggtat gtttacatat cttttgtcag aaagaccggg caagaatcct 1140

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agccaaaacc atggctatgg cagaaccctt ggtacaacat attactgggg atgcaacggc 1260

acggttgtaa gacagactat gatacttcag gttgcgaaca agatttcacc caacaatgat 1320

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tcttatgtaa caggccttgg tataaatcct cctatgaatc ctcatgacag acgttcaggg 1440

gctgacggaa tatgggagcc gtggcccggt taccttgtag gaggaggatg gcccggaccg 1500

aaggattggg tggatattca ggacagttat cagaccaatg aaattgctat aaactggaat 1560

gcggcattga tttatgccct tgccggattt gtcaactata attctgctca aaatgaagta 1620

ctgtacggag atgtgaatga tgacggaaaa gtaaactcca ctgacttgac tttgttaaaa 1680

agatatgttc ttaaagccgt ctcaactctg ccttcttcca aagctgaaaa gaacgcagat 1740

gtaaatcgtg acggaagagt taattccagt gatgtcacaa tactttcaag atatttgata 1800

agggtaatcg agaaattacc aata 1824

<210> 12

<211> 1299

<212> DNA

<213> Herbivorax saccincola

<400> 12

tctacagcat acacaggtat gagggatatt acatctttag aacttgtaaa tgaaatgagg 60

attggatgga atttaggtaa tacccttgat gccattggag gggaaactaa ctggggaaat 120

cctaaaacca caaaggaaat gattgataaa gttaaagaaa tgggctttaa cactgtaagg 180

tttcccgtta cctggggagg tcatgtggga ccggctcccg attataaaat tgatgaaggc 240

tggctgaaca gggtggagga agtagtgaat tatgcacttt caaacgatat gtatgctata 300

attaatcttc accacgaaaa ctcatggctt gttcctacat atgcccagga aaaaagaagt 360

acagaacagc tggtgaaaat atgggaacaa gttgcaaccc gctttaaaga ctatggtgac 420

tatttaattt ttgaaacgat gaatgaaccc agggtagaaa actcacctta tgaatggtca 480

ggtggaacac ctgaaaaccg ccatgttata aataatttta atttggctgc tgtaaacaca 540

atcagaagta ccgggggaaa caatgcaaaa aggcatataa tgattccggc acatgctgca 600

tctgctatag atattgcatt aaatgacctg gttattccta ataatgatga caggataatt 660

atatctgtac ataattattc cccatacttc tttgctatgg atgtcaacgg cactgccagc 720

tggggaagtg attatgacaa ggcttctctt gcagctgaat tggaggcact ttataataga 780

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ctttcagaca ggatccggca tgcagagttt tttgctaaag aagcaagaaa aaggggcata 900

acggtgatat ggtgggataa tggatacaac gagggtggta aagcagaatc ctatgccctt 960

ttagacagaa gaaaccttac atggtaccat cctgagattg cagaggcact tgtaagaggg 1020

gcagggggag taccggagcc aacaccgaca cctactccag agccaacacc gtctcctggg 1080

gaagatattc tgtatgggga tttaaatggg gacggcatta ttaattcaat tgactataat 1140

ttattgaaca ggtatatatt agaagtgata gatgatttgc ctgttgaaaa ttatagtaaa 1200

gtagcagatt taaacggtga tggtgttatt aactcaaatg atgcagtttt gctgggaaga 1260

tttatattgg agattgtaga taaatttccc gttgataaa 1299

<210> 13

<211> 1602

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> recombinant polynucleotide

<400> 13

gcaaaaataa cggagaatta tcaatttgat tcacgaatcc gtttaaactc aataggtttt 60

ataccgaacc acagcaaaaa ggcgactata gctgcaaatt gttcaacctt ttatgttgtt 120

aaagaagacg gaacaatagt gtataccgga acggcaactt caatgtttga caatgataca 180

aaagaaactg tttatattgc tgatttttca tctgttaatg aagaaggaac gtactatctt 240

gccgtgccgg gagtaggaaa aagcgtaaac tttaaaattg caatgaatgt atatgaggat 300

gcttttaaaa cagcaatgct gggaatgtat ttgctgcgct gcggcaccag tgtgtcggcc 360

acatacaacg gaatacacta ttcccatgga ccgtgccata ctaatgatgc atatcttgat 420

tatataaacg gacagcatac taaaaaagac agtacaaaag gctggcatga tgcgggcgac 480

tacaacaaat atgtggtaaa cgccggcata accgttggtt caatgttcct ggcgtgggag 540

cattttaaag accagttgga gcctgtggca ttggagattc ccgaaaagaa caattcaata 600

ccggattttc ttgatgaatt aaaatatgag atagactgga ttcttaccat gcaataccct 660

gacgggagcg gaagggtggc tcataaagtt tcgacaagga actttggcgg ctttatcatg 720

cctgagaacg aacacgacga aagatttttc gtgccctgga gcagtgccgc aacggcagac 780

tttgttgcca tgacggccat ggctgcaaga atattcaggc cttatgatcc tcaatatgct 840

gaaaaatgta taaatgcggc aaaagtaagc tatgagtttt tgaagaacaa tcctgcgaat 900

gtttttgcaa accagagtgg attctcaaca ggagaatatg ccactgtcag tgatgcagat 960

gacagattgt gggcggcggc tgaaatgtgg gagaccctgg gagatgaaga ataccttaga 1020

gattttgaaa acagggcggc gcaattctcg aaaaaaatag aagccgattt tgactgggat 1080

aatgttgcaa acttaggtat gtttacatat cttttgtcag aaagaccggg caagaatcct 1140

gctttggtgc agtcaataaa ggatagtctc ctttccactg cggattcaat tgtgaggacc 1200

agccaaaacc atggctatgg cagaaccctt ggtacaacat attactgggg atgcaacggc 1260

acggttgtaa gacagactat gatacttcag gttgcgaaca agatttcacc caacaatgat 1320

tatgtaaatg ctgctctcga tgcgatttca catgtatttg gaagaaacta ttacaacagg 1380

tcttatgtaa caggccttgg tataaatcct cctatgaatc ctcatgacag acgttcaggg 1440

gctgacggaa tatgggagcc gtggcccggt taccttgtag gaggaggatg gcccggaccg 1500

aaggattggg tggatattca ggacagttat cagaccaatg aaattgctat aaactggaat 1560

gcggcattga tttatgccct tgccggattt gtcaactata at 1602

<210> 14

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<400> 14

tctacagcat acacaggtat gagggatatt acatctttag aacttgtaaa tgaaatgagg 60

attggatgga atttaggtaa tacccttgat gccattggag gggaaactaa ctggggaaat 120

cctaaaacca caaaggaaat gattgataaa gttaaagaaa tgggctttaa cactgtaagg 180

tttcccgtta cctggggagg tcatgtggga ccggctcccg attataaaat tgatgaaggc 240

tggctgaaca gggtggagga agtagtgaat tatgcacttt caaacgatat gtatgctata 300

attaatcttc accacgaaaa ctcatggctt gttcctacat atgcccagga aaaaagaagt 360

acagaacagc tggtgaaaat atgggaacaa gttgcaaccc gctttaaaga ctatggtgac 420

tatttaattt ttgaaacgat gaatgaaccc agggtagaaa actcacctta tgaatggtca 480

ggtggaacac ctgaaaaccg ccatgttata aataatttta atttggctgc tgtaaacaca 540

atcagaagta ccgggggaaa caatgcaaaa aggcatataa tgattccggc acatgctgca 600

tctgctatag atattgcatt aaatgacctg gttattccta ataatgatga caggataatt 660

atatctgtac ataattattc cccatacttc tttgctatgg atgtcaacgg cactgccagc 720

tggggaagtg attatgacaa ggcttctctt gcagctgaat tggaggcact ttataataga 780

tttattaaaa atggaagagc agttgtcata ggtgagtttg gcagtataaa taagaataac 840

ctttcagaca ggatccggca tgcagagttt tttgctaaag aagcaagaaa aaggggcata 900

acggtgatat ggtgggataa tggatacaac gagggtggta aagcagaatc ctatgccctt 960

ttagacagaa gaaaccttac atggtaccat cctgagattg cagaggcact tgtaagaggg 1020

gcagggggag taccggagcc aacaccgaca cctactccag agccaacacc gtctcctggg 1080

Claims (14)

1.一种从木葡聚糖源生产木葡聚糖寡糖(XGOS)的方法，所述方法包含在高于50℃的温度用酶将木葡聚糖酶促水解，所述酶在高于50℃的温度表现木葡聚糖酶活性，其特征在于所述酶表现出等于或高于5mM的终产物抑制常数(Ki)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述木葡聚糖源为罗望子、胡椒草、油菜籽、苹果、越橘、蓝莓、橄榄或其他包含其级分的木葡聚糖源，诸如罗望子果仁粉、脱脂罗望子果仁粉、罗望子种子以及其他来源的种子和细胞壁。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶为内切葡聚糖酶，优选选自GH家族5、9、12、16、44或74。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶与选自SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：4的多肽具有至少75％的序列相同性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶是在宿主细胞中重组产生的，并且其中所述宿主细胞对木葡聚糖源不表现出内源木葡聚糖酶活性。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含以下步骤：

·在有利于木葡聚糖酶水解所述多糖以形成木葡聚糖源多糖水解产物溶液的条件下，用与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的多肽具有至少75％的序列相同性的酶在水溶液中水解木葡聚糖源。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包含以下一个或多个步骤：

·除去固体；

·除去蛋白质和盐，例如通过离子交换色谱法；

·除去着色剂，例如通过超滤或纳滤；以及

·从所述溶液中回收木葡聚糖源多糖水解产物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶以木葡聚糖源的0.05％(w/w)或以下的量存在，和/或其中所用的木葡聚糖源的最终量为100g/l或更高。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中产生木葡聚糖水解产物，其包含DP7至DP9 XGOS的混合物、基本上由DP7至DP9 XGOS的混合物组成或由DP7至DP9 XGOS的混合物组成。

10.包含用根据前述权利要求中任一项所述的方法生产的DP7至DP9XGOS混合物的水解产物用于生产食物产品、动物饲料产品或其他产品的用途。

11.一种产品，其包含用根据权利要求1至9中任一项所述的方法生产的DP7至DP9 XGOS混合物。

12.一种具有内切葡聚糖酶活性的酶，其包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，所述多肽与根据SEQ ID NO：2、3或4的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性，条件是所述内切葡聚糖酶不是SEQ ID NO：1的多肽。

13.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求12所述的内切葡聚糖酶的核酸序列。

14.根据权利要求12所述的酶用于从木葡聚糖源生产XGOS的混合物的用途，其中所述混合物包含DP7至DP9 XGOS、基本上由DP7至DP9 XGOS组成或由DP7至DP9 XGOS组成。

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