CN112074602A

CN112074602A - 具有改善的热稳定性和对阿拉伯木聚糖增加的酶活性的新木聚糖酶

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Publication number: CN112074602A
Application number: CN201880089744.1A
Authority: CN
Inventors: S·格劳布纳; V·兹韦尔洛夫; W·施瓦茨; W·豪夫; B·安德烈森; L·P·舒尔特; W·利布尔
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-12-11
Also published as: EP3502242A1; US20210071161A1; WO2019120852A1

Abstract

本发明涉及具有木聚糖酶活性的新型多肽，尤其是木聚糖酶变体，诸如遗传工程化木聚糖酶变体，其显示出改善的热稳定性，改善的耐酸处理性和对阿拉伯木聚糖增加的酶活性。本发明包括所述多肽在应用(诸如食品或饲料，用于酿造或麦芽制造，用于处理含木聚糖的原料如谷物基材料，例如用于生产生物燃料或其他发酵产物，包括生物化学品，和/或用于小麦面筋‑淀粉分离工业)中的用途，和使用这些多肽的方法，以及包含所述多肽的组合物(诸如饲料添加剂组合物)。

Description

具有改善的热稳定性和对阿拉伯木聚糖增加的酶活性的新木聚糖酶

技术领域

本发明涉及具有木聚糖酶活性的新型多肽，尤其是木聚糖酶变体，诸如遗传工程化木聚糖酶变体，其显示出改善的热稳定性，改善的耐酸处理性和对阿拉伯木聚糖增加的酶活性。本发明包括所述多肽在应用(诸如食品或饲料，用于酿造或麦芽制造(malting)，用于处理含木聚糖的原料如谷物基材料，例如用于生产生物燃料或其他发酵产物，包括生物化学品，和/或用于小麦面筋-淀粉分离工业)中的用途，和使用这些多肽的方法，以及包含所述多肽的组合物(诸如饲料添加剂组合物)。

背景技术

以下称为木聚糖酶的内切-β-1,4-木聚糖酶或4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(EC3.2.1.8)是通过将(1-4)-β-D木糖苷键(线性多糖β-1,4-木聚糖)内切水解为较短低聚物而降解的一类酶的命名。这样的酶因此分解半纤维素(植物细胞壁的主要成分之一)，并因此降低生物质的粘度，从而改变其在生物技术应用中的技术物理性质。木聚糖酶已经在各种工业应用(诸如在食品或饲料的生产中，在酿造或麦芽制造中，在处理含阿拉伯木聚糖的原料如谷物基材料中，例如在生产生物燃料或其他发酵产物，包括生物化学品(例如生物基异戊二烯)，和/或在小麦面筋淀粉分离工业中)中，以及在使用这些木聚糖酶的方法中以及包含所述木聚糖酶的组合物(例如饲料添加剂组合物)中使用了多年。

所有这些应用中的共同特征是酶必须应对的挑战性条件。例如，高温降低了目前可获得的木聚糖酶在工业条件下的有效利用。在动物饲料应用中，合适的木聚糖酶可以增加动物饲料中生物质的可消化(＝可利用)部分。用于动物饲料的生物质(诸如玉米、小麦和DDGS)包含两个部分的阿拉伯木聚糖，即水不可提取的阿拉伯木聚糖(WU-AX)和水可提取的阿拉伯木聚糖(WE-AX)。有用的木聚糖酶不仅仅必须具有降解细胞壁中存在的WU-AX的能力；因此它们增加了被包封的营养物的释放。另外，它们还必须具有降低由可溶部分引起的粘度的能力。除了高生物功效之外，有用的木聚糖酶还需要良好的产物性质，诸如在低pH值的稳定性和对抗热处理的稳定性。

饲料中使用的酶的另一个理想性质是胃蛋白酶耐性。胃蛋白酶是动物在消化系统的第一部分分泌的消化蛋白酶。胃蛋白酶使蛋白质降解。该蛋白酶消化使蛋白质可用作动物必需营养物的来源。外源酶(即添加到饲料中的酶)也是蛋白质，并且如果它们对胃蛋白酶降解是敏感的，则它们将被降解。与大多数酶的情况一样，这将破坏所需的酶活性。因此，只有如果木聚糖酶对胃蛋白酶降解有抗性，则用于动物饲料应用的木聚糖酶才是有用的。

为了用作饲料添加剂，对高温的稳定性是木聚糖酶的另一个重要特征。熟知的是，造粒(pelleting)增加了淀粉部分的可消化性(Carre等人，1987)。除了一些营养物的更高的生物利用度之外，因为减少了粉尘，还存在更少的饲料浪费，更均匀的营养和改善的饲料处理。在食品安全方面，造粒也变得更重要。大多数微生物在高湿度条件下对热敏感。因此，饲料工业越来越多地使用蒸汽造粒以降低饲料的微生物负荷。在饲料造粒过程期间的相对短的时间，施加热(例如在约80℃持续30秒，WO2008063309)。适当的木聚糖酶必须耐受该高温而不显示变性。然而，在较低温度(例如37℃)需要实际的酶催化活性。因此，酶在高温不应不可逆地失活，而必须在较低温度具有活性。

除了动物营养之外，其它重要的工业应用是纸浆漂白、纺织纤维的改性(Prade，1996)，以及谷物或木质纤维素转化为溶剂和生物化学品如乙醇。所有这些应用中的共同特征是酶必须应对的挑战性条件。高温和与许多木聚糖酶的最佳pH基本不同的pH降低了目前可获得的木聚糖酶在工业应用中的有效利用。

在纸浆漂白中，由碱性洗涤产生的材料具有高温(＞80℃)和高pH(＞10)。没有可商购木聚糖酶对这些条件有耐性。纸浆必须冷却并且碱性pH被中和以便用目前可获得的木聚糖酶处理纸浆。这导致成本增加。在较高pH值的较高方法温度将有助于克服常规方法的这些缺点。溶剂(诸如乙醇)，或从谷物或木素纤维素产生的生物化学品在大多数情况下开始于加热步骤以净化底物并使底物易于酶促降解。木聚糖酶必须经受住高温以便可靠地降低浆液粘度而不产生高的冷却成本。已经使用的蛋白质工程(有时相继地)来稳定木聚糖酶以抵抗高温和不利pH条件的变性作用。

已经从嗜热生物体中发现并克隆了几种热稳定的、嗜碱的和嗜酸的木聚糖酶(Bodie等人，1994；Fukunaga等人，1998；Dutta等人，2007；Chi等人，2012；Prakasch等人，2012)。然而，已证明在大多数情况下生产经济量的这些酶的至少是困难的。因此，将不像这样耐热或嗜碱的里氏木霉(T.reesei)木聚糖酶II用于工业用途，因为它可以以低成本大量生产。

因此，存在具有高生物功效和合适产品性质(包括对热处理稳定)的新型木聚糖酶的需要。因此，本发明的问题是提供用于工业过程的具有改善性质的新木聚糖酶。该问题通过提供根据权利要求1的新型酶变体来解决。本发明的酶变体具有与例如饲料生产、谷物和木质纤维素转化相关的优秀生化性质。

发明内容

本发明提供了具有木聚糖酶活性的多肽，优选具有木聚糖酶活性的GH11酶，其中至少一个、优选两个或三个碳水化合物结合模块(CBM)通过遗传工程缺失，并且其显示出改善的酶谱。

本发明提供的GH11木聚糖酶最初分离自粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)。出人意料地发现，缺失亲本酶的CBM导致改善的热稳定性，改善的耐酸处理性以及增加遗传工程化酶的酶活性。

在一个优选的实施方案中，本发明提供的GH11酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽分别与根据SEQ ID NO:2或3的多肽(其中分别缺失两个或三个CBM)具有至少75％的氨基酸序列相同性。更优选地，本发明提供的GH11酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与根据SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性。

在又一个实施方案中，本发明的GH11酶，特别是根据SEQ ID NO:3的多肽，显示出改善的特征，诸如：

·耐酸处理性；和/或

·耐胃蛋白酶降解性；和/或

·酶活性增加约1.6倍和/或

·Tm_on从67℃增加至超过80℃；和/或

·在37℃至85℃的宽温度范围内的酶活性；和/或

·在pH 5.0至9.5的宽pH范围内的足够酶活性。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，该核酸序列是编码根据SEQ ID NO:2或3的GH11酶的SEQ ID NO:9或10的核酸序列。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含编码根据SEQID NO:2或3的GH11酶的SEQ ID NO:9或10的核酸分子。

本发明进一步提供了一种宿主细胞，其包含SEQ ID NO:9或10的核酸序列或者含所述核酸序列的表达载体，其中所述宿主细胞表达根据SEQ ID NO:2或3的GH11酶。

本发明还涉及一种产生SEQ ID NO:2或3、优选SEQ ID NO:3的酶的方法，该方法包括在允许产生酶的条件下培养如权利要求8所述的宿主细胞，并从培养物中回收酶。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种添加到生物质或含半纤维素的材料中的组合物，所述组合物包含GH11酶和任选包含至少一种配制剂、赋形剂、稳定剂和/或防腐剂，其中所述GH11酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与根据SEQ ID NO:1、2或3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性。

在本发明的又一个实施方案中，本发明的GH11酶或包含所述GH11酶的组合物改变半纤维素组分的含量，特别是木聚糖含量，以使例如致密结构松弛或降低生物质或含半纤维素的材料的高粘度。

本发明进一步涉及本发明的GH11酶或包含所述GH11酶的组合物在生产动物饲料、纸浆和纸、生物能中以及在酿造中的用途。

具体实施方式

定义

根据本发明的生物质是指衍生自来自以下的单细胞和多细胞生物体的细胞壁的生物质：真核界原生生物(原生生物界)，真菌和植物界(绿色植物界)，包括维管植物、藓类、苔类、金鱼藻、地衣、蕨类、真菌、红藻、灰藻和绿藻，无论材料是否被预处理。从植物中，包括所有部分如根、叶、果实、茎。

根据本发明的“预处理”意指用机械、化学或物理方法处理生物质，包括切碎、压碎、研磨、粉碎、超声处理、热、蒸汽爆破、溶剂、化学品、酸性或碱性暴露、液化或干燥或这些方法的组合。处理可以在破坏或未破坏的生物质上进行。

根据本发明的半纤维素定义为可以通过对植物组织进行碱性提取而制备的多糖。构成半纤维素的一些主要多糖是木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、混联β-葡聚糖和木糖葡聚糖。这些可溶的、部分可溶的或不可溶的多糖是植物细胞壁的主要组分，并且是碎化或压碎的生物质浆粘度的主要原因。

根据本发明的含半纤维素的材料意指包含任何浓度的半纤维素的任何底物；该材料可以是液化的、部分液化的或干燥的，并且可以是例如浆、悬浮液、溶液、纸浆、糊剂(paste)、糊状物(batter)、生面团、醪液、工艺水或废水、粉末、颗粒、压丸等的形式。

根据本发明的含半纤维素的材料的转化被定义为降低半纤维素多糖的聚合度，所述半纤维素多糖包括但不限于木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖(包括混联β-葡聚糖)和木糖葡聚糖。这些多糖可以或可以不衍生有化学侧基，例如酯(乙酰基酯或阿魏酰基酯)等。

根据本发明的“半纤维素分解活性”定义为酶水解半纤维素的能力。通过水解活性使这些多糖解聚的酶称为半纤维素酶。木聚糖酶是属于半纤维素酶组的一类代表性酶。

根据本发明的“木聚糖酶活性”定义为酶将木聚糖的线性多糖β-1,4-木聚糖主链降解为较短寡糖的能力。特别地，根据本发明，木聚糖酶活性是指改变生物质源中的聚合木聚糖含量以克服含半纤维素的材料的限制(例如高粘度且致密的难达到的结构)。改变聚合木聚糖含量在一个实施方案中是指降低聚合木聚糖的含量。在另一个实施方案中，改变聚合木聚糖含量是指降低聚合阿拉伯木聚糖的含量。在另一个实施方案中，改变聚合阿拉伯木聚糖含量是指改变不溶性阿拉伯木聚糖(WU-AX)与可溶性阿拉伯木聚糖(WE-AX)的比率。

根据本发明的“GH11木聚糖酶”或“GH11酶”遵循在Carbohydrate-Active enZYmesDatabase(CAZy,http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html)中公开的标准，根据将酶分类为糖苷水解酶GH家族而定义：大多数木聚糖酶可以在GH家族5、7、8、10、11和43中找到(Lombard等人，2013)；然而，根据Carbohydrate-Active enZYmes Database(CAZy)，他们还出现在其他家族诸如16、51、52、62中(Adelsberger等人,2004；Bouraoui等人，2016；Collins等人，2005)。木聚糖酶最突出的酶家族是GH10和GH11，它们在其物理化学性质(包括蛋白质结构和折叠)和其底物特异性方面都显著不同。与家族10木聚糖酶相比，GH家族11木聚糖酶通常具有低分子量和更高的pI(Kolenová等人，2006；Collins等人，2005；Biely等人，1997)。GH11酶的二级结构显示出β-果冻角色折叠类型。可以从序列中预测酶的这种三维结构，并且即使存在非常低的序列相同性，蛋白质也可以具有相同的折叠。活性位点和结合底物的氨基酸残基相对较好地保守，即使这些保守的氨基酸残基相对于完整的蛋白质序列而言是相当短的序列。

CBM模块是非催化碳水化合物结合模块。它被定义为“在具有碳水化合物结合活性的带有离散折叠的碳水化合物活性酶内的连续氨基酸序列”(http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。CBM先前被称为纤维素结合结构域，直到发现它们中的大多数也可以结合其他多糖。基于氨基酸序列相似性，将CBM分类为许多家族。CAZy数据库中目前有64个CBM家族，它们对不同的可溶性或不溶性多糖具有结合亲和性。

模块被定义为给定蛋白质的保守部分，并且具有限定的序列(在相似性边界内)和(三级)结构，该限定序列和结构可以进化、发挥作用，并且独立于蛋白质链的其余部分而存在。每个模块形成紧凑的三维结构，并且通常可以独立地稳定和折叠。

术语“亲本酶”意指木聚糖酶，优选GH11木聚糖酶，对其进行改变以产生本发明的经修饰的酶。在一个实施方案中，亲本酶是GH11木聚糖酶。合适地，亲本酶可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。在一个优选的实施方案中，亲本酶是天然存在的(即野生型)多肽。

热稳定性

术语“热稳定性”是酶在给定pH时在相对高的温度抵抗不可逆失活(通常通过变性)的能力。

根据本发明的木聚糖酶(例如经修饰的木聚糖酶)的热稳定性可以使用以下“用于测量热稳定性的试验”来测定。

存在许多测量热稳定性的方式。可以通过稀释酶并将其与荧光、环境敏感的染料一起孵育或直接测量固有的色氨酸荧光发射来直接测量。为此，在将混合物逐渐加热至98℃的同时监测荧光发射。变性将疏水性残基暴露于溶剂(其中这些疏水性残基与环境敏感的染料相互作用)从而改变其荧光发射光谱，或者变性将色氨酸残基暴露于溶剂从而改变其荧光发射光谱。将荧光发射强度对温度作图并使用Boltzmann方程拟合。然后可使用得自Boltzmann方程的参数来测定Tm₅₀，该Tm₅₀描述50％酶被变性时的温度。可替代地，可使用得自Boltzmann方程的值来计算Tm_on，该Tm_on描述1％酶处于变性状态时的温度。Tm₅₀和Tm_on均可用于描述酶的热稳定性，如实施例6所述。

测量热稳定性的一种间接方式可以是在没有底物的情况下在升高的温度(与酶在长达几天的更长时间是稳定的所处温度相比)孵育酶样品限定的时间段(例如，1至30分钟，诸如5分钟)。在升高的温度孵育后，测定酶样品在容许温度下的残余活性。

通过间接测量热稳定性，可以以温度的函数来测量酶失活。在此，将酶样品在没有底物的情况下在各种温度孵育限定的时间段(例如1至30分钟，诸如5分钟)，并且在孵育后，在容许温度，例如在37至80℃的范围内的温度(诸如37℃、50℃、60℃、70℃、80℃或更高，诸如85℃或90℃或更高)测定残余活性。相对于未在升高的温度孵育的酶样品来计算每个温度的残余活性。所得热变性谱(温度对残余活性)可用于计算获得50％残余活性时的温度。该值被定义为Tm值。

甚至进一步地，通过间接测量，可以以时间的函数将热稳定性评估为酶失活。在此，将酶样品在没有底物的情况下在限定的升高温度(例如，75℃)孵育不同的时间段(例如10秒和30分钟之间)，并且在孵育后，在容许温度，例如在25至80℃的范围内的温度(诸如30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或更高，诸如80℃或90℃或更高)测定残余活性。相对于未在升高的温度孵育的酶样品来计算每个温度的残余活性。所得热变性谱(温度对残余活性)可用于计算获得50％残余活性时的温度。该值通常以T1/2给出。

在一个实施方案中，如果酶具有70℃或更高、优选75℃或更高、甚至更优选80℃或更高的Tm_on值(在pH 7.0)，其中Tm_on值为1％酶处于变性状态时的温度，则根据本发明，认为该酶是热稳定的。该Tm_on值可以根据本文教导的用于测量热稳定性的试验来测量。

在一个实施方案中，如果酶具有80℃或更高、优选85℃或更高的Tm₅₀值(在pH7.0)，其中Tm₅₀值为50％酶被变性时的温度，则根据本发明，认为该酶是热稳定的。该Tm₅₀值可以根据本文教导的用于测量热稳定性的试验来测量。

在一个实施方案中，如果酶具有在80℃和90℃之间，在优选的实施方案中具有80℃或更高、更优选85℃或更高的Tm值(在pH 6.5)，其中该Tm值为在5分钟孵育后获得50％残余活性时的温度，则根据本发明，认为该酶是热稳定的。该Tm值可以根据本文教导的用于测量热稳定性的试验来测量。

优选地，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH11木聚糖酶(诸如亲本或经修饰的GH11木聚糖酶)或其片段(或包含其的组合物)可以经受高达75℃或更高；优选在80℃和90℃之间、更优选80℃或更高、最优选高达85℃的热处理(在pH 7.0)(例如在造粒过程期间)。热处理可以进行多达30秒；多达1分钟，多达5分钟；多达10分钟；多达30分钟；多达60分钟。经受这种热处理意味着在加热到特定温度之前在添加剂中存在/具有活性的至少50％的酶在冷却到环境温度之后仍然具有活性。

这些是用于测量热稳定性的实例。热稳定性也可以通过其它方法测定。优选地，通过使用上文教导的“用于测量热稳定性的试验”来评估热稳定性。

与热稳定性相反，热活性被定义为作为温度的函数的酶活性。为了测定热活性，可以在底物存在的情况下将酶样品在各种温度孵育(测定)试验所限定的时间段。在孵育期间或紧接着孵育后获得酶活性，如通过试验所定义的(例如读取OD值，该OD值反映所形成的反应产物的量)或如实施例5中所述的。获得最高酶活性时的温度是酶在给定试验条件下的最适温度。可以相对于在最适温度获得的酶活性来计算在每个温度获得的酶活性。这将提供酶在给定试验条件的温度谱。

在本申请中，热稳定性与热活性不同。

在优选的实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH11木聚糖酶，诸如SEQ ID NO:2和3的亲本或经修饰的GH11木聚糖酶，优选SEQ ID NO:3的木聚糖酶或其片段，具有在80℃和90℃之间的Tm值，在更优选的实施方案中具有在85℃和90℃之间的Tm值(在pH6.5)(其中Tm值是在5分钟孵育后获得50％残余活性时的温度)，具有70℃、优选75℃、甚至更优选80℃或更高、最优选81.2℃的Tm_on值(在pH 7.0)(其中Tm_on值是1％酶处于变性状态时的温度)，并且具有80℃、优选85℃或更高、最优选85.7℃的Tm₅₀值(在pH 7.0)(其中Tm₅₀值是50％酶被变性时的温度)。

酸处理

通过在缓冲剂和在2.5-5.5的pH范围(诸如5.0、4.5、4.0、3.5、3.0或2.5或更低)预孵育酶样品30、45、60、90和120分钟并随后通过实施例5中所述的木聚糖酶活性方法测量残余活性来测量SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的多肽的酸稳定性谱。将在没有预孵育的情况下测量的酶活性设定为100％，并且相对于此来计算每种变体在每个pH的残余酶活性。当在低pH值处理后保留等于或高于70％的酶活性时，本发明的GH11酶被认为是酸稳定的。如图5所示，在低pH中2小时后，保留超过70％的SEQ ID NO:3木聚糖酶活性。

在一个优选的实施方案中，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的遗传工程化的GH11木聚糖酶的酶或其片段在酸性pH 2.5至5.5的范围内、优选在2.5至4.0的范围内(例如3.5)耐受酸处理。

制剂和添加剂

GH11木聚糖酶可以添加到选自以下形式的生物质或含半纤维素的材料：细胞提取物、无细胞提取物、部分纯化的蛋白质和纯化的蛋白质。

而且，取决于用途和/或应用方式和/或施用方式，可以将GH11木聚糖酶以溶液形式或作为固体添加至生物质或含半纤维素的材料中。固体形式可以为干酶粉末或颗粒状酶。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于添加到生物质或含半纤维素的材料的GH11木聚糖酶组合物，所述组合物包含根据本发明的GH11木聚糖酶，和任选包含至少一种配制剂、赋形剂、稳定剂和/或防腐剂。该制剂可以是液体制剂(诸如溶液或悬浮液)、或干燥制剂(诸如粉末或颗粒)。

在一个实施方案中，GH11木聚糖酶组合物包含作为热稳定剂的糖，例如蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、毛蕊花糖、蜜二糖、三氯蔗糖或棉子糖。通过将酶包封在糖基质中使得酶的活性通过加工操作保持在高水平，该糖为酶提供增强的热稳定性。

液体酶制剂含有例如选自甘油或水的溶剂。

在一个实施方案中，酶组合物包含稳定剂。不限于这些实例，稳定剂可以选自：

·盐，诸如氯化钠、氯化镁、硫酸钠和硫酸钾，

·小溶质，如依克多因(ectoine)，

·氨基酸或蛋白质，诸如组氨酸、甘氨酸、精氨酸或BSA，

·多元醇、聚合物和(多)糖，例如淀粉、寡糖、麦芽糊精、海藻糖、乳糖、麦芽糖、纤维糊精、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、葡聚糖或PEG；

·表面活性剂诸如明胶、泊洛沙姆Brij、辛基-吡喃葡萄糖苷、棕榈酸、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、羟丙基-β-环糊精、聚山梨酯20或聚山梨酯80，

·抗氧化剂，诸如DTT、EDTA、THPP和巯基乙醇，

·聚阳离子，例如聚乙烯亚胺，和

·聚阴离子，诸如聚丙烯酸。

在又一个实施方案中，酶组合物包含防腐剂。防腐剂为例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或其他食品认可的或非食品认可的防腐剂或它们的混合物。

在又一个实施方案中，酶组合物包含至少一种选自添加剂诸如增量剂、填充剂、粘合剂、风味掩蔽剂、苦味阻滞剂和活性增强剂的其他物种。

在又一个实施方案中，根据本发明的GH11酶可与一种或多种辅助酶组合使用以进一步改善木聚糖酶效果。辅助酶的非排他性实例选自：淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、麦芽四糖水解酶、蛋白酶、其他木聚糖酶、乙酰转移酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、β-甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、鼠李糖苷酶、木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸苷酶(glucuronosidases)、葡萄糖氧化酶、裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、氧化还原酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、昆布多糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、壳聚糖酶、角叉菜胶酶、琼脂糖酶、阿拉伯聚糖酶、木糖葡聚糖酶、果聚糖酶、转谷氨酰胺酶、异构酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、淀粉酶、脂加氧酶、果胶酶、鼠李半乳醛聚糖裂合酶、半乳糖醛酸水解酶、蛋白酶、肽酶、半乳糖苷酶、果胶裂合酶或它们的混合物。这些辅助酶可以与本发明的GH11酶一起添加到生物质或含半纤维素的材料中，或者可以包含在包含如上所述的GH11酶的组合物中。还可以向生物质或含半纤维素的材料中加入两种单独的组合物，包含本发明的GH11酶的第一组合物和包含一种或多种辅助酶的第二组合物。

GH11木聚糖酶的修饰

本发明方法中使用的GH11木聚糖酶得自粪堆梭菌。在1990年，Schwarz等人公布了来自粪堆梭菌的降解木聚糖的木聚糖酶的分析，并且Adelsberger等人，2004描述了衍生自粪堆梭菌的木聚糖酶的重组表达。在一个优选的实施方案中，通过使用遗传工程缺失亲本酶的至少两个、优选全部三个CBM模块来修饰本发明的方法中使用的GH11木聚糖酶。

在另一个优选的实施方案中，通过遗传工程改善根据SEQ ID NO:1-3的GH11多肽的酶谱。在一个实施方案中，改善的酶谱包括进一步改善的热稳定性和/或耐酸或碱处理性。关于在高于85℃的温度的酶活性的增加的活性谱可以例如通过具有合适产物分布的酶诱变来实现。本领域技术人员知道将突变引入酶中以优化酶特征的一般技术。实例突变是将半胱氨酸残基引入氨基酸序列，其形成二硫键以使酶稳定抵抗热变性。在另一方面，可以通过随机、靶向诱变或定向进化实现热稳定性或改善的耐酸或碱处理性，由此原始氨基酸序列的一个或几个氨基酸被不同于原始序列的氨基酸取代。另一方面，为了增加酶的热稳定性，可以进行原始氨基酸序列中一个或多个氨基酸、环区或蛋白模块的缺失或插入。在另一方面，酶的热稳定可以通过酶的包封、化学交联和稳定化合物的添加来实现。这种稳定化合物是例如BSA、甘油和山梨糖醇。使酶稳定的其它方法是化学交联或任何其它方法，其导致在大于、等于或大于85℃的合适酶活性。

粪堆梭菌的菌株在许多培养物保藏中心可以为公众所获得，诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)和农业研究机构培养物保藏中心、北部研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的酶具有木聚糖酶活性。更优选地，本发明方法中使用的酶改变半纤维素组分的含量。酶改变木聚糖含量以克服生物质或含半纤维素的材料的限制，例如致密结构或高粘度。改变聚合木聚糖含量在一个实施方案中是指降低聚合木聚糖的含量。在另一个实施方案中，改变聚合木聚糖含量是指降低聚合阿拉伯木聚糖的含量。在另一个实施方案中，改变聚合阿拉伯木聚糖含量是指改变不溶性阿拉伯木聚糖(WU-AX)与可溶性阿拉伯木聚糖(WE-AX)的比率。

本发明进一步提供了具有SEQ ID NO:1至3的推定氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段、类似物和衍生物。当提及SEQ ID NO:1至3的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指保留与木聚糖酶基本相同的生物学功能或活性的多肽。例如，类似物可包括前蛋白(proprotein)，其可通过切割前蛋白以产生活性成熟蛋白而活化。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，其通过蛋白水解多肽或遗传工程化多肽产生。SEQ ID NO:3的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代并且该取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的片段、衍生物或类似物，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基团的片段、衍生物或类似物，或(iii)其中另外的氨基酸与成熟蛋白(诸如前导序列或分泌序列，或用于纯化、或用于成熟多肽的底物或复合物结合的序列，或前蛋白序列)融合的片段、衍生物或类似物。此类片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员根据本文提供的教导的范围内。

本发明的多肽包括SEQ ID NO:3的多肽，以及与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的相似性(例如，优选至少50％；并且更优选至少70％的相同性)，更优选与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％的相似性(例如，优选至少70％的相同性)，并且最优选与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％的相似性(例如优选至少90％的相同性)的多肽。此外，它们应优选包括含有至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的序列的此类多肽的精确部分。

本发明的多肽的片段或部分可以用作通过肽合成产生相应全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或者部分可用于合成本发明的全长多核苷酸。

在一个优选的实施方案中，本发明的所述多肽是GH11木聚糖酶，该GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与选自SEQ ID NO:1至3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性并且显示木聚糖酶活性，其中

SEQ ID NO:1的多肽：是来自粪堆梭菌的野生型酶；

SEQ ID NO:2的多肽：是不含两个碳水化合物结合模块(CBM)的粪堆梭菌GH11木聚糖酶

SEQ ID NO:3的多肽：是不含三个碳水化合物结合模块(CBM)的粪堆梭菌GH木聚糖酶。

在一个更优选的实施方案中，具有木聚糖酶活性的所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与根据SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性，前提条件是该酶不是SEQ ID NO:1的多肽。

在又一更优选的实施方案中，所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性。

在再一更优选的实施方案中，所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性，其中在所述木聚糖酶中缺失两个CBM。

在最优选的实施方案中，具有木聚糖酶活性的所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与根据SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性，前体条件是该酶不是SEQ ID NO:1的多肽。

在又一最优选的实施方案中，所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性。

在一个特别优选的实施方案中，所述GH11木聚糖酶包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，该多肽与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性，其中在所述木聚糖酶中缺失三个CBM，这导致1.6倍的酶活性增加，结合10℃或更高的热稳定性改善和对抗酸处理的稳定性改善。

根据本发明优选的是SEQ ID NO:1至3中任何GH11木聚糖酶，其与在其温度和最适pH的100％酶活性，特别是木聚糖酶活性相比，在宽的pH范围，优选在5.0至9.5的范围内显示出至少40％的酶活性。

根据本发明优选的是SEQ ID NO:1至3中任何GH11木聚糖酶，其与在其温度和最适pH的100％酶活性，特别是木聚糖酶活性相比，在37℃至等于或大于80℃的宽温度范围显示出至少40％的酶活性。

根据本发明优选的是SEQ ID NO:1至3中任何GH11木聚糖酶，其在37℃至等于或大于80℃的宽温度范围内显示出酶活性，特别是木聚糖酶活性。温度范围对于酶在不同应用诸如动物饲料、酿造、纸浆和纸以及生物能中的广泛用途是重要的。

本发明的GH11木聚糖酶尤其适合用于改善生物质的转化或含半纤维素的材料的转化，例如用作动物饲料丸粒中的消化改善剂，降低酿造中的粘度和清除，基于谷物的乙醇生产中的粘度降低，木质纤维素水解中的粘度降低，纸浆和纸中半纤维素的去除。本发明提供的酶在中温和高温仍显示出足够的木聚糖酶活性来改变阿拉伯木聚糖含量或链长。在碱性和酸性pH范围内的稳定性对于在使本发明的GH11木聚糖酶经受苛刻的处理条件之后保持酶活性是有利的。

在优选的实施方案中，本发明因此涉及本发明的GH11酶或包含所述GH11酶的组合物在生产动物饲料、纸浆和纸，生物能中以及在酿造中的用途。

本发明进一步涉及一种核酸分子，其包含编码根据本发明的SEQ ID NO:1至3的多肽的GH10酶，特别是编码选自SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的核酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明提供了核酸分子，该核酸分子包含选自SEQ ID NO:8至10、更优选SEQ IDNO:9或10的核酸序列。

SEQ ID NO:8的核酸分子编码SEQ ID NO:1的GH木聚糖酶。SEQ ID NO:9的核酸分子编码SEQ ID NO:2的GH木聚糖酶。SEQ ID NO:10的核酸分子编码SEQ ID NO:3的GH木聚糖酶。

本发明的“多核苷酸”或者“核酸”可以为RNA的形式或者DNA的形式；DNA应理解为包括cDNA、基因组DNA、重组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。由于遗传密码的冗余或简并性或单核苷酸多态性，编码该多肽的编码序列可以与SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:3所示的多肽的编码序列相同，或者可以是编码相同多肽的不同编码序列。例如，它也可以是RNA转录物，该转录物包括SEQ IDNO:3中任一个的多肽的编码序列的全长。在一个优选的实施方案中，根据本发明的“多核苷酸”是SEQ ID NO:10之一。

编码SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:3的多肽的核酸可以包括但不限于单独的多肽的编码序列；多肽的编码序列加上另外的编码序列，诸如前导或分泌序列或原蛋白序列；和多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)加上非编码序列，诸如内含子或该多肽的编码序列的非编码序列5'和/或3'。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”或术语“编码多肽的核酸”应理解为涵盖仅包含本发明的GH11木聚糖酶(例如选自SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:3的多肽)的编码序列的多核苷酸或核酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸或核酸。术语多核苷酸和核酸可互换地使用。

本发明还包括多核苷酸，其中多肽的编码序列可以在同一阅读框中与有助于从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合；例如，可以如此融合前导序列，该前导序列用作控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有这样的前导序列的多肽被称为前蛋白(preprotein)或前原蛋白(preproprotein)，并且可以具有被宿主细胞切割以形成该蛋白的成熟形式的前导序列。这些多核苷酸可具有5'延伸区，使得其编码原蛋白，该原蛋白是成熟蛋白加上在N末端处的另外的氨基酸残基。具有这种前序列(prosequence)的表达产物被称为原蛋白，它是成熟蛋白的无活性形式；然而，一旦前序列被切割，活性的成熟蛋白就会保留下来。另外的序列也可以连接到蛋白质并成为成熟蛋白的一部分。因此，例如，本发明的多核苷酸可编码多肽、或具有前序列的蛋白质、或具有前序列和导肽(presequence)(诸如前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸还可以具有与标记序列在框内融合的编码序列，其允许纯化本发明的多肽。标记序列可以是亲和标签或表位标签，诸如聚组氨酸标签、链霉亲和素标签、Xpress标签、FLAG标签、纤维素或几丁质结合标签、谷胱甘肽S转移酶标签(GST)、血凝素(HA)标签、c-myc标签或V5标签。

HA标签将对应于得自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984)，而c-myc标签可以是来自人Myc蛋白的表位(Evans等人，1985)。

认为本发明进一步提供了与上述序列杂交的多核苷酸，其中序列之间具有至少70％、优选至少90％、更优选至少95％的相同性或相似性，并因此编码具有相似生物活性的蛋白质。此外，如本领域中已知的，当氨基酸序列包含针对序列中每个单独残基的相同或保守的氨基酸取代物时，两个多肽之间存在“相似性”。可以使用序列分析软件(例如，ClustalW at PBIL(

Bioinformatique Lyonnais)http://npsa-pbil.ibcp.fr)测量相同性和相似性。本发明特别提供了这样的多核苷酸，其在严格条件下与上述多核苷酸杂交。

合适的严格条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度或通过杂交温度来定义，并且是本领域熟知的。特别地，可以通过降低盐的浓度，通过增加甲酰胺的浓度和/或通过提高杂交温度来提高严格性。

例如，在高严格性条件下的杂交可在约37℃至42℃采用约50％的甲酰胺，而在降低的严格性条件下的杂交可在约30℃至35℃采用约35％至25％的甲酰胺。在高严格性条件下杂交的一组特定条件采用42℃，50％甲酰胺，5x SSPE，0.3％SDS和200μg/ml切变和变性的鲑鱼精子DNA。对于在降低的严格性下的杂交，可以在35℃的降低温度在35％的甲酰胺中使用如上所述的类似条件。通过计算感兴趣的核酸的嘌呤与嘧啶比率并相应调节温度，可以进一步缩小与特定严格性水平相对应的温度范围。上述范围和条件的变化是本领域熟知的。优选地，仅当序列之间具有至少95％、更优选至少97％的相同性时才应发生杂交。在一个优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码表现出与SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:3的成熟蛋白基本相同的生物学功能或活性的多肽。

如上所述，合适的多核苷酸探针可以具有至少14个碱基、优选30个碱基、并且更优选至少50个碱基，并如上所述，将与与其具有相同性的本发明的多核苷酸杂交。例如，这样的多核苷酸可用作与编码SEQ ID NO:3的多肽的多核苷酸(诸如SEQ ID NO:10的多核苷酸)分别杂交的探针，例如用于回收这样的多核苷酸，或用作诊断探针，或用作PCR引物。因此，本发明包括与编码SEQ ID NO:3的多肽的SEQ ID NO:10的多核苷酸具有至少70％的相同性、优选至少90％的相同性、更优选至少95％的相同性的多核苷酸，及其片段，该片段优选具有至少30个碱基、更优选至少50个碱基。

如本文可互换使用的，术语“同源性”或“相同性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性，其中相同性是更严格的比较。短语“相同性或同源性百分比”和“相同性或同源性”是指在两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列的比较中发现的序列相似性的百分比。“序列相似性”是指两个或多个多核苷酸序列之间的碱基对序列(如通过任何合适的方法确定)的相似性百分比。两个或多个序列可以在0-100％相似的任何地方，或是其间的任何整数值。可以通过比较每个序列中为了比较目的而可以比对的位置来确定相同性或相似性。当所比较序列中的位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置相同。多核苷酸序列之间的相似性或相同性程度是多核苷酸序列共有的位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。

多肽序列的相同性程度是多肽序列共有的位置处的相同氨基酸的数目的函数。多肽序列的同源性或相似性程度是多肽序列共有的位置处的氨基酸数目的函数。如本文所用，术语“基本上相同”是指至少70％、75％、至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性或同源性。

序列相同性的程度是通过选择一个序列作为查询序列，并使用blastp算法(NCBI)将其与具有从GenBank获取的同源序列用基于互联网的工具ClustalW进行比对来确定的。

如本领域中熟知的，遗传密码是冗余的，因为某些氨基酸由超过一个的核苷酸三联体(密码子)编码，并且本发明包括使用与本文的序列中具体例示的密码子不同的密码子编码相同氨基酸的那些多核苷酸序列。这样的多核苷酸序列在本文中称为“等价”多核苷酸序列。本发明进一步包括上述多核苷酸的变体，其对片段进行编码，诸如SEQ ID NO:3的多肽的部分或全部蛋白质、类似物和衍生物。多核苷酸的变体形式可以是多核苷酸的天然等位基因变体或多核苷酸的非天然存在的变体。例如，核酸中的变体可以简单地是由遗传密码的简并性导致的氨基酸的密码子序列差异，或者可以存在缺失变体、取代变体以及添加或插入变体。如本领域已知，等位基因变体是多核苷酸序列的替代形式，其可以具有基本上不改变所编码多肽的生物学功能的一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加。

本发明还包括载体(其包括这样的多核苷酸)、用这样的载体进行遗传工程化的宿主细胞，以及通过使用前述的重组技术来生产SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:3的多肽。用这样的载体对宿主细胞进行基因工程化(转导或转化或转接合或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、接合质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。载体或基因可以在特定或不特定位点整合入染色体。用于重组DNA的基因组整合的方法，诸如同源重组或转座酶介导的整合，是本领域熟知的。可以在常规营养培养基中培养工程化的宿主细胞，所述常规营养培养基经修饰以适合于激活启动子，选择转化体或扩增本发明的基因。培养条件，诸如温度、pH等，是选择用于表达的宿主细胞通常所使用的那些条件，如本领域普通技术人员熟知的。

表达

本发明的多核苷酸可用于通过重组技术产生SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQ ID NO:3的多肽。因此，例如，多核苷酸可以包含在多种表达载体中的任何一种中。

可通过各种操作将合适的DNA序列插入到载体中。通常，可以通过本领域已知的操作将DNA序列插入合适的(一个或多个)限制性酶切位点，该操作被认为在本领域技术人员的范围内。

表达载体中的DNA序列可操作地连接至合适的(一个或多个)表达控制序列(启动子)，以引导mRNA合成。作为此类启动子的代表性实例，可以提及：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac、ara、rha或trp，噬菌体λP_L启动子和其他已知用以控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

更优选地，本发明的GH11木聚糖酶可以使用以下工具表达：

尤其是在细菌宿主细胞中用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的具体实例是得自以下各项的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、经由xylA和xylB基因的枯草芽孢杆菌木糖基表达、普通应激蛋白的枯草芽孢杆菌sigma^B依赖性表达(gsiB)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978)以及tac启动子(DeBoer等人，1983)。还有，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的组成型启动子p43和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的hpall。其他启动子描述在“Useful proteins fromrecombinant bacteria”in Scientific American,1980,242:74-94；和Sambrook等人,1989中。上述启动子的杂合、双或三联组合及其突变和截短变体也是可能的。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是得自以下各项的基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(spergillusnidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自编码黑曲霉(Aspergillus niger)中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子已经被编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子得自以下各项的基因：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)，以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。在毕赤酵母属(Pichia)宿主中，有用的启动子得自毕赤酵母(Pichiapastoris)醇氧化酶(AOX1)和毕赤酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，一种被宿主细胞识别而终止转录的序列。该终止子序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3'末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用于本发明。优选的终止子结构来自例如解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)amyE基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)penP基因、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)bglS或apreE基因和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cry基因。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子得自以下各项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等人，1992描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的核苷酸序列的5'末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用于本发明。优选的非翻译区来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)amyE基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)penP基因、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)bglS或apreE基因、和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry基因。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。

用于酵母宿主细胞的合适前导序列得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接到核苷酸序列的3'末端，并且在转录时，被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号的序列。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列得自以下各项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995描述。

控制序列也可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端连接并指导编码多肽进入细胞的分泌途径的信号肽。核苷酸序列的编码序列的5'端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码分泌性多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'端可以包含相对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以将引导已表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌到培养基中)的任何信号肽编码序列用于本发明。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自以下各项的基因的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。Simonen和Palva，1993，以及Brockmeie等人，2006描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自以下各项的基因的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

酵母宿主细胞的有用信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他的有用的信号肽编码序列由上文提及的Romanos等人，1992描述。

控制序列也可以是编码位于多肽的氨基末端处的原肽(propeptide)的原肽编码序列。所得多肽已知为原酶或多肽原(或在一些情况下为酶原)。原肽通常是无活性的并且可以通过催化切割或自催化切割来自多肽原的原肽而转化为成熟的活性多肽。原肽编码序列可以得自以下各项的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶以及嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO 95/33836)。

在信号肽序列和原肽序列二者都存在于多肽的氨基末端的情况下，该原肽序列定位成紧邻多肽的氨基末端并且该信号肽序列定位成紧邻该原肽序列的氨基末端。

也可能期望的是加入调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统、GAL1系统或AOX1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。本文所述的各种核酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(几个)便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的核苷酸序列。可替代地，本发明的多核苷酸序列可以通过将核苷酸序列或包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体来表达。在产生该表达载体时，编码序列位于该载体中，使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是便利地经受重组DNA操作并且可引起核苷酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的(一个或多个)染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。

本发明的载体优选地包含一个或多个(几个)选择性标记，该标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等的基因(Kroll等人，2009)。这些营养缺陷型包括但不限于在氨基酸生物合成中分别地破坏或缺失丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。这些营养缺陷型还可以包括但不限于破坏或缺失嘌呤、嘧啶或酶辅因子生物合成基因。营养缺陷表型是游离互补的，其包括引起营养缺陷的突变基因的完整并表达的形式以及包含感兴趣的基因的表达盒。

细菌的选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等价物。优选在曲霉属(Aspergillus)细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的(一个或多个)元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以包含指导在(一个或多个)染色体的(一个或多个)精确位置通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的附加核苷酸序列。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选包含足够数量的核酸，诸如100至10,000个碱基对、优选400至10,000个碱基对、且最优选800至10,000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列相同性以提高同源重组的可能性。该整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组。

为了自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177以及pACYC184，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的超过一个拷贝插入宿主细胞以增加基因产物的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性物质的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此包含该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的操作是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989)。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其表达根据SEQ ID NO:1至3之一、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQ ID NO:3的酶。在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞包含选自SEQ ID NO:8至10、优选SEQ ID NO:9或10、最优选SEQ ID NO:10的多核苷酸的核苷酸分子。最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

产生方法

本发明在进一步的实施方案中提供了一种产生SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQ ID NO:3的酶的方法，该方法包括在允许产生酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞，并从培养物中回收酶。

更优选地，本发明提供了产生本发明的多肽(即SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQ ID NO:3的酶)的方法，包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养产生多肽的细胞；和(b)回收多肽。在一个优选的方面，所述细胞为芽孢杆菌(Bacillus)属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收多肽。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含酶的基因，更具体地，包含得自细菌的酶，更具体地根据SEQ ID NO:3的重组细菌的酶。

在本发明的产生方法中，在适于使用本领域熟知的方法产生多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中并在允许表达和/或分离多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的操作在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若该多肽分泌到营养培养基中，则该多肽能够从所述培养基中直接回收。若该多肽不分泌至培养基中，则其可从细胞裂解液回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于测定如本文中所述的多肽的活性。

所得多肽可使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规操作(包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从营养培养基中回收。

本发明的多肽可以通过本领域已知的各种操作纯化以获得基本上纯的多肽，该各种操作包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳操作(例如，制备型等电点聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,NewYork,1989)。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽(即SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQ ID NO:3的酶)的组合物。优选地，组合物富集这种多肽。术语“富集”表示该组合物的木聚糖酶活性已经提高，例如以至少1.1的富集系数提高。

多肽组合物可以根据本领域已知的方法来制备，并且可以是液体组合物或干燥组合物的形式。组合物中包含的多肽可根据本领域已知并且如以上所述的方来稳定化。

酶制备

本发明进一步提供了一种包含SEQ ID NO:1至3、优选SEQ ID NO:2或3、最优选SEQID NO:3的酶的酶制备物，其用于转化生物质或转化含半纤维素的材料。酶制备物优选为液体、粒状或团聚粉末的形式，更优选为粒状或团聚粉末的形式。

粒状或团聚的粉末优选具有窄的粒度分布，其中超过95％(重量)的颗粒在25至500微米的范围内。

颗粒和团聚的粉末可以通过常规方法制备，例如，通过将木聚糖酶喷到流化床制粒机中的载体上。载体可以由具有适当颗粒尺寸的颗粒核心组成。载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(诸如氯化钠或硫酸钠)、糖(诸如蔗糖或乳糖)、糖醇(诸如山梨糖醇)、寡糖(诸如麦芽糊精)、淀粉、水稻、玉米粗粉或大豆。

附图说明

参考附图在工作实施例中描述本发明的具体实施方案。

在本文中，

图1分别示出了SEQ ID NO:1至3的重组产生的酶的SDS-PAGE。将PageRulerPrestained Protein Ladder 10至180kDa(#26616，ThermoFisher Scientific)用作蛋白质标准品。

图2示出了相对于SEQ ID NO:1的野生型酶的酶活性的SEQ ID NO:3和2的多肽的相对酶活性增加(％)。令人惊奇地，与SEQ ID NO:1的野生型酶的酶活性相比，SEQ ID NO:3的酶显示出1.6倍更高的活性。酶活性：与SEQ ID NO:1的多肽的活性相比，用DNSA试验测定的每分钟每mg酶从阿拉伯木聚糖中释放的还原糖的量(微摩尔)。一式三份测量酶活性。

图3示出了在不同pH和温度条件下测试的多肽SEQ ID NO:3的相对酶活性。酶活性定义为用DNSA试验测定的每分钟每mg酶从阿拉伯木聚糖中释放的还原糖的量(微摩尔)，并与在70℃和pH 7.0的活性进行比较。一式三份测量酶活性。

图4示出了SEQ ID NO:3的多肽对模拟造粒过程的高温的耐性。酶活性被定义为用DNSA试验测定的每分钟每mg酶从阿拉伯木聚糖中释放的还原糖的量(微摩尔)，并且与未处理的酶的活性进行比较。在pH 6.5、60℃一式三份测量活性。

图5示出了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的多肽对抗酸处理的稳定性。为了体外模拟胃道，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的多肽在pH 3.5、40℃孵育30、60和120分钟。剩余活性通过DNSA试验测定，并与未处理的蛋白质的活性进行比较。酶活性被定义为用DNSA试验测定的每分钟每mg酶从阿拉伯木聚糖中释放的还原糖的量(微摩尔)，并且与未处理的酶的活性进行比较。在pH 6.5、70℃一式三份测量活性。

图6示出了SEQ ID NO:3中给出的多肽在40℃和pH 3.5对抗胃蛋白酶的蛋白水解消化的残余活性。通过在60℃和pH 6.5使用DNSA试验测量还原糖当量(微摩尔/分钟/mg酶)在阿拉伯木聚糖上的释放来测定残余活性。

图7示出了在体外鸡肠道模型中与Danisco木聚糖酶相比，SEQ ID NO:3的多肽使粘度降低。

图8示出了在没有酶或添加了不同酶的情况下小麦浆液化的时间：A：Teramyl3000L的α-淀粉酶25mg/kg(Novozymes)，B：α-淀粉酶25mg/kg和SEQ ID NO:3，C：α-淀粉酶25mg/kg、SEQ ID NO:3和内切葡聚糖酶SEQ ID NO:11(EP17203087)，D：α-淀粉酶25mg/kg、纤维素酶/半纤维素酶混合物Cellic CTec2(Novozymes)。在没有α-淀粉酶的情况下，未观察到液化(星号)。对于SEQ ID NO:3和11以及Cellic CTec2，使用等量的蛋白质(0.4mg/kg)。所有测量均一式三份进行。

工作实施例

实施例1：编码SEQ ID NO:1-3的G11木聚糖酶的根据SEQ ID NO:8至10的多核酸的克隆

材料

用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。大肠杆菌DH10Β用于常规克隆，并且大肠杆菌BL21 Star(DE3)用于表达SEQ ID NO:8的粪堆梭菌DSM8532。

DNA修饰

通过标准操作进行染色体和质粒DNA的制备、核酸内切酶消化和连接(Sambrook Jand Russell DW.2001)。

编码GH11木聚糖酶的基因的克隆

使用SEQ ID NO:4和5的引物组，根据制造商的说明书(Phusion High-FidelityDNA Polymerase,F530S,ThermoFisher Scientific)从粪堆梭菌DSM8532的染色体DNA中扩增具有SEQ ID NO:8至10的序列的基因。使用SEQ ID NO:2和3的GH11木聚糖酶，研究了不同蛋白质模块(即，CBM)缺失对酶活性和功能的影响。在SEQ ID NO:2的酶的多肽中缺失两个碳水化合物结合结构域，并且在SEQ ID NO:3的多肽中缺失所有三个碳水化合物结合模块。使用引物4和6扩增SEQ ID NO:9的多核苷酸，并使用引物4和7扩增SEQ ID NO:10的多核苷酸。随后通过Gibson组装(NEB,Cat.Nr.E2611S)在NdeI/XhoI消化的pET24c(+)载体(Novagen，MerckMillipore)中克隆所有PCR产物，并通过Eurofins测序以证实正确的序列。

实施例2：SEQ ID NO 1-3的酶的蛋白质生产

细胞的生长

在受控的并配备有Biostat B Twin DCU(Sartorius AG，Gottingen,Germany)的10L Uni-Vessel中进行含有来自SEQ ID NO:8的粪堆梭菌DSM8532的GH11木聚糖酶基因和新设计的基因SEQ ID NO:9和10的重组大肠杆菌菌株的补料分批发酵。在发酵期间在线监测温度、pH、泡沫、浊度、重量和溶解氧。溶解氧(DO％)设定为25％(体积/体积)，并以恒定气流利用增加搅拌来保持。泡沫的形成是通过添加消泡剂206(Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)而控制的。通过添加25％(体积/体积)的氢氧化铵溶液或25％(体积/体积)的HPO₄溶液保持pH为6.9。将大肠杆菌菌株在以10L规模的Riesenberg培养基(Korz等人，1995)中培养，进料溶液由1021g/L甘油、20g/L MgSO₄·7H₂O、13mg/L EDTA、4mg/L CoCl₂·6H₂O、23.5mg/L MnCl₂·4H₂O、2.5mg/L CuC1₂·2H₂O、5mg/L H₃BO₃、4mg/L Na₂MoO₄ x 2H₂O、16mg/L Zn(CH3COO)₂·2H₂O、40mg/L柠檬酸Fe(III)组成(Korz等人，1995)。在消耗初始碳水化合物底物后，根据方程1来控制生长速率，其中m_S是底物的质量流量(g h^-l)，μ_set为期望比生长速率(h^-l)，Y_X/S为生物质/底物收率系数(g g^-1)，m为比维持系数(g g^-1h^-l)，V为培养体积(L)，且X为生物质浓度(g L^-1)：

方程1

接种操作如下：基于冷冻原液，制备了含有足够抗生素的新鲜琼脂平板。利用一个菌落，在含有30mL Lysogeny培养液(Sambrook等人，1989)的锥形烧瓶中进行接种，并在30℃孵育12至15h。将30mL的该第一预培养物用于接种到5L锥形烧瓶中的500mL发酵培养基中，并另外孵育14小时。在10L发酵罐中装入6L发酵培养基，并接种500mL第二预培养物。以50μg/mL添加卡那霉素。通过将甘油进料改为乳糖进料来诱导蛋白质产生。通过在9000rpm和22℃离心1h而在48h后收获细胞。将300g细胞的部分溶于3L裂解缓冲剂(50mM MOPS pH7.3、0.1M NaCl、20mM咪唑)中。细胞裂解是通过在超声流经腔室中进行超声处理而实现的。通过离心(9000rpm，22℃)分离细胞碎片。通过应用0.2μm过滤盒进行切向过滤并用裂解缓冲剂进行三体积洗涤，从残留的细胞或碎片中澄清上清液。通过用30kDa过滤盒进行切向过滤来浓缩酶溶液，然后用三体积的裂解缓冲剂进行透析。将GH11木聚糖酶通过固定金属离子亲和色谱法(IMAC)纯化。用含有50mM MOPS pH 7.3、0.25M咪唑、0.1M NaCl和20mM CaCl₂的洗脱缓冲剂来洗脱纯酶。

产生SEQ ID NO:1酶的变体(诸如本发明的SEQ ID NO:2或3的酶)的另一种可能性是用包含突变DNA的合适载体来转化感受态枯草芽孢杆菌菌株并根据Park等人，1991培养重组菌株。

实施例3：电泳方法

根据Laemmli(1970)进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质重悬于变性缓冲剂中，并在95℃加热15分钟。将PageRuler Prestained Protein Ladder 10至180kDa(#26616，ThermoFischer Scientific)用作分子量标准。将蛋白质用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R-250染色(Weber and Osbourne，1969)。

实施例4：蛋白质定量

根据制造商的说明书，使用Pierce^TMBCA蛋白质测定试剂盒(#23225，ThermoFisherScientific)测定蛋白质的量。

实施例5：活性测试，阿拉伯木聚糖降解

木聚糖酶活性

出于本发明的目的，任何可商购的木聚糖酶活性测量试剂盒均适合于测定木聚糖酶活性。一种合适的测量木聚糖酶活性的方法如下：

用最终浓度为0.86％(重量/体积)的阿拉伯木聚糖(小麦阿拉伯木聚糖，中等粘度，Megazyme，Ireland)、反应缓冲剂(100mM MOPS、pH 6.5、50mM NaCl、10mM CaCl₂)和适量酶进行木聚糖酶活性测量。如Wood和Bhat(1988)所述，使用3,5-二硝基水杨酸(DNSA)进行还原糖的定量。基于葡萄糖的校准曲线测定所释放的还原糖端的量。1个单位(U)定义为在一分钟内释放一微摩尔还原糖当量所需的酶的量。所有测定至少一式三份进行。

如实施例1-4中所述来生产、纯化和定量SEQ ID NO:1的粪堆梭菌木聚糖酶和SEQID NO:2和3的变体。以U/mmol计算SEQ ID NO:1-3的酶的比活性。结果以与亲本酶SEQ IDNO:1的比率计算。图1示出了与SEQ ID NO:1的亲本蛋白质的尺寸相比，SEQ ID NO:2和3的酶的尺寸。与亲本酶SEQ ID NO:1相比，变体酶SEQ ID NO:2和3分别具有57％和35％的尺寸减小(图1)。相对于各个酶的摩尔质量的酶比活性的计算表明，与SEQ ID NO:1的酶比活性，SEQ ID NO:2的酶比活性由尺寸差异很好地反映。然而，令人惊奇地，与SEQ ID NO:1和2的多肽的酶比活性相比，SEQ ID NO:3的变体显示出至少1.6倍的酶比活性(图2)，这不对应于尺寸改变(图1)。令人惊奇地，所有碳水化合物结合模块的缺失导致酶活性的增加。

使用活性测定来定义SEQ ID NO:3在宽温度范围内(25℃至90℃)和pH4.0-10.0的活性谱。在70℃和pH 7.0测量的酶活性设定为100％。我们在pH 5.0至9.5的宽pH范围内鉴定了35℃至85℃的足够酶活性(40％或更高)(图3)，表明了用于不同工业应用的合适谱。

实施例6：SEQ ID NO:1-3的多肽的热稳定性(Tm_on和Tm₅₀)

为了测定SEQ ID NO:1-3变体的物理稳定性，应用了差示扫描荧光法(DSF)。在20μl 50mM的K-磷酸钾缓冲剂(pH 7.0，50mM NaCl和5x Sypro^TMOrange(Thermo FisherScientific))中将蛋白质稀释至0.1mg/ml的浓度以用于DSF。在Bio-Rad Real-Time PCRCF X96 Touch^TMReal-Time PCR检测系统中进行测量。为此目的，将样品在25℃平衡3分钟，然后以2℃/min的速率(ramp)加热至98℃。在HEX通道中检测发射的荧光(例如：Ex.：525±10nm；Em.:575±15nm)。为了测定Tm₅₀，使用GraphPad Prism v6通过Niesen等人(2007)描述的Boltzmann方程通过非线性回归来分析实验数据。

Tm₅₀描述了50％蛋白质变性的温度。这对应于具有最大斜率的X轴截距。当1％的总蛋白变性时，蛋白变性的开始由Tm_on描述，并如Menzen和Friess(2013)所述用从Boltzmann方程获得的值测定。

表1：多肽SEQ ID NO:1-3的熔点的测定

	(SEQ ID NO:1)	(SEQ ID NO:2)	(SEQ ID NO:3)
				Tm<sub>50</sub>[℃]	82,9±0,57	82,8±0,8	85,7±0,21
Tm<sub>on</sub>[℃]	67,0±0,04	63,5±0,25	81,2±0,27

Tm₅₀和Tm_on都反映了酶的热稳定性。在缺失所有碳水化合物结合模块的情况下，SEQ ID NO:3的多肽的Tm_on增加至81.2℃，其与SEQ ID NO:1的野生型酶相比增加超过10℃。另外，通过缺失所有CBM可以实现Tm₅₀增加至85.7℃，使得SEQ ID NO:3比SEQ ID NO:1更热稳定。

实施例7：SEQ ID NO:3的多肽的热稳定性(TM)

通过间接测量热稳定性，可以以温度的函数来测量酶失活。在此，将酶样品在没有底物的情况下在各种温度孵育限定的时间段，例如5分钟，并且在孵育之后测定在允许温度的残余活性。相对于未在升高的温度孵育的酶样品计算每个温度的残余活性。所得热变性谱(温度对残余活性)可用于计算获得50％残余活性时的温度。该值被定义为Tm值。Tm值是5分钟孵育后获得50％残余活性时的温度。将多肽SEQ ID NO:3在pH 6.5，在80、85、90和95℃预孵育30、60和300秒。之后，在如实施例5所述的标准条件测定酶活性，并分别与SEQ IDNO:3的未处理多肽进行比较。对于SEQ ID NO:3，Tm值在85℃和90℃之间(图4)。在饲料丸粒的造粒期间，在相对短的时间段内施加高温(例如，30秒，在约80℃，WO2008063309)。如图4所示，酶SEQ ID NO:3显示80％或更高的酶活性，甚至当温度暴露多达60秒和高达95℃时。因此，SEQ ID NO:3的多肽完全满足造粒方法的要求。

实施例8：耐酸处理性

为了体外模拟家禽的胃道中存在的条件，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的多肽在pH 3.5、40℃孵育30、60和120分钟。通过DNSA试验测定剩余活性并与根据实施例5的未处理蛋白质的活性比较，除了温度变为70℃。亲本酶SEQ ID NO:1随着酸处理延长显示酶活性降低。令人惊奇地，对于缺乏碳结合基序的酶SEQ ID NO:3，该效果大大地降低(图5)。即使在鸡肠中存在的条件下，在模拟通过胃道后，可以恢复超过70％的初始活性。

实施例9：耐蛋白水解性

通过将酶与50U/ml来自胃粘膜的胃蛋白酶(Sigma-Aldrich)在40℃在孵育缓冲剂(pH 3.5；50mM NaCl)中孵育30分钟和60分钟来测试SEQ ID NO:3对抗胃蛋白酶的蛋白水解稳定性。如实施例5所述测定残余活性，并示于图6中。延长的胃蛋白酶消化不影响酶活性，并且在胃蛋白酶的酶消化2小时后可恢复大于85％的残余活性。

实施例10：体外鸡肠道模型中粘度降低

为了实验证明动物饲料丸粒的生产和动物饲料丸粒的胃肠道通过，选择以下操作：将酶与磨碎的饲料混合并在水浴中在95℃加热2分钟。如Bedford和Classen(1993年)所述进行胃通过的模拟。通过在40℃和pH 3.0用胃蛋白酶孵育饲料酶混合物45分钟来测试蛋白酶消化。在40℃和pH 6.8模拟饲料酶混合物通过小肠环境的通过，持续2小时，然后在球形粘度计中测定粘度。针对SEQ ID NO:3使用相同的单位数目，并且Danisco木聚糖酶用于比较，所述Danisco木聚糖酶可以购自分销商诸如Biochem Zusatzstoffe Handels-undProduktionsgesellschaft mbH。SEQ ID NO:3获得了等价的结果，因此显示出其在该体外试验中的有效性。(也参见图7)

实施例11：小麦浆的粘度降低

在第一代乙醇生产中，小麦浆是重要的工业糖源。在开始时，在高温(＞70℃)进行打浆以避免微生物污染。为了降低不希望的高粘度并使淀粉可获得性成为可能，在该方法的早期将木聚糖酶和纤维素酶与淀粉水解α淀粉酶一起加入。为了保持浆处于可泵送和可混合的状态，粘度的快速降低是迫切需要的，并且需要在高温具有稳健活性的木聚糖酶。

为了证明SEQ ID NO:1至3的多肽在高温降低粘度的能力，将250g击碎的小麦用500mL沸水捣成糊状。在获得均相浆后，加入不同的酶：25mg/kg Teramyl 300，一种来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich，A4862)；0.4mg/kg SEQ ID NO:3；0.4mg/kg的半纤维素酶/纤维素酶混合物(80％SEQ ID NO:3，和20％的来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)的修饰的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:11，EP17203087)，或0.4mg/kg CellicCTec2(Sigma-Aldrich，SAE0020 SIGMA)。在配备有一个Rushton叶轮的搅拌釜反应器(BIOSTAT Single,2L Univessel)中在70℃夹套温度和1000rpm按照完成液化的时间来监测粘度降低。在没有任何酶的情况下，没有观察到液化。由于计算的原因，使用Teramyl300L完成液化的时间设置为100％。Teramyl300L和SEQ ID NO:3的多肽的组合导致液化时间减少40％。使用Teramyl300L、SEQ ID NO:3的多肽和来自热纤梭菌的另外的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:11,EP17203087)可以实现60％的降低，而以相同的剂量加入的市售纤维素/半纤维素混合物Cellic CTec2显示没有效果(图8)。

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序列表

<110> 慕尼黑工业大学

<120> 具有改善的热稳定性和对阿拉伯木聚糖增加的酶活性的新木聚糖酶

<130> MTU108WO

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 621

<212> PRT

<213> Clostridium stercorarium

<400> 1

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260 265 270

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275 280 285

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<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic or recombinant polypeptide

<400> 2

Gly Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp

1 5 10 15

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Gly Gly Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe

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Arg Lys Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr

85 90 95

Ile Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys Met

165 170 175

Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ala

180 185 190

Asn Val Tyr Lys Asn Glu Ile Arg Ile Gly Ala Asn Pro Thr Pro Ala

195 200 205

Pro Ser Gln Ser Pro Ile Arg Arg Asp Ala Phe Ser Ile Ile Glu Ala

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Glu Glu Tyr Asn Ser Thr Asn Ser Ser Thr Leu Gln Val Ile Gly Thr

225 230 235 240

Pro Asn Asn Gly Arg Gly Ile Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Asn Thr Val

245 250 255

Thr Tyr Ser Asn Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ser Ala

260 265 270

Thr Val Ala Thr Glu Val Asn Thr Ser Ile Gln Ile Arg Ser Asp Ser

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Pro Thr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Leu Tyr Val Ser Ser Thr Gly Ser

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<213> Artificial sequence

<220>

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Gly Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp

1 5 10 15

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20 25 30

Gly Gly Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe

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Arg Lys Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly

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Asp Ile Val Val Glu Tyr Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser

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Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr

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Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Glu Ile Tyr Glu Thr Thr

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Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Ala Thr Phe Gln Gln Tyr

130 135 140

Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys Met

165 170 175

Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ala

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

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ttaagaagga gatatacata tggggcgaat aatttacgac aatg 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 5

gtggtggtgg tggtgctcga gagttcctga ttttgagaat acaa 44

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 6

atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tgaacttctg ctaaatatga ag 52

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 7

atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag atttgcacct attctgattt c 51

<210> 8

<211> 1863

<212> DNA

<213> Clostridium stercorarium

<400> 8

gggcgaataa tttacgacaa tgagacaggc acacatggag gctacgacta tgagctctgg 60

aaagactacg gaaatacgat tatggaactt aacgacggtg gtacttttag ttgtcaatgg 120

agtaatatcg gtaatgcact atttagaaaa gggagaaaat ttaattccga caaaacctat 180

caagaattag gagatatagt agttgaatat ggctgtgatt acaatccaaa cggaaattcc 240

tatttgtgtg tttacggttg gacaagaaat ccactggttg aatattacat tgtagaaagc 300

tggggcagct ggcgtccacc tggagcaaca cccaaaggaa ccatcacagt ggatggcggt 360

acttatgaaa tatatgaaac tacccgggta aatcagcctt ccatcgatgg aactgcgaca 420

ttccaacaat attggagtgt tcgtacatcc aagagaacaa gcggaacaat atctgtcact 480

gaacatttta aacagtggga aagaatgggc atgcgaatgg gtaagatgta tgaagttgct 540

cttaccgttg aaggttatca gagcagtggg tacgctaatg tatacaagaa tgaaatcaga 600

ataggtgcaa atccaactcc tgccccatct caaagcccaa ttagaagaga tgcattttca 660

ataatcgaag cggaagaata taacagcaca aattcctcca ctttacaagt gattggaacg 720

ccaaataatg gcagaggaat tggttatatt gaaaatggta ataccgtaac ttacagcaat 780

atagattttg gtagtggtgc aacagggttc tctgcaactg ttgcaacgga ggttaatacc 840

tcaattcaaa tccgttctga cagtcctacc ggaactctac ttggtacctt atatgtaagt 900

tctaccggca gctggaatac atatcaaacc gtatctacaa acatcagcaa aattaccggc 960

gttcatgata ttgtattggt attctcaggt ccagtcaatg tggacaactt catatttagc 1020

agaagttcac cagtgcctgc acctggtgat aacacaagag acgcatattc tatcattcag 1080

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ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt tattccacta cctataataa cgttaatttc 1200

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gtgagagcag gaggagcaac cggtacttta cttggtacaa tatatgttcc ttcgacaaat 1320

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ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt tattccacta cctataaaaa tattgatttt 1620

ggtgacggcg caacgtccgt aacagcaaga gtagctaccc agaatgctac taccattcag 1680

gtaagattgg gaagtccatc gggtacatta cttggaacaa tttacgtggg gtccacagga 1740

agctttgata cttataggga tgtatccgct accattagta atactgcggg tgtaaaagat 1800

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act 1863

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 9

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aaagactacg gaaatacgat tatggaactt aacgacggtg gtacttttag ttgtcaatgg 120

agtaatatcg gtaatgcact atttagaaaa gggagaaaat ttaattccga caaaacctat 180

caagaattag gagatatagt agttgaatat ggctgtgatt acaatccaaa cggaaattcc 240

tatttgtgtg tttacggttg gacaagaaat ccactggttg aatattacat tgtagaaagc 300

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acttatgaaa tatatgaaac tacccgggta aatcagcctt ccatcgatgg aactgcgaca 420

ttccaacaat attggagtgt tcgtacatcc aagagaacaa gcggaacaat atctgtcact 480

gaacatttta aacagtggga aagaatgggc atgcgaatgg gtaagatgta tgaagttgct 540

cttaccgttg aaggttatca gagcagtggg tacgctaatg tatacaagaa tgaaatcaga 600

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ataatcgaag cggaagaata taacagcaca aattcctcca ctttacaagt gattggaacg 720

ccaaataatg gcagaggaat tggttatatt gaaaatggta ataccgtaac ttacagcaat 780

atagattttg gtagtggtgc aacagggttc tctgcaactg ttgcaacgga ggttaatacc 840

tcaattcaaa tccgttctga cagtcctacc ggaactctac ttggtacctt atatgtaagt 900

tctaccggca gctggaatac atatcaaacc gtatctacaa acatcagcaa aattaccggc 960

gttcatgata ttgtattggt attctcaggt ccagtcaatg tggacaactt catatttagc 1020

agaagttca 1029

<210> 10

<211> 612

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic or recombinant polynucleotide

<400> 10

gggcgaataa tttacgacaa tgagacaggc acacatggag gctacgacta tgagctctgg 60

aaagactacg gaaatacgat tatggaactt aacgacggtg gtacttttag ttgtcaatgg 120

agtaatatcg gtaatgcact atttagaaaa gggagaaaat ttaattccga caaaacctat 180

caagaattag gagatatagt agttgaatat ggctgtgatt acaatccaaa cggaaattcc 240

tatttgtgtg tttacggttg gacaagaaat ccactggttg aatattacat tgtagaaagc 300

tggggcagct ggcgtccacc tggagcaaca cccaaaggaa ccatcacagt ggatggcggt 360

acttatgaaa tatatgaaac tacccgggta aatcagcctt ccatcgatgg aactgcgaca 420

ttccaacaat attggagtgt tcgtacatcc aagagaacaa gcggaacaat atctgtcact 480

gaacatttta aacagtggga aagaatgggc atgcgaatgg gtaagatgta tgaagttgct 540

cttaccgttg aaggttatca gagcagtggg tacgctaatg tatacaagaa tgaaatcaga 600

ataggtgcaa at 612

<210> 11

<211> 534

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant polypeptide

<400> 11

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50 55 60

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Ala Val Pro Gly Val Gly Lys Ser Val Asn Phe Lys Ile Ala Met Asn

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130 135 140

Gln His Thr Lys Lys Asp Ser Thr Lys Gly Trp His Asp Ala Gly Asp

145 150 155 160

Tyr Asn Lys Tyr Val Val Asn Ala Gly Ile Thr Val Gly Ser Met Phe

165 170 175

Leu Ala Trp Glu His Phe Lys Asp Gln Leu Glu Pro Val Ala Leu Glu

180 185 190

Ile Pro Glu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Phe Leu Asp Glu Leu Lys

195 200 205

Tyr Glu Ile Asp Trp Ile Leu Thr Met Gln Tyr Pro Asp Gly Ser Gly

210 215 220

Arg Val Ala His Lys Val Ser Thr Arg Asn Phe Gly Gly Phe Ile Met

225 230 235 240

Pro Glu Asn Glu His Asp Glu Arg Phe Phe Val Pro Trp Ser Ser Ala

245 250 255

Ala Thr Ala Asp Phe Val Ala Met Thr Ala Met Ala Ala Arg Ile Phe

260 265 270

Arg Pro Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Glu Lys Cys Ile Asn Ala Ala Lys

275 280 285

Val Ser Tyr Glu Phe Leu Lys Asn Asn Pro Ala Asn Val Phe Ala Asn

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Gln Ser Gly Phe Ser Thr Gly Glu Tyr Ala Thr Val Ser Asp Ala Asp

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Asp Arg Leu Trp Ala Ala Ala Glu Met Trp Glu Thr Leu Gly Asp Glu

325 330 335

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Ile Glu Ala Asp Phe Asp Trp Asp Asn Val Ala Asn Leu Gly Met Phe

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Ser Ile Lys Asp Ser Leu Leu Ser Thr Ala Asp Ser Ile Val Arg Thr

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Ser Gln Asn His Gly Tyr Gly Arg Thr Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Trp

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420 425 430

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<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 12

gcaaaaataa cggagaatta tcaatttgat tcacgaatcc gtttaaactc aataggtttt 60

ataccgaacc acagcaaaaa ggcgactata gctgcaaatt gttcaacctt ttatgttgtt 120

aaagaagacg gaacaatagt gtataccgga acggcaactt caatgtttga caatgataca 180

aaagaaactg tttatattgc tgatttttca tctgttaatg aagaaggaac gtactatctt 240

gccgtgccgg gagtaggaaa aagcgtaaac tttaaaattg caatgaatgt atatgaggat 300

gcttttaaaa cagcaatgct gggaatgtat ttgctgcgct gcggcaccag tgtgtcggcc 360

acatacaacg gaatacacta ttcccatgga ccgtgccata ctaatgatgc atatcttgat 420

tatataaacg gacagcatac taaaaaagac agtacaaaag gctggcatga tgcgggcgac 480

tacaacaaat atgtggtaaa cgccggcata accgttggtt caatgttcct ggcgtgggag 540

cattttaaag accagttgga gcctgtggca ttggagattc ccgaaaagaa caattcaata 600

ccggattttc ttgatgaatt aaaatatgag atagactgga ttcttaccat gcaataccct 660

gacgggagcg gaagggtggc tcataaagtt tcgacaagga actttggcgg ctttatcatg 720

cctgagaacg aacacgacga aagatttttc gtgccctgga gcagtgccgc aacggcagac 780

tttgttgcca tgacggccat ggctgcaaga atattcaggc cttatgatcc tcaatatgct 840

gaaaaatgta taaatgcggc aaaagtaagc tatgagtttt tgaagaacaa tcctgcgaat 900

gtttttgcaa accagagtgg attctcaaca ggagaatatg ccactgtcag tgatgcagat 960

gacagattgt gggcggcggc tgaaatgtgg gagaccctgg gagatgaaga ataccttaga 1020

gattttgaaa acagggcggc gcaattctcg aaaaaaatag aagccgattt tgactgggat 1080

aatgttgcaa acttaggtat gtttacatat cttttgtcag aaagaccggg caagaatcct 1140

gctttggtgc agtcaataaa ggatagtctc ctttccactg cggattcaat tgtgaggacc 1200

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acggttgtaa gacagactat gatacttcag gttgcgaaca agatttcacc caacaatgat 1320

tatgtaaatg ctgctctcga tgcgatttca catgtatttg gaagaaacta ttacaacagg 1380

tcttatgtaa caggccttgg tataaatcct cctatgaatc ctcatgacag acgttcaggg 1440

gctgacggaa tatgggagcc gtggcccggt taccttgtag gaggaggatg gcccggaccg 1500

aaggattggg tggatattca ggacagttat cagaccaatg aaattgctat aaactggaat 1560

gcggcattga tttatgccct tgccggattt gtcaactata at 1602

Claims

1.一种多肽，其包含与根据SEQ ID NO:2或3、优选SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽或由与根据SEQ ID NO:2或3、优选SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽组成，其中所述多肽具有木聚糖酶活性，并且前提条件是所述多肽不是SEQ ID NO:1的多肽；其特征在于，与SEQ ID NO:1的多肽相比，所述多肽显示出改善的热稳定性和/或耐酸处理性和/或增加的酶活性，其中

-改善的热稳定性意指所述多肽显示出70℃或更高的Tm_on，和/或显示出80℃或更高的Tm₅₀，和/或显示出80℃或更高的Tm；

-改善的耐酸处理性意指在低pH，诸如2.5至5.5的pH处理后保留至少70％的酶活性；且

-增加的酶活性意指酶比活增加至少1.6倍。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽或由与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％的氨基酸序列相同性的多肽组成，并且其中所述SEQ ID NO:3的多肽显示出1.6倍的酶比活性增加和81.2℃的Tm_on和/或85.7℃的Tm₅₀。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽在5.5至9.5的pH范围内和/或在37℃至80℃的温度范围内显示出至少40％的酶活性，特别是木聚糖酶活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中在2.0至5.5的pH范围内酸处理所述多肽之后保留所述酶活性。

5.一种核酸分子，其由编码根据SEQ ID NO:2或3的多肽的SEQ ID NO:9或10的核酸序列组成。

6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的SEQ ID NO:9或10的核酸序列或者权利要求6所述的表达载体，其中所述宿主细胞表达根据SEQ ID NO:2或3的多肽。

8.一种产生SEQ ID NO:2或3、优选SEQ ID NO:3的多肽的方法，所述方法包括在允许产生所述多肽的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，并从培养物中回收所述多肽。

9.一种组合物，其用于添加到生物质或含半纤维素的材料中，所述组合物包含权利要求1所述的多肽，和任选包含至少一种配制剂、赋形剂、稳定剂和/或防腐剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物是液体制剂诸如溶液或悬浮液，或干燥制剂诸如粉末或颗粒。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中所述组合物包含作为热稳定剂的糖，所述糖例如选自蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、毛蕊花糖、蜜二糖、三氯蔗糖或棉子糖，或者当所述组合物是液体制剂时，包含溶剂，诸如甘油或水。

12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽或组合物，其中所述多肽改变半纤维素组分的含量，特别是木聚糖含量，以使例如致密结构松弛或降低生物质或含半纤维素的材料的高粘度。

13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽或组合物在生产动物饲料、纸浆和纸、生物能以及在酿造或麦芽制造中的用途。