JP3435946B2 - 耐熱性キシラナーゼ - Google Patents

耐熱性キシラナーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な耐熱性キシ
ラナーゼ、その製造方法及びその用途、耐熱性キシラナ
ーゼ遺伝子並びに耐熱性キシラナーゼを生産する微生物
に関する。
【０００２】
【従来の技術】キシラナーゼはキシランを分解する酵素
であり、製紙用パルプの漂白前処理用酵素として、又は
機能性キシロオリゴ糖の製造用として用いられる有用酵
素である。Viikari らがキシラナーゼによりクラフトパ
ルプの漂白性が向上することを報告（3rd internationa
l conference on biotechnology in the pulp and pape
rindustry 1986年講演要旨集 p.67）して以来、紙パル
プ産業においてキシラナーゼが注目され始めているが、
パルプ製造工程中にはクラフト蒸解や漂白工程等高温条
件が多いことから、これらの工程中に効率よくキシラナ
ーゼを用いるにあたっては耐熱性の高いキシラナーゼが
求められている。耐熱性キシラナーゼを用いることで、
高温での酵素反応が可能になるために冷却の設備やエネ
ルギーが削減できると共に酵素反応中の雑菌の繁殖も防
ぐことができるからである。
【０００３】一方、微生物の有する酵素生産能力が高い
方が酵素製造のコストダウンに有利であることは自明で
ある。そこで、耐熱性の高いキシラナーゼとその酵素を
高生産する微生物が求められている。キシラナーゼを生
産する微生物としてはキシラナーゼの総説（Wong et a
l.,Microbiological Reviews, Sept.,305,1988）等によ
れば、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデル
マ（Trichoderma）属、アウレオバシデウム（Aureobasi
dium）属、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）等
の糸状菌、バチルス（Bacillus）属やクロストリジウム
（Clostridium）属、ストレプトミセス（Streptomyce
s）属等の細菌類等数多くの微生物が知られている。そ
して、これらの微生物から生産されるキシラナーゼの反
応ｐＨは酸性乃至中性、反応温度は40℃〜80℃である。
また、アルカリ側で活性を有するアルカリキシラナーゼ
を生産する微生物も知られており、例えば、バチルス
（Bacillus）属（Honda et al.,System.Appl.Microbio
l.,8,152,1986,Okazaki et al.,Appl.Microbiol.and Bi
otechnol.,19,335,1984）、アエロモナス（Aeromonas）
属（Ohkoshi et al.,Agric.Biol.Chem.,49,3037,1985）
又はストレプトミセス（Streptomyces）属（Vyas et a
l.,Biotechnol.Let.,12,225,1990）に属する微生物等が
知られている。
【０００４】これらのキシラナーゼを生産する微生物の
うち、糸状菌では、キシラナーゼの他にセルラーゼを生
産するものが多く、紙パルプ製造工程に使用する上で紙
の収率や強度の低下をきたす恐れがある等の問題点があ
る。しかも、糸状菌は細菌に比べて培養期間が長い。ま
た、細菌ではキシラナーゼ生産性が低いという問題点が
ある。
【０００５】近年、Viikari らは、耐アルカリ性のバチ
ルス・サーキュランス（Bacillus circulans）VTT-E-87
305 株を用い、ｐＨ８〜8.5、30℃、２日間の培養で高
収量（400U/ml）のキシラナーゼを生産させたことを報
告している（Appl.Microbiol.Biotechnol.,37,470,199
2）。しかし、この酵素についての耐熱性は明らかでは
なく、培養温度も30℃と低いことから、高温下での酵素
反応を行うことは困難である。
【０００６】一方、バチルス属に属する微生物の生産す
る耐熱性キシラナーゼの精製については、好アルカリ好
熱性バチルスＷ−１およびＷ−２から、分子量21,500、
等電点8.5、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ１
−Ｉ耐熱性キシラナーゼ、及び、分子量22,500、等電点
8.3、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ２−Ｉ耐
熱性キシラナーゼがそれぞれ報告されている（Okazaki
et al.,Agric.Biol.Chem.,49,2033,1985）。
【０００７】また、好熱性バチルスとして知られるバチ
ルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearotherm
ophilus)については、T.Nanmori らがStrain 21 の培養
濾液から分子量39,500、等電点5.1、反応至適ｐＨ7.0、
反応至適温度60℃の耐熱性キシラナーゼを精製し、生産
したことを報告している（J.Bacteriol.,172,6669,199
0）。しかし、その生産量は55℃、２日間の培養で1.96
U/ml に過ぎない。
【０００８】さらに、キシラナーゼの利用法について、
パルプにキシラナーゼを作用させて漂白薬品やＡＯＸ
（吸着性有機ハロゲン化合物、特に有機塩素化合物）を
低減させようとする試みがいくつか報告されている（例
えば、特開平2-210085号公報、特開平2-210086号公報、
特開平2-221482号公報、特開平2-264087号公報、特開平
2-293486号公報、特開平3-40887 号公報、特開平3-5057
85号公報、L.S.Pedersonet al.,Production of bleache
d chemical pulp in the future internationalpulp bl
eaching conference, Vol.2,107,1991、紙パルプ技術タ
イムズ,5,20,1992、S. Hogman et al.,Biotechnology i
n Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co.,Lt
d.,p.107,1992、Viikari et al.,Biotechnology in Pul
p and Paper Industry, Uni Publishers Co.,Ltd.,p.10
1,1992）。
【０００９】しかし、これらの試みでは、紙パルプ製造
工程における漂白工程では40〜100℃の高温処理が必要
とされる一方、その工程中に酵素処理を組み込むために
耐熱性を持たない酵素を使用しなければならないことも
多く、この場合は、その反応至適温度までパルプを冷却
し、また次の工程のために加温しなければならず、多大
なエネルギーが必要になる。
【００１０】従って、高温条件下で製造することによっ
て冷却設備を不要とするか又は冷却水の節約を可能と
し、しかも雑菌混入の可能性を少なくさせ、低コストで
製造することが可能な酵素である耐熱性のキシラナーゼ
が望まれている。さらに、遺伝子組換え技術により耐熱
性キシラナーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子
を発現させることによりキシラナーゼを大量に得ること
も望まれている。
【００１１】キシラナーゼ遺伝子については現在までに
多数の報告がなされている。例えば、細菌由来について
はバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans; YA
NG R.C.A. et al., NUCLEIC ACIDS RES. 16:7187-7187
(1988)) 、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis;
PAICE M.G. et al., ARCH.MICROBIOL.144:201-206(198
6)) 、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomona
s fluorescens; KELLETT L.E. et al.,BIOCHEM.J.272:3
69-376(1990)) およびルミノコッカス・フラベファシエ
ンス (Ruminococcus flavefaciens; ZHANG J.-X. et a
l., MOL.MICROBIOL. 6:1013-1023(1992) などが、カビ
由来についてはクロストリジウム・アセトブチリカム
(Clostridium acetobutylicum; ZAPPE. et al., NUCLEI
C ACIDS RES. 18:2179-2179-(1990))、アスペルギルス
・アワモリ (Aspergillus awamori; ITO K. et al., BI
OSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM. 56:1338-1340(1992))および
ストレプトミセス・リビダンス (Streptomyces lividan
s; SHARECK F. et al., GENE 107:75-82(1991)) などが
ある。しかしながら、これらの遺伝子を用いた組換え体
により製造された酵素は、漂白に適したものであるか否
か明らかでない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な耐熱
性キシラナーゼ、その製造方法及びその用途、耐熱性キ
シラナーゼ遺伝子並びに耐熱性キシラナーゼを生産する
微生物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決しようとする手段】本発明者らは上記課題
に基づいて鋭意研究を行い、耐熱性キシラナーゼ高生産
菌を求め、鋭意広範なスクリーニングを行なった結果、
東京都江東区東雲の土壌中から耐熱性キシラナーゼを生
産する微生物を見い出し、該微生物の培養物中から耐熱
性において優れた性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ
１及びＸＰ２を見い出し、更に該耐熱性キシラナーゼを
コードする遺伝子をクローニングし、高発現させること
に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】すなわち、本発明は、以下の理化学的性質
を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１又はＸＰ２から選ば
れる耐熱性キシラナーゼである。
【００１５】（１）以下の理化学的性質を有する耐熱性
キシラナーゼＸＰ１（以下、単にＸＰ１という）。 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００１６】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００１７】 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にあ
る。 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活
性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活
性を示す。
【００１８】 等電点：8.1付近である。 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定した結果、約22,500である。 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受
け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害される。
【００１９】（２）以下の理化学的性質を有する耐熱性
キシラナーゼＸＰ２（以下、単にＸＰ２という）。 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成
する。
【００２０】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
【００２１】 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至
適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜
９である。 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にある。 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％の残存活性を
示す。
【００２２】 等電点：8.5付近である。 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定した結果、約32,000である。 阻害：Mn2+、Co2+、Cu2+、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸に
より弱く阻害を受け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害され
る。
【００２３】さらに、本発明は、上記耐熱性キシラナー
ゼを生産するバチルス（Bacillus）属に属する微生物を
培地に培養し、得られる培養物から該耐熱性キシラナー
ゼを採取することを特徴とする前記耐熱性キシラナーゼ
の製造方法である。ここで、微生物としては、例えばバ
チルス・エスピー２１１３又はバチルス・エスピー２０
８が挙げられる。
【００２４】さらに、本発明は、耐熱性キシラーゼの生
産能を有するバチルス・エスピー２１１３又はバチルス
・エスピー２０８である。さらに、本発明は、配列番号
１で表されるアミノ酸配列を実質的にコードする塩基配
列又は配列番号２で表される塩基配列を実質的に含む耐
熱性キシラナーゼ遺伝子である。
【００２５】ここで、「実質的に」とあるのは、このペ
プチドが耐熱性キシラナーゼ酵素活性を有する限り、又
は塩基配列が耐熱性キシラナーゼをコードするものであ
る限り、アミノ酸若しくは塩基配列に欠失、置換又は付
加等の変化があってもよいことを意味するものである。
さらに、本発明は、以下の理化学的性質を有する遺伝子
組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１又は遺伝子組換え型
耐熱性キシラナーゼＸＰ２から選ばれる耐熱性キシラナ
ーゼである。 （１）下記の理化学的性質を有する遺伝子組換え型耐熱
性キシラナーゼＸＰ１ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００２６】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００２７】 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にあ
る。 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活
性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活
性を示す。
【００２８】 等電点：8.1付近である。 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定した結果、約22,500である。 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受
け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害される。 （２）下記の理化学的性質を有する遺伝子組換え型耐熱
性キシラナーゼＸＰ２ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成
する。
【００２９】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。
【００３０】 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にあ
る。 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％以上の残存活
性を示す。 等電点：8.5付近である。
【００３１】 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で測定した結果、約32,000である。 阻害：Mn2+、Co2+、Cu2+、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸に
より弱く阻害を受け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害され
る。
【００３２】さらに、本発明は、配列番号１で表される
アミノ酸配列を実質的に含む遺伝子組換え型耐熱性キシ
ラナーゼである。さらに、本発明は、前記耐熱性キシラ
ナーゼ遺伝子を含む組換えベクターである。さらに、本
発明は、前記組換えベクターによって形質転換された形
質転換体である。
【００３３】さらに、本発明は、前記形質転換体を培地
に培養し、得られる培養物から遺伝子組換え型耐熱性キ
シラナーゼを採取することを特徴とする遺伝子組換え型
耐熱性キシラナーゼの製造方法である。さらに、本発明
は、前記耐熱性キシラナーゼを生産するバチルス属に属
する微生物又は前記形質転換体を培地に培養して得られ
る培養物、あるいは以下の理化学的性質を有する耐熱性
キシラナーゼＸＰ１若しくは遺伝子組換え型耐熱性キシ
ラナーゼＸＰ１および／又は耐熱性キシラナーゼＸＰ２
若しくは遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２を有
効成分として含む漂白剤である。 （１）下記の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼ
ＸＰ１又は遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００３４】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００３５】 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にあ
る。 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活
性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活
性を示す。
【００３６】 等電点：8.1付近である。 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定した結果、約22,500である。 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受
け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害される。 （２）下記の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼ
ＸＰ２又は遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成
する。
【００３７】 基質特異性：カバキシラン、小麦キシ
ラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹
クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。
【００３８】 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にあ
る。 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％以上の残存活
性を示す。 等電点：8.5付近である。
【００３９】 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で測定した結果、約32,000である。 阻害：Mn2+、Co2+、Cu2+、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸に
より弱く阻害を受け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害され
る。
【００４０】さらに、本発明は、前記漂白剤を用いてパ
ルプを処理することを特徴とするパルプの漂白方法であ
る。さらに、本発明は、前記漂白剤を用いてパルプを処
理するにあたり、化学漂白及び／またはアルカリ抽出
を、パルプ処理前、処理後又は処理中のいずれかに行な
うことを特徴とするパルプの漂白方法である。
【００４１】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）酵素の理化学的性質 先ず、本発明の耐熱性キシラナーゼＸＰ１と耐熱性キシ
ラナーゼＸＰ２の理化学的性質について説明すると、以
下の通りである。
【００４２】 作用 キシラン（カバ材由来、シグマ社製）の１％溶液（ｐＨ
7.０、40mＭリン酸ナトリウム緩衝液）５mlにＸＰ１及
びＸＰ２をそれぞれ10 Uずつ添加し、60℃にて反応させ
た。所定時間反応後に煮沸して反応を停止し、10μlを
薄層クロマトグラフィーに供した。薄層はメルク社製の
ＨＰＴＬＣ Kieselgel60 Ｆ254を用い、展開溶媒はｎ
−ブタノール：酢酸：水＝10：５：１とした。発色はジ
フェニルアミン−アニリン試薬を噴霧し、120℃にて10
分間加熱して行った。
【００４３】結果を図１に示す。図中の時間は酵素の反
応時間を表す。この結果から、キシランに作用してＸＰ
１はキシロオリゴ糖を、ＸＰ２はキシロース及びキシロ
オリゴ糖を生成することが明らかである。 基質特異性 カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キ
シランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等
に作用する。
【００４４】 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 各酵素の反応至適ｐＨ及びｐＨ安定性を、グリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ３以下）、酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６〜７）、トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ9.１〜10.1）を用いて測定した。それぞれの
ｐＨで各酵素の酵素活性を測定した。
【００４５】結果を図２に示す。図中、「○」はＸＰ
１、「■」はＸＰ２を表す。図２より、ＸＰ１、ＸＰ２
ともに酵素反応の至適ｐＨは５〜８であった。また、各
酵素をそれぞれ50mＭの所定緩衝液中に４℃で二晩保持
した後に酵素活性を測定した。結果を図３に示す。図
中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を表す。図３よ
り、ＸＰ１はｐＨ3.０〜9.０で安定であり、ＸＰ２はｐ
Ｈ4.５〜9.０で安定であった。
【００４６】 力価の測定法 キシラナーゼ活性の測定は次のように行った。キシラン
（カバ材由来、シグマ社製）の１％溶液（ｐＨ6.５、1/
10 McIlvaine緩衝液）200μｌに被検液50μｌを添加
し、70℃にて５分間反応させる。ＤＮＳ試薬を500μｌ
添加して５分間煮沸した後、直ちに氷冷して４mlの蒸留
水を加えて500nmの吸光度を測定する。検量線は濃度既
知のキシロースを用いて作製する。キシラナーゼの活性
単位については上記の条件で１分間に１μmolの還元糖
を生成する酵素量を１Unit（ユニット：Ｕ）とした。
【００４７】 作用適温の範囲 反応温度を変えて各酵素の酵素活性を測定した。結果を
図４に示す。図中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を
表す。図４より、至適温度はＸＰ１では70℃、ＸＰ２で
は80℃であった。また、所定の温度で50mＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ7.２）中に各酵素を30分間放置した後に
酵素活性を測定した。
【００４８】結果を図５に示す。図中、「○」はＸＰ
１、「■」はＸＰ２を表す。図５より、ＸＰ１は 50
℃、30分の処理で約90％以上の酵素活性を保持し、60
℃、30分の処理でも約50％以上の残存活性を示した。一
方、ＸＰ２は、70℃、30分の処理で約90％以上の残存活
性を示した。 等電点 SERVA社製PRECOAT ｐＨ３〜10による等電点電気泳動を
行った結果、ＸＰ１の等電点は8.１、ＸＰ２の等電点は
8.５であった。
【００４９】 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、
ＸＰ１の分子量は約22,500、ＸＰ２の分子量は約32,000
であった。 金属イオン、阻害剤の影響 種々の金属塩を１mＭになるように酵素液に添加して４
℃で一晩保持した後、反応液中にも同種の金属塩を１m
Ｍになるように添加してＸＰ１及びＸＰ２の酵素活性を
測定した。
【００５０】結果を表１に示す。表１より、ＸＰ１はHg
2+で強く阻害され、ＸＰ２はMn2+、Co2+、Cu2+により弱
く阻害され、Hg2+で強く阻害された。
【００５１】
【表１】
【００５２】阻害剤等種々の物質を１mＭになるように
酵素液中に添加し、４℃で一晩保持した後、反応液中に
も同種の物質を１mＭになるようにＸＰ１、ＸＰ２の各
酵素液中に添加して活性を測定した。結果を表２に示
す。表２より、ＸＰ１は、ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより
弱く阻害され、ＳＤＳで強く阻害された。また、ＸＰ２
はＥＤＴＡ、ヨード酢酸により弱く阻害され、ＳＤＳで
強く阻害された。
【００５３】
【表２】
【００５４】ところで、本発明の酵素は反応至適温度が
70℃以上の耐熱性キシラナーゼであって、従来のものと
相違する理化学的性質を有する新規な耐熱性キシラナー
ゼである。従来公知の耐熱性キシラナーゼとしては以下
の報告がある。Johnらはアスペルギルス・ニガー（Aspe
rgillus niger）Strain 21 由来の反応至適ｐＨが5.５
〜６、反応至適温度が65℃〜80℃のキシラナーゼＩＡを
報告（Can.J.Biochem.,57,125,1979）しているが、等電
点の記載はなく、分子量は50,000である。
【００５５】Berengerらは、クロストリジウム・ステル
コラリウム（Clostridium stercorarium）由来の反応至
適ｐＨが６〜７、反応至適温度が75℃のキシラナーゼを
３種類（Ａ、Ｂ、Ｃ）を単離（Can.J.Microbiol.,31,63
5,1985）しているが、いずれも等電点が4.５付近であ
り、また分子量も44,000〜72,000である。Wangらはスト
レプトミセス・シアネウス（Streptomyces cyaneus）由
来の反応至適ｐＨが8.５、反応至適温度72℃のキシラナ
ーゼＩを単離（J.Gen.Microbiol.,139,1987,1993）して
いるが、分子量が37,000であり、等電点が5.1 である。
【００５６】バチルスについては、Hondaらがバチルス
（Bacillus）C-125 株から反応至適ｐＨが６〜７で反応
至適温度が70℃のキシラナーゼＮと反応至適ｐＨが６〜
10で反応至適温度が70℃のキシラナーゼＡを単離してい
る（Can.J.Microbiol.,31,538,1985）が、分子量がそれ
ぞれ16,000と43,000である。特表平6-506107号公報で
は、バチルス由来の反応至適ｐＨ4.８〜７の60℃で安定
なキシラナーゼについて記載されているが、分子量は2
2,000で等電点が7.７であり、反応至適温度については
記載がない。
【００５７】以上より、これらのキシラナーゼは至適温
度、至適ｐＨ、分子量、等電点等が本発明のキシラナー
ゼとは異なることから、本発明のＸＰ１及びＸＰ２は何
れも新規な耐熱性キシラナーゼであると認定した。本発
明の酵素を従来のキシラナーゼと比較した結果を表３に
示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】（２）微生物 次に、本発明の耐熱性キシラナーゼを生産する微生物に
ついて説明する。本発明において使用される微生物は、
バチルス属に属し、耐熱性キシラナーゼ生産能を有する
菌株であって、その具体例としては、バチルス・エスピ
ー２１１３又はバチルス・エスピー２０８が挙げられ
る。
【００６０】以下それぞれの微生物について説明する。Ａ．バチルス・エスピー２１１３ バチルス・エスピー２１１３は、本発明者らが土壌中か
ら分離した菌株であり、カバキシランまたはコムギキシ
ラン１％、ペプトン0.５％、酵母抽出物0.５％、K2HPO4
0.１％、MgSO4・7H2O 0.02％、ｐＨ7.０の培地を用い
た45℃の培養でよく生育する。本菌株の菌学的性質は次
の通りである。
【００６１】 形態的性質について i) 0.３〜0.６×２〜５μｍの運動性を有する桿菌であ
る。２〜３連の連鎖形態を示すことがある。菌体の中央
に胞子を形成する。 ii) グラム染色性は不定で抗酸性は陰性である。 各種培地における生育状態等は以下に示す通りであ
る。なお、培養温度は45℃とした。
【００６２】i) 肉汁寒天平板培地（Difco Beef Extra
ct １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5 ％、寒天1.５
％、ｐＨ7.０）では、コロニーの形はほぼ円形であり、
その周縁はやや波状である。やや光沢のある半透明のコ
ロニーである。肉汁寒天斜面培地（Difco Beef Extract
１％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５
％、ｐＨ7.０）では、やや光沢が有り、薄く拡布状に生
育する。肉汁液体培地（Difco Beef Extract １％、Bac
to Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５％、ｐＨ7.
０）において、液面ではほとんど生育せず沈渣する。い
ずれも生育はあまり良くない。Difco 社のNutrient Bro
thを用いた肉汁寒天培地（Difco Nutrient Broth 0.8
％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）ではさらに生育は悪い。
【００６３】ii) 肉汁寒天平板培地（Difco Beef Extra
ct １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５
％、ｐＨ7.０）にNaClを２％添加した培地では生育する
が、５％添加すると生育しない。 iii) 肉汁ゼラチン培地（Difco beef extract １％、
ペプトン１％、NaCl 0.５％、ゼラチン12％ ｐＨ7.
０）では液化しない。
【００６４】 生理学的性質を表４に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】以上の菌学的性質をもとにバーギーズマニ
ュアルシステマティックバクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）を参考にして本菌
株の同定を行った。その結果、本菌株は胞子を形成する
グラム染色性不定の桿菌であり、カタラーゼ陽性である
ことからバチルス（Bacillus）属に属することは明らか
である。種についてはバチルス・サーキュランス（Baci
llus circulans）に近いが、本発明の菌株はオキシダー
ゼが陽性であり、55℃でも生育できるのに対し、バチル
ス・サーキュランス（Bacillus circulans）はオキシダ
ーゼが陰性であり、50℃以上では生育できないことか
ら、本発明の菌株はバチルス・サーキュランス（Bacill
us circulans）とは異なる。
【００６７】耐熱性キシラナーゼの報告（T.Nanmori et
al.,J.Bacteriol.,172 ,6669,1990）があるバチルス・
ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilu
s）と比較しても、本発明の菌株は胞子の位置が中央で
あり、ゼラチンを加水分解できず、65℃では生育できな
いのに対し、バチルス・ステアロテルモフィルス（Baci
llus stearothermophilus）は胞子の位置が端であり、
ゼラチンを加水分解でき、65℃でも生育できることか
ら、本発明の菌株はバチルス・ステアロテルモフィルス
（Bacillus stearothermophilus）とは異なる。
【００６８】また、特表平6-506107号公報に記載のキシ
ラナーゼを生産するバチルス（Bacillus）No.I-1017 及
びNo.I-1018 は、生育至適温度が62℃であり、フルクト
ース、アラビノースを利用しない。これに対し、本発明
の菌株は生育至適温度が35〜50℃であり、またフルクト
ース、アラビノースを利用することから、本発明の菌株
はバチルス（Bacillus）No.I-1017 及びNo.I-1018 とは
異なる。
【００６９】以上のことから、本発明の菌株に該当する
菌種が無いため該菌株を新菌株と判断し、バチルス・エ
スピー２１１３と命名した。該バチルス・エスピー２１
１３は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に、FERM BP-5264として寄託されている。Ｂ．バチルス・エスピー２０８ バチルス・エスピー２０８は、カバキシランまたはコム
ギキシラン１％、ペプトン 0.5％、酵母抽出物 0.5％、
K2HPO4 0.1 ％、MgSO4・7H2O 0.02％、pH 7.0の培地を
用いた45℃の培養でよく生育する。本菌の菌学的性質は
次の通りである。
【００７０】 形態的性質について 1) 0.3〜0.6 × 2〜5μmの運動性を有する桿菌である。
２〜３連の連鎖形態を示すことがある。菌体の中央に胞
子を形成する。 2)グラム染色性は不定で抗酸性は陰性である。 各種培地における成育状況等は以下に示す通りであ
る。なお培養温度は45℃とした。
【００７１】1) 肉汁寒天培地(Difco Nutrient Broth
0.8％, 寒天 1.5％, pH 7.0) ではコロニーの形はほぼ
円形であり、その周縁はやや波状である。やや光沢のあ
る半透明のコロニーであり生育はよい。 2) 肉汁寒天平板培地(Difco Nutrient Broth 0.8 ％,
寒天 1.5％, pH 7) にNaClを２％添加した培地では生育
するが、５％添加すると生育しない。
【００７２】3) 肉汁ゼラチン培地(Difco Beef Extrac
t 1%, ゼラチン 12%, pH7.0）では液化しない。 生理学的性質を表５に示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】以上の菌学的性質についてバーギーズマニ
ュアルシステマティックバクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）を参考にして同定
を行った。その結果、本発明菌株は胞子を形成する好気
性のグラム染色不定の桿菌であり、カタラーゼ陽性であ
ることからバチルス（Bacillus）属に属することは明ら
かである。
【００７５】種については、バチルス・サーキュランス
(Bacillus circulans)の持つ性質と類似するが、バチル
ス・サーキュランス(Bacillus circulans)の生育温度範
囲は10〜40℃であり、オキシダーゼが陰性であるのに対
し、本発明菌の菌株バチルス・エスピー２０８の生育温
度は、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)
では生育することができない高温下（40〜60℃）でも生
育可能であり、オキシダーゼ陽性であることから、本発
明菌株は、バチルス・サーキュランス(Bacillus circul
ans)とは異なる。
【００７６】また、耐熱性キシラナーゼ生産の報告(T.N
anmori et al., J. Bacteriol., 172, 6669, 1990）が
あるバチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stea
rothermophilus)と比較すると、本発明菌株は胞子の位
置が中央であり、ゼラチンを加水分解できないことに対
し、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stea
rothermophilus)は胞子の位置が端であり、ゼラチンを
加水分解できることから本発明菌株は、バチルス・ステ
アロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)と
は異なる。
【００７７】また、特表平6-506107号公報に記載のキシ
ラナーゼを生産するバチルス(Bacillus) NO.Ｉ-1017及
びNO.Ｉ-1018は、アラビノースを利用しないのに対し、
本発明菌株はアラビノースを利用することから本発明菌
株はバチルス(Bacillus) NO.Ｉ-1017及びNO.Ｉ-1018と
は異なる。従って、本発明菌株は、前記バチルス・エス
ピー２１１３に類似する菌株である。但し、バチルス・
エスピー２１１３株は肉汁培地(Nutrient Broth 0.8%,
寒天 1.5%)で生育が悪いのに対し、本菌株は肉汁培地で
生育が良いことから、本菌株はバチルス・エスピー２１
１３株と区別し得ると考え、本菌株を新菌株として判断
し、バチルス・エスピー２０８と命名した。
【００７８】バチルス・エスピー２０８は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-
5321として寄託されている。
【００７９】（３）耐熱性キシラナーゼ遺伝子のクロー
ニング キシラナーゼ遺伝子をクローニングするためにＤＮＡラ
イブラリーの作製を行う。ＤＮＡライブラリーは、バチ
ルス・エスピー２１１３株又は２０８株から染色体ＤＮ
Ａを抽出し、適当な制限酵素で処理したものを適当なベ
クターにつないだ後、適合する宿主に導入することで作
製することができる。
【００８０】バチルス・エスピー２１１３株又は２０８
株から染色体ＤＮＡを抽出するには、通常の方法を用い
ることができる（例えば、Molecular Cloning; Cold Sp
ringHarbor Laboratory (1982)1のBlinとStaffordの方
法) 。次に、得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で
処理し、部分消化を行った後、ショ糖密度勾配遠心法に
より３〜５kbp の断片画分を得る。同じ接着末端を生じ
させる制限酵素で処理したクローニングベクターに、上
記で得られたＤＮＡ断片を挿入する。ライブラリー作製
に用いられるベクターとしては、例えばプラスミドベク
ター、ファージベクター等が挙げられ、宿主としては、
例えば大腸菌、酵母等が挙げられる。
【００８１】また、クローニングベクターとしては、例
えばｐＵＣ系クローニングベクターを用いることができ
る。上記で得られたＤＮＡライブラリーからの目的とす
る遺伝子の単離にあたっては、前記ＤＮＡライブラリー
を用いて大腸菌を形質転換した後、キシラン培地に塗布
し、ハローの形成を指標に行う。このようにしてクロー
ニングされたＤＮＡの塩基配列は、放射標識又は蛍光標
識を用いるジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等に
より解析することができる。 （４）酵素の製造方法 次に、本発明の酵素の製造方法について説明する。
【００８２】 耐熱性キシラナーゼ生産菌の培養液か
らの本発明の酵素の精製 本発明のバチルス・エスピー２１１３株又は２０８株を
培養することにより耐熱性キシラナーゼを生産すること
ができる。培養のための炭素源、窒素源には、資化して
耐熱性キシラナーゼを生産することのできるものであれ
ばいずれも用いることができる。例えば、炭素源として
は、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふすま、パル
プ、バガス、コーンファイバー、稲わら等の農産廃棄物
又は植物繊維等を使用することができる。窒素源として
は、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コー
ンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用
いることができる。また、各種の塩類やビタミン、ミネ
ラル等を適宜用いることができる。
【００８３】培養温度およびｐＨは、菌が生育して耐熱
性キシラナーゼを生産する範囲であればいずれでも良
く、培養温度は20〜55℃、好ましくは35〜50℃、ｐＨは
５〜９、好ましくは６〜８である。本発明の微生物を培
養した後、菌体を分離し、培養濾液をそのまま耐熱性キ
シラナーゼ粗酵素液として使用することができる。かか
る耐熱性キシラナーゼ粗酵素液は、反応至適温度が60〜
80℃、至適ｐＨが５〜７である。
【００８４】また、透析、塩析、限外濾過、凍結乾燥等
により、耐熱性キシラナーゼを濃縮又は固体化すること
ができる。さらに、培養濾液を硫安分画、ゲル濾過によ
る分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシアパ
タイト、等電点分画等を適宜組み合わせ、また繰り返す
ことにより耐熱性キシラナーゼＸＰ１とＸＰ２を精製す
ることができる。具体的な精製方法については、実施例
に示す。
【００８５】 遺伝子工学的手法による遺伝子組換え
型耐熱性キシラナーゼの精製 本発明の耐熱性キシラナーゼは、クローニングされた遺
伝子を発現させることにより精製することもできる（本
発明において、遺伝子を発現させて得られた酵素を「遺
伝子組換え型耐熱性キシラナーゼ」という）。その手法
は、前記(3) によって得られたキシラナーゼ遺伝子を、
適当な宿主・ベクターを用いて発現することにより高生
産することができる。発現に用いられるベクターとして
は、プラスミドベクター、ファージベクター等が主に使
われる。宿主として、大腸菌、枯草菌、酵母等が主に使
われる。培養のための炭素源、窒素源には、資化して耐
熱性キシラナーゼを生産することができるものであれば
いずれも用いることができる。例えば、炭素源として
は、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふすま、パル
プ、バカス、コーンファイバー、稲わら等の農業廃棄物
又は植物繊維等を使用することができる。窒素源として
は、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コー
ンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用
いることができる。また、各種塩類、ビタミン、ミネラ
ル等を適宜用いることができる。培養温度及びpHは、菌
が耐熱性キシラナーゼを生産する範囲であればいずれで
も良く、培養温度は好ましくは37℃、pHは好ましくは７
である。酵素の精製方法としては、硫安分画、ゲル濾過
による分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシ
アパタイト、等電点分画等を適宜組み合わせ、また繰り
返すことにより精製することができる。得られた精製酵
素が求めるキシラナーゼであるかの確認は、得られた精
製酵素の分子量、至適pH、至適温度、Ｎ末端アミノ酸配
列等をバチルス・エスピー２１１３株の生産した耐熱性
キシラナーゼと比較することにより判断できる。具体的
な酵素の取得については、実施例に示す。
【００８６】（５）パルプの漂白方法 次に、本発明の酵素を用いたパルプの漂白方法について
説明する。化学パルプ及び機械パルプ製造工程におい
て、本発明の耐熱性キシラナーゼＸＰ１（遺伝子組換え
型を含む）及び／またはＸＰ２（遺伝子組換え型を含
む）及び／またはバチルス（Bacillus）属に属する菌株
バチルス・エスピー２１１３若しくはバチルス・エスピ
ー２０８の培養物でパルプを処理することで漂白を行な
うことができる。さらに酵素処理の前後、あるいは途中
に化学漂白及び／またはアルカリ抽出を行なうことでパ
ルプの漂白を行なうことができる。
【００８７】パルプに処理する培養物又は酵素量につい
ては、耐熱性キシラナーゼ単位としてパルプの絶乾重量
１ｇあたり0.１〜５Ｕ、好ましくは0.５〜３Ｕ添加すれ
ばよい。反応条件は培養濾液（粗酵素液）の場合、反応
温度50〜90℃、ｐＨ５〜８であり、精製酵素の場合はＸ
Ｐ１では反応温度50〜80℃、ｐＨ５〜８である。ＸＰ２
では反応温度60〜90℃、ｐＨ５〜８である。反応時間
は、0.２〜24時間、好ましくは0.５〜８時間である。化
学漂白に用いる試薬としては、塩素、二酸化塩素、二酸
化窒素、次亜塩素酸塩、酸素、過酸化水素、オゾン等が
挙げられる。またアルカリ抽出には、当業者として公知
の多くのアルカリ性化合物を用いることができる。アル
カリ抽出には、水酸化ナトリウム換算で0.５〜３％（対
絶乾パルプ）のアルカリを用い、酸素や過酸化水素等を
添加しながらアルカリ処理を行うことができる。
【００８８】
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を更に
具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定
されない。
【００８９】〔実施例１〕粗酵素液の調製(1) キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.６％、ペプトン
0.５％、酵母抽出物0.５％、K2HPO4 0.1％、MgSO4・7H2
O 0.02％を含む液体培地10ml（ｐＨ7.0 ）を、内径25mm
試験管に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅菌し
た。これにバチルス・エスピー２１１３を１白金耳植菌
し、45℃で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復／
分）。培養終了後、遠心分離（10,000rpm ×10分）して
培養上清を分離し、耐熱性キシラナーゼの粗酵素液を得
た。
【００９０】１％キシラン溶液（ブナ材キシラン、シグ
マ社製 1/10 McIlvaine Buffer pH6.5）200μlに酵素
溶液50μlを添加し、70℃にて５分間反応させた。DNS試
薬を500μl添加して５分間煮沸した後直ちに氷冷し、４
mlの蒸留水を加えて500nmの吸光度を測定した。検量線
は濃度既知のキシロースを用いて作成した。
【００９１】キシラナーゼ活性は、上記の条件で１分間
に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Uni
t）とした。その結果、培養上清中の耐熱性キシラナー
ゼ活性は、培養開始後24時間で400U/ml、48時間で500 U
/mlであった。
【００９２】〔実施例２〕粗酵素液の調製(2) キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.6％、ペプトン
0.5％、酵母抽出物0.５％、K2HPO4 0.1 ％、MgSO4・7H2
O 0.02％を含む液体培地(pH 7)10mlを内径25mmの試験管
に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅菌した。こ
れにバチルス・エスピー２０８を１白金耳植菌し、45℃
で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復／分）。培養
終了後、遠心分離(10,000rpm×10分）して培養上清を分
離し、耐熱性キシラナーゼの粗酵素液を得た。培養上清
中の耐熱性キシラナーゼ活性を次の方法により測定し
た。
【００９３】１％キシラン溶液（ブナ材キシラン、シグ
マ社製 1/10 McIlvaine Buffer pH6.3）200μlに酵素
溶液50μlを添加し、70℃にて５分間反応させる。DNS試
薬を500μl添加して５分間煮沸した後直ちに氷冷し、４
mlの蒸留水を加えて500nmの吸光度を測定した。検量線
は濃度既知のキシロースを用いて作成した。
【００９４】キシラナーゼ活性は、上記の条件で１分間
に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Uni
t）とした。その結果、培養上清中の耐熱性キシラナー
ゼ活性は、培養開始後24時間で400U/ml、48時間後で500
U/mlであった。
【００９５】〔実施例３〕耐熱性キシラナーゼの精製 キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.6 ％、ペプトン
0.5 ％、酵母抽出物0.5 ％、K2HPO4 0.1％、MgSO4・7H2
O 0.02 ％、ｐＨ7.0 の液体培地50mlを500 ml容坂口フ
ラスコに取り綿栓をした後、121 ℃で15分間蒸気滅菌し
た。これに実施例１で得られた培養液を１ml加え、45
℃、３日往復振盪培養（振幅10cm、100 往復／分）し
た。培養終了後、遠心分離（8,000rpm×10分) により培
養上清を得た。この培養上清を硫安分画し、20〜60％画
分を遠心分離（20,000rpm ×10分）にて回収した後、20
mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.２）を外液として透析
を行った。得られた粗酵素液について、20mＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ5.０）で平衡化したＣＭトヨパール650-C （直
径2.5cm ×30cm）を用いてイオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。
【００９６】吸着画分を０Ｍ〜0.３Ｍまでの濃度勾配で
NaClを含む該緩衝液にて溶出し、5.３mlずつ分画した。
その結果、キシラナーゼ活性は２つのピークに分かれて
溶出し、前半に溶出した活性画分をキシラナーゼＸＰ
１、後半に溶出した活性画分をキシラナーゼＸＰ２とし
た。
【００９７】それぞれの活性画分を集め、再度硫安分画
を行い、20〜60％画分を遠心分離（20,000rpm ×10分）
により回収した後、20mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.
２）に50mＭのNaClを含む緩衝液で平衡化したSephacryl
S-200（直径2.５cm×93cm）を用いて該緩衝液により溶
出し、ゲル濾過を行った。ＸＰ１については流速34ml/h
r とし、５mlずつ分画した。また、ＸＰ２については流
速34ml/hr とし、6.７mlずつ分画した。
【００９８】それぞれ活性画分を集め、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、均一に精製されている
ことが確認できた。培養濾液に対する各精製酵素の収率
はＸＰ１が47.8％、ＸＰ２が7.８％であった。また比活
性はＸＰ１が1420 U/mg、ＸＰ２が919 U/mgであった。
【００９９】〔実施例４〕耐熱性キシラナーゼ遺伝子の
クローニング (1) 染色体遺伝子ライブラリーの作製 キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.６％、ペプトン
0.５％、酵母抽出物0.５％、K2HPO4 0.１％、MgSO4・7H
2O 0.02％、ｐＨ7.０の液体培地50mlを500ml容坂口フラ
スコに取り綿栓をした後、121℃で15分間蒸気滅菌し
た。これにバチルス・エスピー２１１３株を１白金耳植
菌し、45℃で一晩往復振盪培養（振幅10cm、100 往復／
分）した。培養終了後、遠心分離（10,000 rpm×10分）
により菌体を得た。
【０１００】本菌体を５mlのグルコース−リゾチーム溶
液（50mMグルコース、10mM EDTA 、25mM Tris-HCl 緩衝
液（pH8.０）、４mg/ml リゾチーム）に懸濁し、室温で
15分放置した。５mlのアルカリ溶液（0.２N NaOH、１％
SDS）を加え、穏やかに混ぜ、氷中にて15分間冷却し
た。この後、フェノール抽出、クロロホルム抽出を行な
い、抽出した水層部分にエタノールを徐々に添加しＤＮ
Ａが析出したところで染色体ＤＮＡをガラス棒にて巻取
り、ＴＥ溶液に懸濁した。得られた染色体ＤＮＡ100μg
を制限酵素ＥcoＲＩで部分消化し、３〜20％ショ糖密
度勾配超遠心分離法（22,500rpm, 16 時間）により分画
し、３〜５kbp 断片画分をエタノール沈澱により回収し
た。
【０１０１】(2) 耐熱性遺伝子の大腸菌への形質転換 大腸菌クローニングベクターpUC19 （宝酒造社製）、１
μｇを制限酵素ＥcoＲＩで完全消化した後、アルカリホ
スファターゼ（Calf intestine由来）により脱リン酸化
し、上記エタノール沈澱後のＤＮＡ500ng 及びT4 DNAリ
ガーゼ2.５ユニットを含むライゲーションバッファー中
で16℃、16時間反応させ、本発明の遺伝子とベクターと
を連結した。
【０１０２】得られたＤＮＡライブラリーを用いて、塩
化カルシウム法により大腸菌JM109株を形質転換した。 (3) ＤＮＡライブラリーからのキシラナーゼ遺伝子の単
離ＸＰ１遺伝子のクローニング 上記染色体ＤＮＡライブラリーからのＸＰ１キシラナー
ゼ遺伝子を含むクローンの選抜は、該ＤＮＡライブラリ
ーを用いて大腸菌を形質転換した後、キシラン培地に塗
布し、コロニー周辺のハロー形成を指標に行った。すな
わち、該ＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌を形質転換
した後、100 μg/mlのアンピシリンを含むキシラン培地
（１％キシラン（コムギ由来；シグマ社製）、１％ペプ
トン、0.５％酵母抽出物、0.５％ NaCl、２％寒天（pH
7.0））に塗布し、37℃で一晩培養し、ハロー形成を観
察した。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡをアル
カリ抽出法により大量に調製し、超遠心分離（16時間,
20℃）により精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の
決定はUnited States Biochemical 社製のシーケナーゼ
のキットを用いて行なった。
【０１０３】その結果を配列番号２に示す。上記ＸＰ１
キシラナーゼ遺伝子の塩基配列からＸＰ１キシラナーゼ
のアミノ酸配列を推定した結果を配列番号１に示す。ま
た、上記クローニングにより得られたキシラナーゼ（Ｘ
Ｐ１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
地図を図６に示す。
【０１０４】なお、得られたＸＰ１キシラナーゼ遺伝子
を含む大腸菌形質転換株E. coli JM109/pUCXP1は、工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-5320として寄
託されている。 (4) ＸＰ１のＮ末端配列の決定 ＸＰ１のＮ末端アミノ酸配列の決定は、バチルス・エス
ピー２１１３の培養上清より精製したＸＰ１を試料と
し、プロテインシーケンサー（Applied Biosystems（パ
ーキンエルマー社）477A）及びＰＴＨアナライザー（Ap
plied Biosystems（パーキンエルマー社）120A）を用い
て行った。その結果、成熟型キシラナーゼＸＰ１のＮ末
端配列は配列番号３に示す通りであった。
【０１０５】〔実施例５〕遺伝子組換え型耐熱性キシラ
ナーゼの製造 本実施例では、遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ
１の製造を行った。プラスミドｐＵＣＸＰ１を、ＥcoＲ
Ｉ消化して得られた本発明の遺伝子ＥcoＲＩ断片500 ng
と制限酵素ＥcoＲＩで完全消化した後、アルカリフォス
ファターゼ（Calf Intestine由来）により脱リン酸化し
た大腸菌・枯草菌シャトルベクターｐＨＹ3000ＰＬＫ
（宝酒造社製）１μgと、Ｔ４リガーゼ2.5 ユニットと
をライゲーションバッファー中、16℃、２時間反応さ
せ、連結させた。これを用いて塩化カルシウム法にて大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【０１０６】50μg/ml のテトラサイクリンを含むＬ培
地（１％ペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％NaCl(pH
7.0))中に植菌し、37℃、一晩培養した。得られた形質
転換体よりアルカリ抽出法にてプラスミドＤＮＡを大量
調製した。これをｐＨＹＸＰ１とし、その結果を図８に
示す。上記プラスミドＤＮＡを用いて枯草菌ＩＳＷ１２
１４株をプロトプラスト法にて形質転換した。得られた
形質転換体を500 ml容坂口フラスコにて50μg/mlのテト
ラサイクリンを含む50ml液体キシラン培地（0.6 ％カバ
キシラン（シグマ社製）、１％ペプトン、0.5 ％酵母エ
キス、0.5 ％ NaCl(pH7.0)) 中に植菌し、37℃、３日間
培養した。培養終了後、遠心分離（10,000rpm ×10分)
を行い培養上清を回収した。培養上清中の耐熱性キシラ
ナーゼの活性は、培養開始後48時間で160U/ml であっ
た。
【０１０７】この培養上清を硫安分画し、20〜60％画分
を遠心分離（20,000rpm ×10分) にて回収した後、20mM
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2 ）を外液として透析を行
った。得られた粗酵素液について、20mM酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ5.0 ）で平衡化したＣＭトヨパール650-C(直径1.0cm
×17cm) を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行っ
た。
【０１０８】吸着画分を０M 〜0.3Mまでの濃度勾配でNa
Clを含む20mM酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）にて溶出し、1.5 m
lずつ分画した。活性画分を集め、ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動を行い、均一に精製されていることを確
認した。本酵素は、分子量約22,500、反応至適ｐＨ５〜
８、安定ｐＨ範囲３〜９、作用適温範囲50〜80℃であ
り、ＸＰ１であると断定した。
【０１０９】〔実施例６〕パルプの漂白(1) 広葉樹酸素晒クラフトパルプ（カッパー価8.５、白色度
46.0％）に実施例１で得られたバチルス・エスピー２１
１３の培養上清（500 U/mlの耐熱性キシラナーゼを含
む）をパルプ絶乾重量１ｇあたり２μｌ添加してパルプ
濃度３％、ｐＨ7.０、70℃にて２時間反応させた。反応
終了後、パルプ濃度を10％に調製して塩素−アルカリ−
次亜塩素酸塩−二酸化塩素の順で漂白を行なった。な
お、培養上清を添加せずに同様に処理したものを対照の
漂白パルプとした。漂白の標準条件は次の通りである。
【０１１０】塩素処理：添加率はパルプ絶乾重量あたり
1.６％で40℃、30分間処理 アルカリ抽出：アルカリ添加率は絶乾パルプあたり1.０
％で60℃、100分間処理 次亜塩素酸塩処理：添加率は0.５％で45℃、120分間処
理 二酸化塩素処理：添加率は0.２％で70℃、180分間処理 この標準の漂白条件に対し、塩素およびアルカリ、ある
いは次亜塩素酸塩の添加量を減らして漂白した。その結
果、対照の漂白パルプと同等の白色度（85.6％）を得る
ために必要な塩素及びアルカリ量を25％減添することが
できた。また、次亜塩素酸塩については、50％削減する
ことができた。
【０１１１】また、漂白排水中のＡＯＸ量をハロゲン分
析装置ＴＯＸ−10（三菱化学製）を用いて定量した結
果、培養上清処理によりＡＯＸを25％減らすことができ
た。塩素、次亜塩素酸塩、アルカリ又はＡＯＸ等を削減
できたことは、本酵素の作用によりパルプの漂白性が改
善されたことを示すものであり、このことによって薬品
コストを削減できるとともに、有機塩素化合物の生成を
抑制することができる点で有用である。
【０１１２】〔実施例７〕パルプの漂白(2) 広葉樹酸素晒しクラフトパルプ（カッパー価8.5、白色
度46.0％）に、実施例２で得られたバチルス・エスピー
２０８の培養上清（500U/mlの耐熱キシラナーゼを含
む）をパルプ絶乾重量１ｇあたり２μl添加してパルプ
濃度３％、pH7.0、70℃にて２時間反応させた。反応終
了後、パルプ濃度を10％に調整して塩素−アルカリ抽出
−次亜塩素酸−二酸化塩素の順で常法により漂白を行っ
た。なお、培養上清を添加せずに同様に処理したものを
対照の漂白パルプとした。漂白の標準条件は次の通りで
ある。
【０１１３】塩素処理：塩素添加率はパルプ絶乾重量あ
たり1.6％で40℃、30分間処理 アルカリ抽出：アルカリ添加率は絶乾パルプあたり1.0
％で60℃、100分間処理 次亜塩素酸処理：次亜塩素酸添加率は0.5 ％で45℃、12
0分間処理 二酸化塩素処理：二酸化塩素添加率は0.2 ％で70℃、18
0分間処理 この標準の漂白条件に対し、酵素前処理パルプの漂白で
は、塩素及びアルカリ、あるいは次亜塩素酸の添加量を
減らして漂白した。その結果、酵素無処理の対照の漂白
パルプと同等の白色度(85.6 ％）を得るために必要な塩
素及びアルカリの量を27％軽減することができた。また
次亜塩素酸塩については、53％削減することができた。
【０１１４】また漂白排水中のAOX量をハロゲン分析装
置TOX-10（三菱化学製）を用いて定量した結果、培養上
清処理によりAOXを28％減らすことができた。 〔比較例１〜５〕パルプの漂白（市販酵素との比較） 各種市販酵素を用いてパルプの酵素処理及び漂白処理を
行い、塩素、次亜塩素酸塩及びＡＯＸの削減率を実施例
６及び７の結果と比較した。比較例１としてチバガイギ
ー（Chiba-Geigy)社製のIrgazyme 40-X4、比較例２とし
て同社のIrgazyme 10A-X4 、比較例３としてノボ（Nov
o) 社製のPulpzyme HC 、比較例４としてアルコ（Alko)
社製のEcopulp 、比較例５としてサンド（Sandoz) 社
製のCartazyme HSを用い、実施例６及び７で行った処理
と同様の処理を行った。実施例６及び７で得られた結果
並びに各比較例の結果を表６に示す。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】表６より、本発明の酵素は、従来の酵素と
比較して、ｐＨ7.0 、70℃という条件では塩素及び二酸
化塩素、ＡＯＸの削減率が高いことがわかった。特に、
このような高い温度では活性がほとんどない酵素もあ
り、本発明の酵素は耐熱性において優れていることがわ
かった。
【０１１７】
【発明の効果】本発明により、新規な耐熱性キシラナー
ゼ及びその遺伝子、耐熱性キシラナーゼのその製造方法
並びにその用途を提供することができる。本発明によ
り、耐熱性キシラナーゼを生産することが可能になり、
耐熱性キシラナーゼの工業的生産に貢献するものであ
る。また、本発明の耐熱性キシラナーゼ及び／または本
発明の菌株の培養物をパルプに処理することにより、パ
ルプの漂白性を向上させ、紙パルプ製造において塩素等
の薬品低減、排水中のＡＯＸ低減等に貢献するものであ
る。
【０１１８】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：２１１３株 配列の特徴 1-23 S sig peptide 24-211 S mat peptide 配列： Met Ile Lys Ser Lys Lys Lys Phe Leu Thr Val Cys Ile Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Phe Ser Leu Phe Ala Ala Thr Ser Asn Ala Ala Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Gln Tyr Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Thr Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val 50 55 60 Val Gly Lys Gly Trp Gly Thr Gly Ser Pro Thr Arg Thr Val Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr 85 90 95 Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp 115 120 125 Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser 130 135 140 Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Pro Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser 145 150 155 160 Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Val Ser Ile Thr Phe Ser Asn His Val 165 170 175 Asn Ala Trp Arg Asn Ala Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ala Tyr 180 185 190 Gln Val Leu Ala Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val 195 200 205 Thr Val Trp 210
【０１１９】配列番号：２ 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：２１１３株 配列の特徴 特徴を表す記号：P CDS 存在位置：379..1029 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TCTTGATAAT CAGAAAATTA ACATATGGGG GGAACCCTTT GGGACCGTAC ATGTCGATGA 60 AATTGGTGTT CAATTAACCT TAGAAAGATG GACAGGAAAT GGGTGAAAGT GCATAGCGGT 120 TCGAACACAA CCGTCCAATG TTACGGAACC CGTTATAACC TCGGTTCCTC GACGGTTTCT 180 ATGCATTTAA AAGTATTAAA AAAATGGGGT AAAATCTTTA ATTTGTTAAG TTGTTGTGTA 240 TACGCTTACA TTCTATAATT TACTAAAAAG GAGGTGAAAG TAAGAAGTTC GCGGAAGATC 300 CTGACACAGG ATAAGTTATG AACTTCAACG AGAAACAACC GACAAGCAGG TAGTGTGCAG 360 GCAAGCAGTA ATCAAAAATT TTTTAGGAGG TAAATTATGA TTAAGTCTAA AAAGAAATTT 420 TTGACGGTAT GTATTGCAGC ATTAATGAGT TTTAGCTTGT TTGCAGCAAC CTCAAATGCA 480 GCGACAGACT ATTGGCAATA TTGGACCGAT GGCGGCGGGA CAGTAAATGC TACCAATGGA 540 TCCGGCGGCA ATTACAGTGT TACATGGAGC AATGTCGGGA ATTTTGTTGT CGGTAAAGGC 600 TGGGGAACCG GATCGCCAAC TAGAACGGTG AACTACAATG CCGGCGTCTG GGCGCCGTCC 660 GGCAATGGGT ATTTGACTCT CTATGGGTGG ACGAGAAACT CGCTCATCGA ATATTATGTC 720 GTGGACAGTT GGGGCACTTA TAGACCTACT GGAACGTATA AAGGCACCGT GACCAGTGAT 780 GGGGGCACCT ATGACATCTA TACGACGATG AGATACAACG CACCTTCCAT TGACGGTACA 840 CAAACTTTCC CCCAATACTG GAGTGTCCGT CAGTCGAAGA GACCGACCGG AAGCAACGTC 900 TCTATCACTT TTAGCAACCA CGTTAACGCA TGGAGAAATG CAGGCATGAA TCTGGGAAGC 960 AGTTGGGCTT ACCAGGTGTT GGCAGTAGAA GGGTATCAAA GTAGCGGGAG CGCTAACGTA 1020 ACGGTGTGGT AACAGGTCAA CTGCAAACAG GGCAACTAGA CCGTTTCCGG AATATTGAGA 1080 AAGTCTTTTA ATCATTGATA TTGCTAAGGC CTGCCGGTCT CACAGCCGGC GGCCTTATAT 1140 ATTTCAACAA AAGATATTAT GGAGGAAACC GATTCCTTTT AAAGGAGAGC TACCCATGAG 1200 AAAGCTG 1207
【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：２１１３株
【図面の簡単な説明】
【図１】カバキシランに本発明の酵素を作用させたとき
の反応生成物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示
す図である。
【図２】本発明の酵素の反応至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の反応至適温度を示す図である。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図である。
【図６】キシラナーゼＸＰ１をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図７】プラスミドｐＵＣＸＰ１の構築図である。
【図８】プラスミドｐＨＹＸＰ１の構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 喜多 幸雄 東京都江東区東雲１丁目10番６号 新王 子製紙株式会社 中央研究所内 (72)発明者 泉 可也 東京都江東区東雲１丁目10番６号 新王 子製紙株式会社 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平６−261750（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−62839（ＪＰ，Ａ) Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ, 1986，Ｖｏｌ．144，201−206 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 ＰｕｂＭｅｄ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する、バチルス
    ・エスピー２１１３由来の耐熱性キシラナーゼＸＰ２。 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水
    分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成
    する。 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製
    キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパル
    プ、小麦フスマ等に作用する。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲は
    ｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にある。 至適温度：80℃である。 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％以上の残存活
    性を示す。 等電点：8.5付近である。 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
    で測定した結果、約32,000である。 阻害：Mn2+、Co2+、Cu2+、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸に
    より弱く阻害を受け、Hg2+、ＳＤＳにより強く阻害され
    る。
  2. 【請求項２】 バチルス・エスピー２１１３を培養し、
    得られる培養物から耐熱性キシラナーゼＸＰ２を採取す
    ることを特徴とする前記耐熱性キシラナーゼＸＰ２の製
    造方法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載の耐熱性キシラナーゼＸＰ
    ２の生産能を有するバチルス・エスピー２１１３。
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