JP3913898B2 - アルカリペクチン酸リアーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リアーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを産生する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、１９６２年、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyxa）及びエルビニア カルトボーラ（Erwinia cartovora）の培養液に初めて見い出され、ペクチン酸に対してβ−脱離反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ４〜Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であり、反応にカルシウムイオンを必要としている（Starr & Moran, Science, 135, 920-921, 1962）。
【０００３】
一般に、細菌由来（Pseudomonas属、Erwinia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知られている（Rombouts & Pilnik, Economic Microbiol, 5, 227-282, 1980）。さらに、真菌及びいくつかの細菌由来のペクチン酸リアーゼは、その最適pHがpH１０〜１０．５であると報告されている。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. cice ri株の生産する２種のアルカリペクチン酸リアーゼ（Artes & Tana. Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 107-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14株（Han et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20, 655-662, 1992）、Amycolata sp.株（Bruhlmom, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）等が生産する酵素が知られている。
【０００４】
一方洗剤工業界においてもペクチナーゼを工業的に利用しようとする試みがなされており、例えば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９０号等の技術が知られている。前者においては、セルラーゼは繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で泥汚れ洗浄力に対する効果について述べられているが、完全に精製された酵素を用いていないためにその効果に関しては明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとして洗浄剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が開示されているが、これはリゾプス属のセルラーゼ及びペクチナーゼを併用することで洗浄力を発揮するというものであるが、いずれも中酸性領域に最適pHを有する酵素である。
【０００５】
また、植物性繊維の精練に関しては、例えば、特開昭５１−１４９９７６号公報、特公昭５７−３９６３６号公報、特開平６−２２０７７２号公報等に、ペクチナーゼ（ペクチン酸リアーゼを含む）を植物繊維の精練、非木材繊維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用することが開示されている。かかる繊維の精練においてはアルカリ領域で処理することで精練度合を高めることができるとされている。また、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高アルカリ性（pH１０〜１１）にすることによってその洗浄力を高めることができる。
【０００６】
しかし、このような高アルカリ性に最適pHを有する酵素は前述のように数例が報告されているだけで、工業的に生産されているものも無く、入手が困難である。
【０００７】
従って、本発明は高アルカリ領域において充分作用し、工業的に生産可能なアルカリペクチン酸リアーゼを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは新たなペクチン酸リアーゼを探索すべく日本国内の土壌よりスクリーニングしたところ、特定の微生物が産生する高アルカリ領域に最適反応pHを有する新規な２種類のアルカリペクチン酸リアーゼを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
【００１０】
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理）
（７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２７kDa）
（８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法）
（以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ａ」という）。
【００１１】
及び下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約３２kDa）
（７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法）
（以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ｂ」という）を提供するものである。
【００１２】
本発明はまたかかるペクチン酸リアーゼを産生するバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭＰ−１５９９１）を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の酵素Ａ及びＢは、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造される。かかるアルカリペクチン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するバチルスエスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株が挙げられる。
【００１４】
【００１５】
【００１６】
以上の菌学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株はバチルス コアグランス（Bacillus coagulans）に類似の性質を有していた。しかし、既知のバチルス コアグランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物である為、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９９１）として寄託した。
【００１７】
ＫＳＭ−Ｐ５３９株等のアルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リアーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。かくして得られた培養液中からのアルカリペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の採取及び精製法に準じて行うことができる。ＫＳＭ−Ｐ５３９株からは２種類以上のアルカリペクチン酸リアーゼが生産され、そのまま用いることもできるが、一般の酵素精製法により２種類の酵素を分離することができる。さらに公知の方法により結晶化または造粒化することもできる。
【００１８】
かくして得られる本発明のアルカリペクチン酸リアーゼの一例であるBacillus sp. ＫＳＭ−Ｐ５３９株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活性の測定は次の如くして行った。
【００１９】
（１）標準酵素活性測定法
試験管に０．２mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの４mM塩化カルシウム溶液、１mlの脱イオン水を加え、氷冷下にて０．１mlの酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加え、３０℃、５分間恒温した。反応は、０．４mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和オリゴガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラクツロニドを生成する量とした。
【００２０】
（２）最適反応pH
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９．５）、または５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１２）を用いて３０℃で最適反応pHを調べたところ、酵素Ａはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１１中で最も反応速度が高く、pH１０．５〜１２．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した。しかしトリス−塩酸緩衝液中では殆ど活性は認められなかった。酵素Ｂはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０〜１１の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した。トリス−塩酸緩衝液中ではpH９．５で最も反応速度が高かったが、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の最高活性に比べると約半分の活性であった（図１及び図２）。
【００２１】
（３）pH安定性
４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH４〜１２）中に０．１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、酵素ＡはpH４〜８、酵素ＢはpH４〜１０の範囲で極めて安定であった。また酵素Ｂの安定性に塩化カルシウムの添加効果が認められた。
【００２２】
（４）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中にて２０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、両酵素は２０℃〜５０℃の広範囲において作用し、酵素Ａの最適反応温度は４５℃であり、酵素Ｂの最適反応温度は４０℃であった（図３及び図４）。
【００２３】
（５）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mM塩化カルシウムを添加した系及び無添加の系を用意し、酵素を加えて３０℃〜７０℃の各温度で２０分間放置した。その後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性法にて調べた。その結果、酵素Ａは塩化カルシウム存在下で４０℃まで安定であった。酵素Ｂの耐熱性は同様に塩化カルシウム存在下で若干安定化されるものの酵素Ａに比べ耐熱性は低いことが判った。
【００２４】
（６）分子量
ａ．ゲルろ過法
１mM塩化カルシウム及び０．１Ｍ塩化カリウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したセファデックスＧ−７５ Superfine（１．５cm×７１cm）を用いて、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約１６kDa、酵素Ｂは約２８kDa と見積もられた。なお、検量線を作成する為の標準タンパク質としてファルマシア社製のＬＭＷゲルろ過キャリブレーションキットを用いた。
【００２５】
ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
１５％ポリアクリルアミドゲルを用い、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約２７kDa 、酵素Ｂは約３２kDa と見積もられた。なお、標準タンパク質としてバイオラッド社製の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Molecular Weight Standards, Low Rangeを用いた。
【００２６】
（７）等電点
pH８〜１０．５のアンフォライン（ファルマライト、ファルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用い、等電点電気泳動法で測定した結果、酵素Ａの等電点はpH１０．１付近、酵素Ｂの等電点はpH１０．５付近であった。
【００２７】
（８）アミノ末端アミノ酸配列
酵素ＡまたはＢをProSorb フィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（６７４型、アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端アミノ酸配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結果、酵素ＡはＡＰＴＶＶＮＳＴＩＶＶＰＫＧＧＴＹＹＧＱであり、酵素ＢはＡＤＡＳＧＴＴＡＳＭＳＤＩＬＫＮＱＲＰＤであった。
【００２８】
（９）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチンを基質とした場合の反応速度を標準酵素活性測定法を用いて調べた。酵素Ａは、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた時の約２倍の反応速度であった。エステル化度２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対活性は２０、５、７％（ＩＣＮ社製のポリガラクツロン酸に対する反応速度を１００とした場合）とエステル化度の増加に伴い、その反応性は減少したが、若干の作用は示した。一方酵素Ｂはポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高かったが、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた場合、ほぼ同じ反応速度であった。エステル化度２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対反応速度は９４、４３、９％と減少したが、酵素Ａに比べ２８、６７％のエステル化度を有するペクチンに対し高い分解活性を示した。さらにWardとFogarty の方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、両酵素はペクチン酸（ＩＣＮ社製）に対する反応速度と同程度の反応速度で分解した。
次に基質として木綿糸（カナガワヌイイト社製、金鈴印シロモ、４０／３甘より）を３０cm（約１３mg）を０．６mM塩化カルシウムを含む５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）に入れ、酵素を添加した後、３０℃、６０分間反応させた。遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した（Fernell & King, Analyst, 78, 80-83, 1953 ）。その結果、０．１Ｕの酵素Ａを用いた場合１ｇの木綿繊維あたりガラクツロン酸として約２．３mgのペクチン遊離量が認められた。しかしながら酵素Ｂではペクチン遊離量は認められなかった。以上の結果から酵素ＡはＡ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼであり、酵素Ｂはプロトペクチナーゼ活性を示さないペクチン酸リアーゼであると判断された。
【００２９】
（１０）金属イオンの影響
５mMのＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、１０分間、恒温した後、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍に希釈した。標準酵素活性測定法で塩化カルシウムの代わりに各種金属塩を加え、反応性に対する影響を調べた。その結果、酵素Ａはバリウム、亜鉛、鉄（II）イオンの各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であった。酵素Ｂはカルシウムイオンに比べストロンチウムイオンで約６０％、鉄（III）イオンで約３０％の反応速度であった。
次に２mMのＥＤＴＡを含む５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃、３０分間恒温した。処理した酵素液を５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法により残存活性を測定した。上記の処理により酵素Ａは各金属イオンに対し極めて安定であった。酵素Ｂも各種イオンに対し極めて安定であったが、銀イオンにより完全に阻害され、銅イオンにより約５０％阻害された。
【００３０】
（１１）各種化合物の影響
ＥＤＴＡ、トリポリリン酸等のキレート剤（０．１〜０．５％）、ソフタノール７０Ｈ、アルキルグルコシド等の界面活性剤（０．１％）を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、３０分間恒温した後氷冷し、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍希釈し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、酵素Ａ、Ｂとも各種化合物により阻害されることはなかった。
【００３１】
このように本発明品の酵素Ａは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡタイプの酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１１にあり、分子量約１６kDa （ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約２７kDa）である。
また酵素Ｂは、プロトペクチナーゼ活性を有しないタイプの酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１０．５にあり、分子量は約２８kDa（ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３２kDa）である。これらの性質を有する本発明酵素は、以上の点で従来のFusarium oxysporum f. sp. ciceri株、Fusarium solani f. sp. pisi株、Bacillus sp. YA-14株、及びAmycolata sp.の生産するアルカリペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
【００３２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
【００３３】
実施例１：アルカリペクチン酸リアーゼのスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王（株）の微生物保存室に保有の菌株をペクチンを含有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行い、菌が生育した後、５℃にて１日静置した。ペクチンの分解に起因してコロニー周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株を得た。
【００３４】
実施例２：ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養
上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、１日間振盪培養を行った。培地組成は１％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００３５】
実施例３：酵素Ａ、Ｂの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養液を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）し、その上澄液（５１５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）を行い沈殿物を回収した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（２４０ml）のうち８０mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた（２９５ml）。次に１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたＳＰトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×２０cm）へ上記の非吸着画分１５０mlを添着した。０から０．２Ｍの塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法により、吸着したタンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼは０．１Ｍ及び０．１５Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で２種類溶出され、０．１５Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として検出された。本精製酵素をペクチン酸リアーゼＢとした。０．１Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼは単一のタンパク質ではなかったため、限外ろ過（アミコンメンブランＹＭ−３）を用いて濃縮し、０．２mM塩化カルシウムを含む１０mMリン酸緩衝液（pH７）により平衡化したハイドロキシアパタイト（Bio Rad社製）カラム（１．６×１０cm）へ添着した。同緩衝液と０．２mM塩化カルシウムを含む１００mMリン酸緩衝液（pH７）による濃度勾配溶出法により、タンパク質を溶出し、８５mM付近のリン酸緩衝液で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として検出された。本精製酵素を酵素Ａとした。上記精製操作により酵素Ａは約３０倍、酵素Ｂは約３５倍までそれぞれ精製された。得られた精製酵素は前記の酵素学的性質を有していた。
【００３６】
【発明の効果】
本発明ペクチン酸リアーゼは、高アルカリ条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素Ａの活性に及ぼすpHの影響を、pH１１の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図２】本発明酵素Ｂの活性に及ぼすpHの影響を、pH１０．５の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図３】本発明酵素Ａの活性に及ぼす温度の影響を、４５℃の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図４】本発明酵素Ｂの活性に及ぼす温度の影響を、４０℃の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リアーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを産生する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、１９６２年、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyxa）及びエルビニア カルトボーラ（Erwinia cartovora）の培養液に初めて見い出され、ペクチン酸に対してβ−脱離反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ４〜Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であり、反応にカルシウムイオンを必要としている（Starr & Moran, Science, 135, 920-921, 1962）。
【０００３】
一般に、細菌由来（Pseudomonas属、Erwinia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知られている（Rombouts & Pilnik, Economic Microbiol, 5, 227-282, 1980）。さらに、真菌及びいくつかの細菌由来のペクチン酸リアーゼは、その最適pHがpH１０〜１０．５であると報告されている。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. cice ri株の生産する２種のアルカリペクチン酸リアーゼ（Artes & Tana. Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 107-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14株（Han et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20, 655-662, 1992）、Amycolata sp.株（Bruhlmom, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）等が生産する酵素が知られている。
【０００４】
一方洗剤工業界においてもペクチナーゼを工業的に利用しようとする試みがなされており、例えば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９０号等の技術が知られている。前者においては、セルラーゼは繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で泥汚れ洗浄力に対する効果について述べられているが、完全に精製された酵素を用いていないためにその効果に関しては明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとして洗浄剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が開示されているが、これはリゾプス属のセルラーゼ及びペクチナーゼを併用することで洗浄力を発揮するというものであるが、いずれも中酸性領域に最適pHを有する酵素である。
【０００５】
また、植物性繊維の精練に関しては、例えば、特開昭５１−１４９９７６号公報、特公昭５７−３９６３６号公報、特開平６−２２０７７２号公報等に、ペクチナーゼ（ペクチン酸リアーゼを含む）を植物繊維の精練、非木材繊維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用することが開示されている。かかる繊維の精練においてはアルカリ領域で処理することで精練度合を高めることができるとされている。また、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高アルカリ性（pH１０〜１１）にすることによってその洗浄力を高めることができる。
【０００６】
しかし、このような高アルカリ性に最適pHを有する酵素は前述のように数例が報告されているだけで、工業的に生産されているものも無く、入手が困難である。
【０００７】
従って、本発明は高アルカリ領域において充分作用し、工業的に生産可能なアルカリペクチン酸リアーゼを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは新たなペクチン酸リアーゼを探索すべく日本国内の土壌よりスクリーニングしたところ、特定の微生物が産生する高アルカリ領域に最適反応pHを有する新規な２種類のアルカリペクチン酸リアーゼを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
【００１０】
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理）
（７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２７kDa）
（８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法）
（以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ａ」という）。
【００１１】
及び下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約３２kDa）
（７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法）
（以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ｂ」という）を提供するものである。
【００１２】
本発明はまたかかるペクチン酸リアーゼを産生するバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭＰ−１５９９１）を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の酵素Ａ及びＢは、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造される。かかるアルカリペクチン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するバチルスエスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株が挙げられる。
【００１４】
以上の菌学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株はバチルス コアグランス（Bacillus coagulans）に類似の性質を有していた。しかし、既知のバチルス コアグランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物である為、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９９１）として寄託した。
【００１７】
ＫＳＭ−Ｐ５３９株等のアルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リアーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。かくして得られた培養液中からのアルカリペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の採取及び精製法に準じて行うことができる。ＫＳＭ−Ｐ５３９株からは２種類以上のアルカリペクチン酸リアーゼが生産され、そのまま用いることもできるが、一般の酵素精製法により２種類の酵素を分離することができる。さらに公知の方法により結晶化または造粒化することもできる。
【００１８】
かくして得られる本発明のアルカリペクチン酸リアーゼの一例であるBacillus sp. ＫＳＭ−Ｐ５３９株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活性の測定は次の如くして行った。
【００１９】
（１）標準酵素活性測定法
試験管に０．２mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの４mM塩化カルシウム溶液、１mlの脱イオン水を加え、氷冷下にて０．１mlの酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加え、３０℃、５分間恒温した。反応は、０．４mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和オリゴガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラクツロニドを生成する量とした。
【００２０】
（２）最適反応pH
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９．５）、または５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１２）を用いて３０℃で最適反応pHを調べたところ、酵素Ａはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１１中で最も反応速度が高く、pH１０．５〜１２．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した。しかしトリス−塩酸緩衝液中では殆ど活性は認められなかった。酵素Ｂはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０〜１１の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した。トリス−塩酸緩衝液中ではpH９．５で最も反応速度が高かったが、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の最高活性に比べると約半分の活性であった（図１及び図２）。
【００２１】
（３）pH安定性
４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH４〜１２）中に０．１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、酵素ＡはpH４〜８、酵素ＢはpH４〜１０の範囲で極めて安定であった。また酵素Ｂの安定性に塩化カルシウムの添加効果が認められた。
【００２２】
（４）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中にて２０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、両酵素は２０℃〜５０℃の広範囲において作用し、酵素Ａの最適反応温度は４５℃であり、酵素Ｂの最適反応温度は４０℃であった（図３及び図４）。
【００２３】
（５）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mM塩化カルシウムを添加した系及び無添加の系を用意し、酵素を加えて３０℃〜７０℃の各温度で２０分間放置した。その後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性法にて調べた。その結果、酵素Ａは塩化カルシウム存在下で４０℃まで安定であった。酵素Ｂの耐熱性は同様に塩化カルシウム存在下で若干安定化されるものの酵素Ａに比べ耐熱性は低いことが判った。
【００２４】
（６）分子量
ａ．ゲルろ過法
１mM塩化カルシウム及び０．１Ｍ塩化カリウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したセファデックスＧ−７５ Superfine（１．５cm×７１cm）を用いて、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約１６kDa、酵素Ｂは約２８kDa と見積もられた。なお、検量線を作成する為の標準タンパク質としてファルマシア社製のＬＭＷゲルろ過キャリブレーションキットを用いた。
【００２５】
ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
１５％ポリアクリルアミドゲルを用い、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約２７kDa 、酵素Ｂは約３２kDa と見積もられた。なお、標準タンパク質としてバイオラッド社製の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Molecular Weight Standards, Low Rangeを用いた。
【００２６】
（７）等電点
pH８〜１０．５のアンフォライン（ファルマライト、ファルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用い、等電点電気泳動法で測定した結果、酵素Ａの等電点はpH１０．１付近、酵素Ｂの等電点はpH１０．５付近であった。
【００２７】
（８）アミノ末端アミノ酸配列
酵素ＡまたはＢをProSorb フィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（６７４型、アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端アミノ酸配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結果、酵素ＡはＡＰＴＶＶＮＳＴＩＶＶＰＫＧＧＴＹＹＧＱであり、酵素ＢはＡＤＡＳＧＴＴＡＳＭＳＤＩＬＫＮＱＲＰＤであった。
【００２８】
（９）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチンを基質とした場合の反応速度を標準酵素活性測定法を用いて調べた。酵素Ａは、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた時の約２倍の反応速度であった。エステル化度２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対活性は２０、５、７％（ＩＣＮ社製のポリガラクツロン酸に対する反応速度を１００とした場合）とエステル化度の増加に伴い、その反応性は減少したが、若干の作用は示した。一方酵素Ｂはポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高かったが、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた場合、ほぼ同じ反応速度であった。エステル化度２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対反応速度は９４、４３、９％と減少したが、酵素Ａに比べ２８、６７％のエステル化度を有するペクチンに対し高い分解活性を示した。さらにWardとFogarty の方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、両酵素はペクチン酸（ＩＣＮ社製）に対する反応速度と同程度の反応速度で分解した。
次に基質として木綿糸（カナガワヌイイト社製、金鈴印シロモ、４０／３甘より）を３０cm（約１３mg）を０．６mM塩化カルシウムを含む５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）に入れ、酵素を添加した後、３０℃、６０分間反応させた。遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した（Fernell & King, Analyst, 78, 80-83, 1953 ）。その結果、０．１Ｕの酵素Ａを用いた場合１ｇの木綿繊維あたりガラクツロン酸として約２．３mgのペクチン遊離量が認められた。しかしながら酵素Ｂではペクチン遊離量は認められなかった。以上の結果から酵素ＡはＡ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼであり、酵素Ｂはプロトペクチナーゼ活性を示さないペクチン酸リアーゼであると判断された。
【００２９】
（１０）金属イオンの影響
５mMのＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、１０分間、恒温した後、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍に希釈した。標準酵素活性測定法で塩化カルシウムの代わりに各種金属塩を加え、反応性に対する影響を調べた。その結果、酵素Ａはバリウム、亜鉛、鉄（II）イオンの各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であった。酵素Ｂはカルシウムイオンに比べストロンチウムイオンで約６０％、鉄（III）イオンで約３０％の反応速度であった。
次に２mMのＥＤＴＡを含む５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃、３０分間恒温した。処理した酵素液を５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法により残存活性を測定した。上記の処理により酵素Ａは各金属イオンに対し極めて安定であった。酵素Ｂも各種イオンに対し極めて安定であったが、銀イオンにより完全に阻害され、銅イオンにより約５０％阻害された。
【００３０】
（１１）各種化合物の影響
ＥＤＴＡ、トリポリリン酸等のキレート剤（０．１〜０．５％）、ソフタノール７０Ｈ、アルキルグルコシド等の界面活性剤（０．１％）を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、３０分間恒温した後氷冷し、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍希釈し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、酵素Ａ、Ｂとも各種化合物により阻害されることはなかった。
【００３１】
このように本発明品の酵素Ａは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡタイプの酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１１にあり、分子量約１６kDa （ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約２７kDa）である。
また酵素Ｂは、プロトペクチナーゼ活性を有しないタイプの酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１０．５にあり、分子量は約２８kDa（ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３２kDa）である。これらの性質を有する本発明酵素は、以上の点で従来のFusarium oxysporum f. sp. ciceri株、Fusarium solani f. sp. pisi株、Bacillus sp. YA-14株、及びAmycolata sp.の生産するアルカリペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
【００３２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
【００３３】
実施例１：アルカリペクチン酸リアーゼのスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王（株）の微生物保存室に保有の菌株をペクチンを含有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行い、菌が生育した後、５℃にて１日静置した。ペクチンの分解に起因してコロニー周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株を得た。
【００３４】
実施例２：ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養
上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、１日間振盪培養を行った。培地組成は１％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００３５】
実施例３：酵素Ａ、Ｂの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養液を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）し、その上澄液（５１５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）を行い沈殿物を回収した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（２４０ml）のうち８０mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた（２９５ml）。次に１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたＳＰトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×２０cm）へ上記の非吸着画分１５０mlを添着した。０から０．２Ｍの塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法により、吸着したタンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼは０．１Ｍ及び０．１５Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で２種類溶出され、０．１５Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として検出された。本精製酵素をペクチン酸リアーゼＢとした。０．１Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼは単一のタンパク質ではなかったため、限外ろ過（アミコンメンブランＹＭ−３）を用いて濃縮し、０．２mM塩化カルシウムを含む１０mMリン酸緩衝液（pH７）により平衡化したハイドロキシアパタイト（Bio Rad社製）カラム（１．６×１０cm）へ添着した。同緩衝液と０．２mM塩化カルシウムを含む１００mMリン酸緩衝液（pH７）による濃度勾配溶出法により、タンパク質を溶出し、８５mM付近のリン酸緩衝液で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として検出された。本精製酵素を酵素Ａとした。上記精製操作により酵素Ａは約３０倍、酵素Ｂは約３５倍までそれぞれ精製された。得られた精製酵素は前記の酵素学的性質を有していた。
【００３６】
【発明の効果】
本発明ペクチン酸リアーゼは、高アルカリ条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素Ａの活性に及ぼすpHの影響を、pH１１の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図２】本発明酵素Ｂの活性に及ぼすpHの影響を、pH１０．５の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図３】本発明酵素Ａの活性に及ぼす温度の影響を、４５℃の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
【図４】本発明酵素Ｂの活性に及ぼす温度の影響を、４０℃の活性を１００とした場合の相対値で表したものである。
Claims (3)
- 下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ。
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理）
（７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２７kDa）
（８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法） - 下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ。
（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理）
（５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約３２kDa）
（７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法） - 請求項１または２記載のペクチン酸リアーゼを産生するバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭＰ−１５９９１）。
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