JPH11318443A - アルカリペクチン酸リアーゼ - Google Patents
アルカリペクチン酸リアーゼInfo
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- JPH11318443A JPH11318443A JP12738598A JP12738598A JPH11318443A JP H11318443 A JPH11318443 A JP H11318443A JP 12738598 A JP12738598 A JP 12738598A JP 12738598 A JP12738598 A JP 12738598A JP H11318443 A JPH11318443 A JP H11318443A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 洗浄剤、繊維処理剤等として有用なアルカリ
ペクチン酸リアーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを
産生する微生物の提供。 【解決手段】 ペクチン酸、酸可溶性ペクチン等に作用
し、最適反応pHが１０．５または１１．０にある等の酵
素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、該ペ
クチン酸リアーゼを産生するバチルス属に属する微生
物。
ペクチン酸リアーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを
産生する微生物の提供。 【解決手段】 ペクチン酸、酸可溶性ペクチン等に作用
し、最適反応pHが１０．５または１１．０にある等の酵
素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ、該ペ
クチン酸リアーゼを産生するバチルス属に属する微生
物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は洗浄剤、食品加工
剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リア
ーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを産生する微生物
に関する。
剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リア
ーゼ、該アルカリペクチン酸リアーゼを産生する微生物
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ペクチ
ン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、１９６２
年、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyxa）及び
エルビニア カルトボーラ（Erwinia cartovora）の培
養液に初めて見い出され、ペクチン酸に対してβ−脱離
反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ
４〜Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であり、反応にカル
シウムイオンを必要としている（Starr & Moran, Scien
ce, 135, 920-921, 1962）。
ン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、１９６２
年、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyxa）及び
エルビニア カルトボーラ（Erwinia cartovora）の培
養液に初めて見い出され、ペクチン酸に対してβ−脱離
反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ
４〜Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であり、反応にカル
シウムイオンを必要としている（Starr & Moran, Scien
ce, 135, 920-921, 1962）。
【０００３】一般に、細菌由来（Pseudomonas属、Erwin
ia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応
pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知
られている（Rombouts & Pilnik, Economic Microbiol,
5, 227-282, 1980）。さらに、真菌及びいくつかの細
菌由来のペクチン酸リアーゼは、その最適pHがpH１０〜
１０．５であると報告されている。例えば、Fusarium o
xysporum f. sp. ciceri株の生産する２種のアルカリペ
クチン酸リアーゼ（Artes & Tana. Physiol. Mol. Plan
t Pathol., 37, 107-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14
株（Han et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotech
nol., 20, 655-662, 1992）、Amycolatasp.株（Bruhlmo
m, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 199
5）等が生産する酵素が知られている。
ia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応
pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知
られている（Rombouts & Pilnik, Economic Microbiol,
5, 227-282, 1980）。さらに、真菌及びいくつかの細
菌由来のペクチン酸リアーゼは、その最適pHがpH１０〜
１０．５であると報告されている。例えば、Fusarium o
xysporum f. sp. ciceri株の生産する２種のアルカリペ
クチン酸リアーゼ（Artes & Tana. Physiol. Mol. Plan
t Pathol., 37, 107-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14
株（Han et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotech
nol., 20, 655-662, 1992）、Amycolatasp.株（Bruhlmo
m, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 199
5）等が生産する酵素が知られている。
【０００４】一方洗剤工業界においてもペクチナーゼを
工業的に利用しようとする試みがなされており、例え
ば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９
０号等の技術が知られている。前者においては、セルラ
ーゼは繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で
泥汚れ洗浄力に対する効果について述べられているが、
完全に精製された酵素を用いていないためにその効果に
関しては明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとし
て洗浄剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が
開示されているが、これはリゾプス属のセルラーゼ及び
ペクチナーゼを併用することで洗浄力を発揮するという
ものであるが、いずれも中酸性領域に最適pHを有する酵
素である。
工業的に利用しようとする試みがなされており、例え
ば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９
０号等の技術が知られている。前者においては、セルラ
ーゼは繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で
泥汚れ洗浄力に対する効果について述べられているが、
完全に精製された酵素を用いていないためにその効果に
関しては明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとし
て洗浄剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が
開示されているが、これはリゾプス属のセルラーゼ及び
ペクチナーゼを併用することで洗浄力を発揮するという
ものであるが、いずれも中酸性領域に最適pHを有する酵
素である。
【０００５】また、植物性繊維の精練に関しては、例え
ば、特開昭５１−１４９９７６号公報、特公昭５７−３
９６３６号公報、特開平６−２２０７７２号公報等に、
ペクチナーゼ（ペクチン酸リアーゼを含む）を植物繊維
の精練、非木材繊維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用
することが開示されている。かかる繊維の精練において
はアルカリ領域で処理することで精練度合を高めること
ができるとされている。また、一般の衣料用洗剤や漂白
剤も高アルカリ性（pH１０〜１１）にすることによって
その洗浄力を高めることができる。
ば、特開昭５１−１４９９７６号公報、特公昭５７−３
９６３６号公報、特開平６−２２０７７２号公報等に、
ペクチナーゼ（ペクチン酸リアーゼを含む）を植物繊維
の精練、非木材繊維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用
することが開示されている。かかる繊維の精練において
はアルカリ領域で処理することで精練度合を高めること
ができるとされている。また、一般の衣料用洗剤や漂白
剤も高アルカリ性（pH１０〜１１）にすることによって
その洗浄力を高めることができる。
【０００６】しかし、このような高アルカリ性に最適pH
を有する酵素は前述のように数例が報告されているだけ
で、工業的に生産されているものも無く、入手が困難で
ある。
を有する酵素は前述のように数例が報告されているだけ
で、工業的に生産されているものも無く、入手が困難で
ある。
【０００７】従って、本発明は高アルカリ領域において
充分作用し、工業的に生産可能なアルカリペクチン酸リ
アーゼを提供することを目的とする。
充分作用し、工業的に生産可能なアルカリペクチン酸リ
アーゼを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは新たなペク
チン酸リアーゼを探索すべく日本国内の土壌よりスクリ
ーニングしたところ、特定の微生物が産生する高アルカ
リ領域に最適反応pHを有する新規な２種類のアルカリペ
クチン酸リアーゼを見出し本発明を完成した。
チン酸リアーゼを探索すべく日本国内の土壌よりスクリ
ーニングしたところ、特定の微生物が産生する高アルカ
リ領域に最適反応pHを有する新規な２種類のアルカリペ
クチン酸リアーゼを見出し本発明を完成した。
【０００９】すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を
有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
有するアルカリペクチン酸リアーゼ、
【００１０】（１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロ
ン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断す
ると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し
不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリ
ガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作
用する。 （３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロ
ビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウ
ムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理） （７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約２７kDa） （８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法） （以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ａ」と
いう）。
ン酸）をβ−脱離反応によってα−１，４結合を切断す
ると共に非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し
不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリ
ガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作
用する。 （３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロ
ビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウ
ムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理） （７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約２７kDa） （８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法） （以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ａ」と
いう）。
【００１１】及び下記の酵素学的性質を有するアルカリ
ペクチン酸リアーゼ、 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−
脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還
元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴ
ガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン
酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・
ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約３２kDa） （７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法） （以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ｂ」と
いう）を提供するものである。
ペクチン酸リアーゼ、 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−
脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還
元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴ
ガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン
酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・
ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約３２kDa） （７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法） （以下かかる酵素学的性質を有するものを「酵素Ｂ」と
いう）を提供するものである。
【００１２】本発明はまたかかるペクチン酸リアーゼを
産生するバチルス属に属する微生物を提供するものであ
る。
産生するバチルス属に属する微生物を提供するものであ
る。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の酵素Ａ及びＢは、アルカ
リペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物から
採取することにより製造される。かかるアルカリペクチ
ン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例え
ば下記の菌学的性質を有するバチルスエスピーＫＳＭ−
Ｐ５３９株が挙げられる。
リペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物から
採取することにより製造される。かかるアルカリペクチ
ン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例え
ば下記の菌学的性質を有するバチルスエスピーＫＳＭ−
Ｐ５３９株が挙げられる。
【００１４】〔バチルスＫＳＭ−Ｐ５３９株の分類学的
性質〕 Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌（０．３〜０．５×
１．５〜２．１μｍ） （ｂ）多形成 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の関係） ０．５〜０．６×１．３〜１．５μｍ 楕円、中央、膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上の生育 黄白色、周縁は葉状 （ｈ）リトマスミルク 酸性化、液化しない
性質〕 Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌（０．３〜０．５×
１．５〜２．１μｍ） （ｂ）多形成 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の関係） ０．５〜０．６×１．３〜１．５μｍ 楕円、中央、膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上の生育 黄白色、周縁は葉状 （ｈ）リトマスミルク 酸性化、液化しない
【００１５】Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 陰性 （ｂ）脱窒反応 陰性 （ｃ）ＭＲテスト 陽性（pH５．５） （ｄ）ＶＰテスト 陰性 （ｅ）インドール生成 陰性 （ｆ）硫化水素生成 陽性 （ｇ）デンプン加水分解 陽性 （ｈ）クエン酸の利用 陰性 （ｉ）無機窒素の利用 硝酸塩、アンモニウム塩
を利用する。 （ｊ）色素の生成 無し （ｋ）ウレアーゼ 陰性 （ｌ）オキシダーゼ 陽性 （ｍ）生育の温度範囲 ２１℃〜５１℃ （ｎ）生育のpH範囲 pH６〜９．５ （ｏ）生育における酸素の影響 嫌気条件下で生育 （ｐ）ＯＦテスト 生育するが、色調の変化
は認められない。 （ｑ）グルコースからのガス酸性 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性 ７％塩化ナトリウ
ム含有培地上で生育できない。 （ｓ）糖からの酸生成 ガラクトース、キシロー
ス、アラビノース、シュークロース、グルコース、マン
ニトール、マンノース、イノシトール、トレハロース、
ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、
ラフィノース、メリビオース、可溶性でんぷんからは、
糖酸生成有り、ソルビトールからは酸生成無し。
を利用する。 （ｊ）色素の生成 無し （ｋ）ウレアーゼ 陰性 （ｌ）オキシダーゼ 陽性 （ｍ）生育の温度範囲 ２１℃〜５１℃ （ｎ）生育のpH範囲 pH６〜９．５ （ｏ）生育における酸素の影響 嫌気条件下で生育 （ｐ）ＯＦテスト 生育するが、色調の変化
は認められない。 （ｑ）グルコースからのガス酸性 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性 ７％塩化ナトリウ
ム含有培地上で生育できない。 （ｓ）糖からの酸生成 ガラクトース、キシロー
ス、アラビノース、シュークロース、グルコース、マン
ニトール、マンノース、イノシトール、トレハロース、
ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、
ラフィノース、メリビオース、可溶性でんぷんからは、
糖酸生成有り、ソルビトールからは酸生成無し。
【００１６】以上の菌学的性質について「Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス コアグランス（Bacillus coagulans）に類似
の性質を有していた。しかし、既知のバチルス コアグ
ランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物であ
る為、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルス
エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５９９１）として寄託した。
ual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス コアグランス（Bacillus coagulans）に類似
の性質を有していた。しかし、既知のバチルス コアグ
ランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物であ
る為、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルス
エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ５３９（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５９９１）として寄託した。
【００１７】ＫＳＭ−Ｐ５３９株等のアルカリペクチン
酸リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リ
アーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源
その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培
養すれば良い。かくして得られた培養液中からのアルカ
リペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の採取及
び精製法に準じて行うことができる。ＫＳＭ−Ｐ５３９
株からは２種類以上のアルカリペクチン酸リアーゼが生
産され、そのまま用いることもできるが、一般の酵素精
製法により２種類の酵素を分離することができる。さら
に公知の方法により結晶化または造粒化することもでき
る。
酸リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リ
アーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源
その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培
養すれば良い。かくして得られた培養液中からのアルカ
リペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の採取及
び精製法に準じて行うことができる。ＫＳＭ−Ｐ５３９
株からは２種類以上のアルカリペクチン酸リアーゼが生
産され、そのまま用いることもできるが、一般の酵素精
製法により２種類の酵素を分離することができる。さら
に公知の方法により結晶化または造粒化することもでき
る。
【００１８】かくして得られる本発明のアルカリペクチ
ン酸リアーゼの一例であるBacillussp. ＫＳＭ−Ｐ５３
９株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、以下に示す
ような理化学的性質を有する。なお、酵素活性の測定は
次の如くして行った。
ン酸リアーゼの一例であるBacillussp. ＫＳＭ−Ｐ５３
９株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、以下に示す
ような理化学的性質を有する。なお、酵素活性の測定は
次の如くして行った。
【００１９】（１）標準酵素活性測定法 試験管に０．２mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの４mM塩化カルシウ
ム溶液、１mlの脱イオン水を加え、氷冷下にて０．１ml
の酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加え、３０
℃、５分間恒温した。反応は、０．４mlの１％（ｗ／
ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社：Lot 1448
2、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したも
の）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、
２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽
和オリゴガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を
測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６０
０（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1
966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加え
ずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後
に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単
位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmo
l の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラク
ツロニドを生成する量とした。
ム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの４mM塩化カルシウ
ム溶液、１mlの脱イオン水を加え、氷冷下にて０．１ml
の酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加え、３０
℃、５分間恒温した。反応は、０．４mlの１％（ｗ／
ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社：Lot 1448
2、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したも
の）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、
２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽
和オリゴガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を
測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６０
０（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1
966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加え
ずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後
に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単
位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmo
l の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラク
ツロニドを生成する量とした。
【００２０】（２）最適反応pH ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９．５）、または５
０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１２）
を用いて３０℃で最適反応pHを調べたところ、酵素Ａは
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１１中で最も反応
速度が高く、pH１０．５〜１２．０の範囲内において最
高活性の７０％以上の活性を示した。しかしトリス−塩
酸緩衝液中では殆ど活性は認められなかった。酵素Ｂは
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も
反応速度が高く、pH１０〜１１の範囲内において最高活
性の７０％以上の活性を示した。トリス−塩酸緩衝液中
ではpH９．５で最も反応速度が高かったが、グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液の最高活性に比べると約半分の
活性であった（図１及び図２）。
０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１２）
を用いて３０℃で最適反応pHを調べたところ、酵素Ａは
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１１中で最も反応
速度が高く、pH１０．５〜１２．０の範囲内において最
高活性の７０％以上の活性を示した。しかしトリス−塩
酸緩衝液中では殆ど活性は認められなかった。酵素Ｂは
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も
反応速度が高く、pH１０〜１１の範囲内において最高活
性の７０％以上の活性を示した。トリス−塩酸緩衝液中
ではpH９．５で最も反応速度が高かったが、グリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液の最高活性に比べると約半分の
活性であった（図１及び図２）。
【００２１】（３）pH安定性 ４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH４〜１
２）中に０．１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添
加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した
後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結
果、酵素ＡはpH４〜８、酵素ＢはpH４〜１０の範囲で極
めて安定であった。また酵素Ｂの安定性に塩化カルシウ
ムの添加効果が認められた。
２）中に０．１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添
加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した
後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結
果、酵素ＡはpH４〜８、酵素ＢはpH４〜１０の範囲で極
めて安定であった。また酵素Ｂの安定性に塩化カルシウ
ムの添加効果が認められた。
【００２２】（４）最適反応温度 ５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．
５）中にて２０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、両酵素は２０℃〜５
０℃の広範囲において作用し、酵素Ａの最適反応温度は
４５℃であり、酵素Ｂの最適反応温度は４０℃であった
（図３及び図４）。
５）中にて２０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、両酵素は２０℃〜５
０℃の広範囲において作用し、酵素Ａの最適反応温度は
４５℃であり、酵素Ｂの最適反応温度は４０℃であった
（図３及び図４）。
【００２３】（５）耐熱性 ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mM塩化カル
シウムを添加した系及び無添加の系を用意し、酵素を加
えて３０℃〜７０℃の各温度で２０分間放置した。その
後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性法にて調べ
た。その結果、酵素Ａは塩化カルシウム存在下で４０℃
まで安定であった。酵素Ｂの耐熱性は同様に塩化カルシ
ウム存在下で若干安定化されるものの酵素Ａに比べ耐熱
性は低いことが判った。
シウムを添加した系及び無添加の系を用意し、酵素を加
えて３０℃〜７０℃の各温度で２０分間放置した。その
後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性法にて調べ
た。その結果、酵素Ａは塩化カルシウム存在下で４０℃
まで安定であった。酵素Ｂの耐熱性は同様に塩化カルシ
ウム存在下で若干安定化されるものの酵素Ａに比べ耐熱
性は低いことが判った。
【００２４】（６）分子量 ａ．ゲルろ過法 １mM塩化カルシウム及び０．１Ｍ塩化カリウムを含む２
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−７５ Superfine（１．５cm×７１cm）を
用いて、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約
１６kDa、酵素Ｂは約２８kDa と見積もられた。なお、
検量線を作成する為の標準タンパク質としてファルマシ
ア社製のＬＭＷゲルろ過キャリブレーションキットを用
いた。
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−７５ Superfine（１．５cm×７１cm）を
用いて、酵素Ａ、Ｂの分子量を求めた結果、酵素Ａは約
１６kDa、酵素Ｂは約２８kDa と見積もられた。なお、
検量線を作成する為の標準タンパク質としてファルマシ
ア社製のＬＭＷゲルろ過キャリブレーションキットを用
いた。
【００２５】ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法 １５％ポリアクリルアミドゲルを用い、酵素Ａ、Ｂの分
子量を求めた結果、酵素Ａは約２７kDa 、酵素Ｂは約３
２kDa と見積もられた。なお、標準タンパク質としてバ
イオラッド社製の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Molecular Weigh
t Standards, Low Rangeを用いた。
子量を求めた結果、酵素Ａは約２７kDa 、酵素Ｂは約３
２kDa と見積もられた。なお、標準タンパク質としてバ
イオラッド社製の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Molecular Weigh
t Standards, Low Rangeを用いた。
【００２６】（７）等電点 pH８〜１０．５のアンフォライン（ファルマライト、フ
ァルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを
用い、等電点電気泳動法で測定した結果、酵素Ａの等電
点はpH１０．１付近、酵素Ｂの等電点はpH１０．５付近
であった。
ァルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを
用い、等電点電気泳動法で測定した結果、酵素Ａの等電
点はpH１０．１付近、酵素Ｂの等電点はpH１０．５付近
であった。
【００２７】（８）アミノ末端アミノ酸配列 酵素ＡまたはＢをProSorb フィルター（パーキンエルマ
ー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサ
ー（６７４型、アプライドバイオシステム社製）を用い
てアミノ末端アミノ酸配列を２０番目のアミノ酸まで決
定した結果、酵素ＡはＡＰＴＶＶＮＳＴＩＶＶＰＫＧＧ
ＴＹＹＧＱであり、酵素ＢはＡＤＡＳＧＴＴＡＳＭＳＤ
ＩＬＫＮＱＲＰＤであった。
ー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサ
ー（６７４型、アプライドバイオシステム社製）を用い
てアミノ末端アミノ酸配列を２０番目のアミノ酸まで決
定した結果、酵素ＡはＡＰＴＶＶＮＳＴＩＶＶＰＫＧＧ
ＴＹＹＧＱであり、酵素ＢはＡＤＡＳＧＴＴＡＳＭＳＤ
ＩＬＫＮＱＲＰＤであった。
【００２８】（９）基質特異性 ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペ
クチンを基質とした場合の反応速度を標準酵素活性測定
法を用いて調べた。酵素Ａは、ポリガラクツロン酸（Ｉ
ＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高く、同
じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を
用いた時の約２倍の反応速度であった。エステル化度２
８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対活
性は２０、５、７％（ＩＣＮ社製のポリガラクツロン酸
に対する反応速度を１００とした場合）とエステル化度
の増加に伴い、その反応性は減少したが、若干の作用は
示した。一方酵素Ｂはポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社
製、Lot 14482）に対して最も反応性が高かったが、同
じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を
用いた場合、ほぼ同じ反応速度であった。エステル化度
２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対
反応速度は９４、４３、９％と減少したが、酵素Ａに比
べ２８、６７％のエステル化度を有するペクチンに対し
高い分解活性を示した。さらにWardとFogarty の方法
（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い酸
可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、両酵素はペ
クチン酸（ＩＣＮ社製）に対する反応速度と同程度の反
応速度で分解した。次に基質として木綿糸（カナガワヌ
イイト社製、金鈴印シロモ、４０／３甘より）を３０cm
（約１３mg）を０．６mM塩化カルシウムを含む５０mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）に入
れ、酵素を添加した後、３０℃、６０分間反応させた。
遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した
（Fernell & King, Analyst, 78, 80-83, 1953 ）。そ
の結果、０．１Ｕの酵素Ａを用いた場合１ｇの木綿繊維
あたりガラクツロン酸として約２．３mgのペクチン遊離
量が認められた。しかしながら酵素Ｂではペクチン遊離
量は認められなかった。以上の結果から酵素ＡはＡ−タ
イプのプロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リア
ーゼであり、酵素Ｂはプロトペクチナーゼ活性を示さな
いペクチン酸リアーゼであると判断された。
クチンを基質とした場合の反応速度を標準酵素活性測定
法を用いて調べた。酵素Ａは、ポリガラクツロン酸（Ｉ
ＣＮ社製、Lot 14482）に対して最も反応性が高く、同
じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を
用いた時の約２倍の反応速度であった。エステル化度２
８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対活
性は２０、５、７％（ＩＣＮ社製のポリガラクツロン酸
に対する反応速度を１００とした場合）とエステル化度
の増加に伴い、その反応性は減少したが、若干の作用は
示した。一方酵素Ｂはポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社
製、Lot 14482）に対して最も反応性が高かったが、同
じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を
用いた場合、ほぼ同じ反応速度であった。エステル化度
２８、６７、９３％のペクチンを基質とした場合、相対
反応速度は９４、４３、９％と減少したが、酵素Ａに比
べ２８、６７％のエステル化度を有するペクチンに対し
高い分解活性を示した。さらにWardとFogarty の方法
（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い酸
可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、両酵素はペ
クチン酸（ＩＣＮ社製）に対する反応速度と同程度の反
応速度で分解した。次に基質として木綿糸（カナガワヌ
イイト社製、金鈴印シロモ、４０／３甘より）を３０cm
（約１３mg）を０．６mM塩化カルシウムを含む５０mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）に入
れ、酵素を添加した後、３０℃、６０分間反応させた。
遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した
（Fernell & King, Analyst, 78, 80-83, 1953 ）。そ
の結果、０．１Ｕの酵素Ａを用いた場合１ｇの木綿繊維
あたりガラクツロン酸として約２．３mgのペクチン遊離
量が認められた。しかしながら酵素Ｂではペクチン遊離
量は認められなかった。以上の結果から酵素ＡはＡ−タ
イプのプロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リア
ーゼであり、酵素Ｂはプロトペクチナーゼ活性を示さな
いペクチン酸リアーゼであると判断された。
【００２９】（１０）金属イオンの影響 ５mMのＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）に酵素液を加え、３０℃、１０分間、恒温した
後、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍に
希釈した。標準酵素活性測定法で塩化カルシウムの代わ
りに各種金属塩を加え、反応性に対する影響を調べた。
その結果、酵素Ａはバリウム、亜鉛、鉄（II）イオンの
各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められた
が、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反
応速度であった。酵素Ｂはカルシウムイオンに比べスト
ロンチウムイオンで約６０％、鉄（III）イオンで約３
０％の反応速度であった。次に２mMのＥＤＴＡを含む５
０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液
を５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属
塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３
０℃、３０分間恒温した。処理した酵素液を５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性
測定法により残存活性を測定した。上記の処理により酵
素Ａは各金属イオンに対し極めて安定であった。酵素Ｂ
も各種イオンに対し極めて安定であったが、銀イオンに
より完全に阻害され、銅イオンにより約５０％阻害され
た。
７．５）に酵素液を加え、３０℃、１０分間、恒温した
後、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で１０倍に
希釈した。標準酵素活性測定法で塩化カルシウムの代わ
りに各種金属塩を加え、反応性に対する影響を調べた。
その結果、酵素Ａはバリウム、亜鉛、鉄（II）イオンの
各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められた
が、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反
応速度であった。酵素Ｂはカルシウムイオンに比べスト
ロンチウムイオンで約６０％、鉄（III）イオンで約３
０％の反応速度であった。次に２mMのＥＤＴＡを含む５
０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液
を５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属
塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３
０℃、３０分間恒温した。処理した酵素液を５０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性
測定法により残存活性を測定した。上記の処理により酵
素Ａは各金属イオンに対し極めて安定であった。酵素Ｂ
も各種イオンに対し極めて安定であったが、銀イオンに
より完全に阻害され、銅イオンにより約５０％阻害され
た。
【００３０】（１１）各種化合物の影響 ＥＤＴＡ、トリポリリン酸等のキレート剤（０．１〜
０．５％）、ソフタノール７０Ｈ、アルキルグルコシド
等の界面活性剤（０．１％）を含む５０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、３０分間
恒温した後氷冷し、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
５）で１０倍希釈し、残存活性を標準酵素活性測定法に
て調べた。その結果、酵素Ａ、Ｂとも各種化合物により
阻害されることはなかった。
０．５％）、ソフタノール７０Ｈ、アルキルグルコシド
等の界面活性剤（０．１％）を含む５０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH７．５）に酵素液を加え、３０℃、３０分間
恒温した後氷冷し、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
５）で１０倍希釈し、残存活性を標準酵素活性測定法に
て調べた。その結果、酵素Ａ、Ｂとも各種化合物により
阻害されることはなかった。
【００３１】このように本発明品の酵素Ａは、プロトペ
クチナーゼ活性を有するＡタイプの酵素であり、単純な
ベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１１に
あり、分子量約１６kDa （ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでは約２７kDa）である。また酵素Ｂは、プロトペク
チナーゼ活性を有しないタイプの酵素であり、単純なベ
ル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１０．５
にあり、分子量は約２８kDa（ゲルろ過法：ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約３２kDa）である。これらの性質を有する本
発明酵素は、以上の点で従来のFusarium oxysporum f.
sp. ciceri株、Fusarium solani f. sp. pisi株、Bacil
lus sp. YA-14株、及びAmycolata sp.の生産するアルカ
リペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
クチナーゼ活性を有するＡタイプの酵素であり、単純な
ベル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１１に
あり、分子量約１６kDa （ゲルろ過法：ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでは約２７kDa）である。また酵素Ｂは、プロトペク
チナーゼ活性を有しないタイプの酵素であり、単純なベ
ル型のpH−活性曲線を示し、その最適反応pHは１０．５
にあり、分子量は約２８kDa（ゲルろ過法：ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約３２kDa）である。これらの性質を有する本
発明酵素は、以上の点で従来のFusarium oxysporum f.
sp. ciceri株、Fusarium solani f. sp. pisi株、Bacil
lus sp. YA-14株、及びAmycolata sp.の生産するアルカ
リペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
【００３２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに制限されるものではない。
が、本発明はこれに制限されるものではない。
【００３３】実施例１：アルカリペクチン酸リアーゼの
スクリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）の微生物保存室に保有の菌株をペクチンを含有す
る寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行
い、菌が生育した後、５℃にて１日静置した。ペクチン
の分解に起因してコロニー周辺に溶解斑を形成した菌を
選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結
果、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス
エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株を得た。
スクリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）の微生物保存室に保有の菌株をペクチンを含有す
る寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行
い、菌が生育した後、５℃にて１日静置した。ペクチン
の分解に起因してコロニー周辺に溶解斑を形成した菌を
選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結
果、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス
エスピーＫＳＭ−Ｐ５３９株を得た。
【００３４】実施例２：ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養 上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養は、坂口フラスコに５０
mlの液体培地を加えて３０℃、１日間振盪培養を行っ
た。培地組成は１％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５
％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カ
リウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチ
ン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
ー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養は、坂口フラスコに５０
mlの液体培地を加えて３０℃、１日間振盪培養を行っ
た。培地組成は１％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５
％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カ
リウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチ
ン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００３５】実施例３：酵素Ａ、Ｂの精製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５３９株の培養液を遠
心分離（１２，０００×ｇ、２０分）し、その上澄液
（５１５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となる
ように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心
分離（１２，０００×ｇ、２０分）を行い沈殿物を回収
した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMト
リス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対
して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（２４０m
l）のうち８０mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウム
を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡
化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝
液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集
めた（２９５ml）。次に１mM塩化カルシウムを含む５０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておい
たＳＰトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．
５×２０cm）へ上記の非吸着画分１５０mlを添着した。
０から０．２Ｍの塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出
法により、吸着したタンパク質を溶出させた。ペクチン
酸リアーゼは０．１Ｍ及び０．１５Ｍ付近の塩化ナトリ
ウム濃度で２種類溶出され、０．１５Ｍ付近の塩化ナト
リウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタン
パク質として検出された。本精製酵素をペクチン酸リア
ーゼＢとした。０．１Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶
出されるペクチン酸リアーゼは単一のタンパク質ではな
かったため、限外ろ過（アミコンメンブランＹＭ−３）
を用いて濃縮し、０．２mM塩化カルシウムを含む１０mM
リン酸緩衝液（pH７）により平衡化したハイドロキシア
パタイト（Bio Rad社製）カラム（１．６×１０cm）へ
添着した。同緩衝液と０．２mM塩化カルシウムを含む１
００mMリン酸緩衝液（pH７）による濃度勾配溶出法によ
り、タンパク質を溶出し、８５mM付近のリン酸緩衝液で
溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として
検出された。本精製酵素を酵素Ａとした。上記精製操作
により酵素Ａは約３０倍、酵素Ｂは約３５倍までそれぞ
れ精製された。得られた精製酵素は前記の酵素学的性質
を有していた。
心分離（１２，０００×ｇ、２０分）し、その上澄液
（５１５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となる
ように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心
分離（１２，０００×ｇ、２０分）を行い沈殿物を回収
した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMト
リス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対
して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（２４０m
l）のうち８０mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウム
を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡
化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝
液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集
めた（２９５ml）。次に１mM塩化カルシウムを含む５０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておい
たＳＰトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．
５×２０cm）へ上記の非吸着画分１５０mlを添着した。
０から０．２Ｍの塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出
法により、吸着したタンパク質を溶出させた。ペクチン
酸リアーゼは０．１Ｍ及び０．１５Ｍ付近の塩化ナトリ
ウム濃度で２種類溶出され、０．１５Ｍ付近の塩化ナト
リウム濃度で溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一なタン
パク質として検出された。本精製酵素をペクチン酸リア
ーゼＢとした。０．１Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶
出されるペクチン酸リアーゼは単一のタンパク質ではな
かったため、限外ろ過（アミコンメンブランＹＭ−３）
を用いて濃縮し、０．２mM塩化カルシウムを含む１０mM
リン酸緩衝液（pH７）により平衡化したハイドロキシア
パタイト（Bio Rad社製）カラム（１．６×１０cm）へ
添着した。同緩衝液と０．２mM塩化カルシウムを含む１
００mMリン酸緩衝液（pH７）による濃度勾配溶出法によ
り、タンパク質を溶出し、８５mM付近のリン酸緩衝液で
溶出されるペクチン酸リアーゼはＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法において単一なタンパク質として
検出された。本精製酵素を酵素Ａとした。上記精製操作
により酵素Ａは約３０倍、酵素Ｂは約３５倍までそれぞ
れ精製された。得られた精製酵素は前記の酵素学的性質
を有していた。
【００３６】
【発明の効果】本発明ペクチン酸リアーゼは、高アルカ
リ条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料
用や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理
用酵素として有用である。
リ条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料
用や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理
用酵素として有用である。
【図１】本発明酵素Ａの活性に及ぼすpHの影響を、pH１
１の活性を１００とした場合の相対値で表したものであ
る。
１の活性を１００とした場合の相対値で表したものであ
る。
【図２】本発明酵素Ｂの活性に及ぼすpHの影響を、pH１
０．５の活性を１００とした場合の相対値で表したもの
である。
０．５の活性を１００とした場合の相対値で表したもの
である。
【図３】本発明酵素Ａの活性に及ぼす温度の影響を、４
５℃の活性を１００とした場合の相対値で表したもので
ある。
５℃の活性を１００とした場合の相対値で表したもので
ある。
【図４】本発明酵素Ｂの活性に及ぼす温度の影響を、４
０℃の活性を１００とした場合の相対値で表したもので
ある。
０℃の活性を１００とした場合の相対値で表したもので
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 凉松 淳 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 海藤 洋子 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 デコローサ ディー ルステリオ ビーオー ルズ バンゾン，ハサーン，ミ サミス オリエンタル カガヤン デ オ ロ シティ，ミンダナオ 9003，フィリピ ン ピリピナス カオウ インコーポレイ ティド内 (72)発明者 シルバン ゲラルド エル サビオ ビーオー ルズ バンゾン，ハサーン，ミ サミス オリエンタル カガヤン デ オ ロ シティ，ミンダナオ 9003，フィリピ ン ピリピナス カオウ インコーポレイ ティド内
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するアルカリペ
クチン酸リアーゼ。 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−
脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還
元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴ
ガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリ
ガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作
用する。 （３）最適反応 pH１１．０（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜８（３０℃、４０mMブリットン・ロ
ビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４５℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）耐熱性 約４０℃（pH７．５、１mM塩化カルシウ
ムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、２０分処理） （７）分子量 約１６kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約２７kDa） （８）等電点 pH１０．１付近（等電点電気泳動法） - 【請求項２】 下記の酵素学的性質を有するアルカリペ
クチン酸リアーゼ。 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−
脱離反応によってα−１，４結合を切断すると共に非還
元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和オリゴ
ガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 ペクチン酸（ポリガラクツロン
酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応 pH１０．５（３０℃、５０mMグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした
場合） （４）安定pH ４〜１０（３０℃、４０mMブリットン・
ロビンソン広域緩衝液中、６０分間処理） （５）最適反応温度 約４０℃（５０mMグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）分子量 約２８kDa （ゲルろ過法；ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法では約３２kDa） （７）等電点 pH１０．５付近（等電点電気泳動法） - 【請求項３】 請求項１または２記載のペクチン酸リア
ーゼを産生するバチルス属に属する微生物。 - 【請求項４】 微生物がバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ
５３９（ＦＥＲＭＰ−１５９９１）である請求項３記載
の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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