JP4382953B2 - ポリガラクツロナーゼ - Google Patents
ポリガラクツロナーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4382953B2 JP4382953B2 JP2000073581A JP2000073581A JP4382953B2 JP 4382953 B2 JP4382953 B2 JP 4382953B2 JP 2000073581 A JP2000073581 A JP 2000073581A JP 2000073581 A JP2000073581 A JP 2000073581A JP 4382953 B2 JP4382953 B2 JP 4382953B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polygalacturonase
- medium
- enzyme
- acid
- tris
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤、繊維処理剤等として有用なポリガラクツロナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチン質を分解する酵素としてはポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ等が知られており、食品工業分野ではペクチン質分解能を有効に利用し、果汁、ワイン等の清澄化、柑橘類ジュースの搾汁率の向上、果物残渣から可溶性成分の回収、みかん果皮の剥皮等にこれらの酵素を応用している。また、植物性繊維の酵素精練にはペクチン質分解酵素が古くから用いられている。さらにポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）を衣料洗剤用酵素として利用しようとする試みもあり、例えば、特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号公報等に開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
食品工業においては、一般的に作用ｐＨの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが必要とされるが、衣料用洗浄剤、繊維処理等に使用される場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、界面活性剤、キレート剤等に対し安定であることが必要とされる。更に植物性繊維においてペクチン質は不溶性ペクチンであるプロトペクチンとして存在しているため、プロトペクチンを分解する能力も必要である。
【０００４】
しかしながら、現在までに唯一知られているアルカリポリガラクツロナーゼ（特公昭４８−６５５７号公報）は好アルカリバチルスＰ−４−Ｎ株が生産し、最適反応ｐＨを１０付近に有するエンド型の酵素であるが、反応にカルシウムイオンが必須であってキレート剤耐性の低い酵素である。また、フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）株由来の酵素は、ポリガラクツロン酸を基質にした場合、最適反応ｐＨを５付近に有する。反応生成物はモノガラクツロン酸であるが、ＳＤＳにより著しく阻害されること、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛等の金属イオンによって阻害され（Maceira et al.,FEMS Microbiol. Lett., 154, 37-43, 1997）、洗浄剤用酵素としては適さない。また、セレモナス ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来の酵素は、最適反応ｐＨをｐＨ７付近に示すが、作用ｐＨならびに安定ｐＨ範囲が非常に狭いことが特徴であり、最適反応温度は４０℃付近で、反応産物はジガラクツロン酸である（Heinrichova et al.,J. Appl. Bacterol., 66, 169-174, 1989）。
【０００５】
従って本発明の目的は、中性付近に最適反応ｐＨを示し、耐界面活性剤、耐キレート剤に優れ、プロトペクチナーゼ活性を有し、アルカリ性領域でも作用するポリガラクツロナーゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素のスクリーニングを行ったところ、中性付近に最適反応ｐＨを示し、界面活性剤、キレート剤に耐性で且つアルカリ性領域においても作用するプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するポリガラクツロナーゼ、その生産菌及びその製造法を提供するものである。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約７０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のポリガラクツロナーゼは、更に次の酵素学的性質を有するものが好ましい。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約７０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９（３０℃、３０分間処理）
（５）耐熱性：約６０℃まで安定（１mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、３０分間処理）
（６）分子量：約１４５０００（ゲル濾過法）
（７）等電点：ｐＨ７．１付近（等電点電気泳動法）
（８）金属イオンの影響：キレート剤の添加によって阻害されないが、コバルト、マンガン及び銅の各イオンによって活性化される。
【０００９】
本発明のポリガラクツロナーゼは、例えばポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造できる。かかる生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ５７４株が挙げられる。
【００１０】
Ａ 形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．４〜３．２μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．６〜０．８×０．８〜１．０μｍ、中央、膨潤無し
（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず、また水酸化カリウム試験において粘性を認めず）
（ｆ）抗酸性：陰性
（ｇ）肉汁寒天培地上での生育（培地１）：乳白色、不規則状のコロニーを形成
【００１１】
Ｂ 生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地２）：＋
（ｂ）脱窒反応（培地２）：−
（ｃ）ＭＲテスト（培地３）：−
（ｄ）ＶＰテスト（培地３）：＋
（ｅ）インドール生成（培地４）：−
（ｆ）硫化水素の生成（培地５）：−
（ｇ）デンプン加水分解（培地６）：＋
（ｈ）ゼラチン加水分解（培地７）：＋
（ｉ）カゼイン加水分解（培地８）：＋
（ｊ）クエン酸の利用（培地９）：＋
（ｋ）無機窒素の利用（培地１０）：＋
（ｌ）ウレアーゼ（培地１１）：＋
（ｍ）オキシダーゼ（培地１２）：＋
（ｎ）カタラーゼ：＋
（ｏ）リトマスミルク（培地１３）：酸を産生し、ペプトン化する
（ｐ）生育温度範囲（培地１４）：１８〜５９℃
（ｑ）生育ｐＨ範囲（培地１５）：ｐＨ６〜１０
（ｒ）嫌気条件下での生育（培地１６）：生育
（ｓ）ＯＦテスト（培地１７）：−
（ｔ）グルコースからのガス産生（培地１８）：−
（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１９）：１０％で生育
（ｖ）糖からの酸生成（培地２０）：以下の糖類から酸生成が認められた。リボース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、サリシン、可溶性デンプン
【００１２】
培地１：ニュートリエントアガー（ディフコ）
培地２：ニュートリエントブロス（ディフコ）、硝酸カリウム０．１重量％
培地３：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、リン酸１水素カリウム０．５重量％、グルコース（別滅菌）０．５重量％
培地４：ＳＩＭ培地（日水製薬）、コバック試薬
培地５：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）
培地６：ニュートリエントアガー、可溶性デンプン１．０重量％
培地７：ニュートリエントアガー、ゼラチン１．０重量％
培地８：ニュートリエントアガー、カゼイン１．０重量％
培地９：Simmons培地（栄研化学）
培地１０：酵母エキス０．０５重量％、硫酸ナトリウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、グルコース（別滅菌）１．０重量％、硝酸ナトリウム０．２５重量％又は塩化アンモニウム０．１６重量％
培地１１：尿素培地（栄研化学）
培地１２：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１３：バクトリトマスミルク（ディフコ）
培地１４：ＳＣＤ培地（日本製薬）
培地１５：ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、ｐＨを調整
培地１６：アナエロビックアガー（ディフコ）
培地１７：ＯＦ基礎培地（ディフコ）
培地１８：ニュートリエントブロス、グルコース（別滅菌）１．０重量％
培地１９：ニュートリエントブロス、塩化ナトリウム２〜１０重量％
培地２０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、塩化カリウム０．０２重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、酵母エキス０．０２重量％、寒天１．５重量％、ブロモクレゾールパープル０．０００６重量％、糖類（別滅菌）１．０重量％
【００１３】
以上、ＫＳＭ−Ｐ５７４株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス リケニホルミスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス リケニホルミスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株（ＦＥＲＭ−Ｐ１７５６２）として寄託した。
【００１４】
ＫＳＭ−Ｐ５７４株等のポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。使用する炭素源、窒素源には特に制限は無く資化しうる炭素源、例えばペクチン、ペクチン酸、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコース、シュークロース、マルトース等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられる。その他リン酸塩、金属塩、有機無機微量栄養源を適宜添加することができる。培地のｐＨは、本発明の酵素生産に適したｐＨに炭酸ナトリウム等を用いて調整すれば良い。
【００１５】
かくして得られた培養液中からのポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例えば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウム（３０〜９０％飽和画分）、溶剤沈殿の例として冷アセトン（５０％以上）等の条件下において酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１６】
本発明のポリガラクツロナーゼの一例であるバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株由来のポリガラクツロナーゼは、以下のような性質を有する。
【００１７】
尚、ポリガラクツロナーゼ活性は次の測定法によった。
［標準酵素活性測定法］
試験管に０．２mLの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ６．８に調整）、０．５mLの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液（希釈は脱イオン水にて行った）を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmolのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００１８】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（２８、６７、９３％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ；ｌｏｔ１１５Ｈ３７７６、フルカ；ｌｏｔ５３９９８）を用いた場合、その反応速度は最大活性のそれぞれ９０％、８０％程度であった。エステル化度２８％のペクチン（シグマ社；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約２２％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対して約７％であったが、エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１２５Ｈ０１２３）に対しては、本条件下において分解活性は認められなかった。
次に基質として３０cmしつけ糸（金鈴印）１本（約２５mg）を用い、市販の衣料用洗剤溶液及び酵素（０．２Ｕ）を添加し、３０℃、１時間反応を行った。反応液（２mL）を遠心分離し、上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した。その結果、上記反応条件下において約１０μｇのペクチン遊離が認められた。また、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で同様の反応を行った場合、約１６μｇのペクチンの遊離が認められた。以上のことは本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに作用していると考えられ、Ａタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが示唆された（坂井、阪本、繊維工学、４５、１９、１９９２）。
【００１９】
（２）基質の分解様式
５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２mM塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの本酵素を添加し、全量を０．２５mLとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート（ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ ６０：メルク）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレートに噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてモノガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のポリガラクツロナーゼと判断された。
【００２０】
（３）最適反応ｐＨ
マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ５．０〜８．５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１１）の各緩衝液（１００mM）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、本酵素はｐＨ７．０のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した（図１）。
【００２１】
（４）最適反応温度
１００mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、５℃〜８０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は７０℃付近に最適反応温度を示し、それ以上の温度では急激に失活した。また、塩化カルシウムを反応系に添加した場合において最適反応温度は変わらなかったが、塩化カルシウム無添加系に比べて４０〜６０℃の範囲で若干の活性化が認められた（図２）。
【００２２】
（５）安定ｐＨ範囲
マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ２〜８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１１．５）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２．５）の各緩衝液（５０mM）中に酵素を加え、３０℃、３０分間恒温した後、残存活性を測定した。その結果、マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ６．０）中での残存活性を１００％とした場合、ｐＨ４〜８の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図３）。
【００２３】
（６）耐熱性
１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に酵素を添加し、５℃〜８０℃の各温度で３０分間恒温した後、残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において６０℃まで非常に安定であった。また、塩化カルシウムを添加しない場合、５０℃付近まで安定であった（図４）。
【００２４】
（７）分子量（ゲル濾過法）
１００mM塩化ナトリウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化したトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×６５cm）に本酵素を載せ約３６mL／ｈの流速で溶出を行った。標準タンパク質としてカタラーゼ（２３２０００）、アルドラーゼ（１５８０００）、牛血清アルブミン（６７０００）、卵白アルブミン（４３０００）を用い、それぞれの溶出液量と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約１４５０００と推定された。
【００２５】
（８）等電点
Ｐｈａｓｔ−ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア；ＩＥＦゲル、ｐＨ３．０〜９．０）を用いて本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸した後、ポリガラクツロン酸を含む寒天プレート［１．０％ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１．０％塩化ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．０％寒天］上に置いた。３７℃、１時間放置後、ゲルを取り去り、１．０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注いだ。約１０分後に活性に伴う溶解斑が生じた部分のタンパク質移動度と標準タンパク質（バイオラッド）の等電点と移動度から得られた検量線により本酵素の等電点は、ｐＨ７．１付近であると決定された。
【００２６】
（９）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響は、各化合物を所定濃度になるように反応系へ添加し、活性を測定することにより調べた。その結果、本酵素は調べた化合物のいずれにおいても阻害されることはなかった（表１）。
【００２７】
【表１】
【００２８】
（１０）界面活性剤の影響
各種界面活性剤を０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素活性を測定した。その結果、０．２％という高濃度の各界面活性剤の存在下においても本酵素は、対照に比べ９０％以上の活性を発現しうることが判った（表２）。
【００２９】
【表２】
【００３０】
（１１）金属塩の影響
各種金属塩を標準酵素活性測定条件に１mM添加し、酵素活性に与える影響を調べた。その結果、本酵素は塩化マンガン、塩化コバルト、塩化銅により、対照に比べ１３７〜１６５％と活性化された。一方、塩化アルミニウムにより約３５％と阻害を受けたが、その他の金属イオンにより著しい阻害を受けることはなかった（表３）。
【００３１】
【表３】
【００３２】
このように本発明のポリガラクツロナーゼは、最適反応ｐＨをｐＨ７付近、最適反応温度を７０℃付近に有し、キレート剤、界面活性剤に対し耐性であり、エキソ型の分解様式でありながら、Ａタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を示すことから、従来公知のポリガラクツロナーゼ、特にエキソポリガラクツロナーゼとは全く異なる新規な酵素である。
【００３３】
【実施例】
実施例１ ポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記の組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜５日間静置培養し、菌の生育後、冷蔵庫で冷却した。生育した菌の周辺にペクチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラツクロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株を得た。
【００３４】
【表４】
【００３５】
実施例２ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株によるポリガラクツロナーゼの生産
上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、１．５％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１．０％魚肉エキス、０．１％リン酸２水素カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、別滅菌）であった。培養液中に生産されるポリガラクツロナーゼ活性は、ｐＨ７．０のトリス−塩酸緩衝液を用いた場合０．３５〜０．４Ｕ／mLであった。この条件下において併産されるペクチン酸リアーゼ活性は、全く検出されなかった。
【００３６】
実施例３ ポリガラクツロナーゼの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株の培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分間、４℃）し上清液（２Ｌ）を得た。これを透析膜に入れポリエチレングリコール２００００（和光純薬）をまぶして内液の濃縮を行った。更に限外濾過用モジュール（ＡＩＰ１０１０：旭化成）により濃縮、脱塩を行った（１００mL）。得られた濃縮液は１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（３×１５cm：東ソー）に添着した。約５００mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、０から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（５００mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。非吸着画分には、ポリガラクツロナーゼ及び併産されるペクチン酸リアーゼの一部が溶出され、また０．１Ｍの塩化ナトリウム濃度付近には別のペクチン酸リアーゼが溶出された。そこで非吸着画分を集め（３００mL）、限外濾過（ＹＭ１０メンブレン：アミコン）により濃縮、脱塩を行った（５０mL）。これを１mMジオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（３×１５cm：東ソー）へ添着し、約２５０mLの同緩衝液にて洗浄溶出を行った。更に０から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（２５０mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、非吸着画分にポリガラクツロナーゼ活性が、吸着画分にペクチン酸リアーゼ活性がそれぞれ溶出された。そこで非吸着画分を集め（１００mL）、限外濾過（ＹＭ１０メンブレン）により濃縮を行った（５mL）。これを１００mM塩化ナトリウム、１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×７０cm：東ソー）へ載せ、約３６mL／ｈの流速で同緩衝液により溶出を行った。ポリガラクツロナーゼ活性は単一のピークとして溶出され、ペクチン酸リアーゼ活性は認められなかったため、この画分を集めた（１４mL、２０Ｕ、１２mgタンパク質）。
上記精製操作により得られたポリガラクツロナーゼ画分は、前述の酵素学的性質を示した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明のポリガラクツロナーゼは、ｐＨ７付近に最適反応ｐＨを有し、アルカリ性領域においても作用すること並びにキレート剤、各種界面活性剤に対し安定であり、またプロトペクチナーゼ活性を示すことから衣料用洗剤酵素、繊維処理用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図４】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤、繊維処理剤等として有用なポリガラクツロナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチン質を分解する酵素としてはポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ等が知られており、食品工業分野ではペクチン質分解能を有効に利用し、果汁、ワイン等の清澄化、柑橘類ジュースの搾汁率の向上、果物残渣から可溶性成分の回収、みかん果皮の剥皮等にこれらの酵素を応用している。また、植物性繊維の酵素精練にはペクチン質分解酵素が古くから用いられている。さらにポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）を衣料洗剤用酵素として利用しようとする試みもあり、例えば、特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号公報等に開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
食品工業においては、一般的に作用ｐＨの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが必要とされるが、衣料用洗浄剤、繊維処理等に使用される場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、界面活性剤、キレート剤等に対し安定であることが必要とされる。更に植物性繊維においてペクチン質は不溶性ペクチンであるプロトペクチンとして存在しているため、プロトペクチンを分解する能力も必要である。
【０００４】
しかしながら、現在までに唯一知られているアルカリポリガラクツロナーゼ（特公昭４８−６５５７号公報）は好アルカリバチルスＰ−４−Ｎ株が生産し、最適反応ｐＨを１０付近に有するエンド型の酵素であるが、反応にカルシウムイオンが必須であってキレート剤耐性の低い酵素である。また、フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）株由来の酵素は、ポリガラクツロン酸を基質にした場合、最適反応ｐＨを５付近に有する。反応生成物はモノガラクツロン酸であるが、ＳＤＳにより著しく阻害されること、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛等の金属イオンによって阻害され（Maceira et al.,FEMS Microbiol. Lett., 154, 37-43, 1997）、洗浄剤用酵素としては適さない。また、セレモナス ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来の酵素は、最適反応ｐＨをｐＨ７付近に示すが、作用ｐＨならびに安定ｐＨ範囲が非常に狭いことが特徴であり、最適反応温度は４０℃付近で、反応産物はジガラクツロン酸である（Heinrichova et al.,J. Appl. Bacterol., 66, 169-174, 1989）。
【０００５】
従って本発明の目的は、中性付近に最適反応ｐＨを示し、耐界面活性剤、耐キレート剤に優れ、プロトペクチナーゼ活性を有し、アルカリ性領域でも作用するポリガラクツロナーゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素のスクリーニングを行ったところ、中性付近に最適反応ｐＨを示し、界面活性剤、キレート剤に耐性で且つアルカリ性領域においても作用するプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するポリガラクツロナーゼ、その生産菌及びその製造法を提供するものである。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約７０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のポリガラクツロナーゼは、更に次の酵素学的性質を有するものが好ましい。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約７０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９（３０℃、３０分間処理）
（５）耐熱性：約６０℃まで安定（１mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、３０分間処理）
（６）分子量：約１４５０００（ゲル濾過法）
（７）等電点：ｐＨ７．１付近（等電点電気泳動法）
（８）金属イオンの影響：キレート剤の添加によって阻害されないが、コバルト、マンガン及び銅の各イオンによって活性化される。
【０００９】
本発明のポリガラクツロナーゼは、例えばポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造できる。かかる生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ５７４株が挙げられる。
【００１０】
Ａ 形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．４〜３．２μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．６〜０．８×０．８〜１．０μｍ、中央、膨潤無し
（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず、また水酸化カリウム試験において粘性を認めず）
（ｆ）抗酸性：陰性
（ｇ）肉汁寒天培地上での生育（培地１）：乳白色、不規則状のコロニーを形成
【００１１】
Ｂ 生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地２）：＋
（ｂ）脱窒反応（培地２）：−
（ｃ）ＭＲテスト（培地３）：−
（ｄ）ＶＰテスト（培地３）：＋
（ｅ）インドール生成（培地４）：−
（ｆ）硫化水素の生成（培地５）：−
（ｇ）デンプン加水分解（培地６）：＋
（ｈ）ゼラチン加水分解（培地７）：＋
（ｉ）カゼイン加水分解（培地８）：＋
（ｊ）クエン酸の利用（培地９）：＋
（ｋ）無機窒素の利用（培地１０）：＋
（ｌ）ウレアーゼ（培地１１）：＋
（ｍ）オキシダーゼ（培地１２）：＋
（ｎ）カタラーゼ：＋
（ｏ）リトマスミルク（培地１３）：酸を産生し、ペプトン化する
（ｐ）生育温度範囲（培地１４）：１８〜５９℃
（ｑ）生育ｐＨ範囲（培地１５）：ｐＨ６〜１０
（ｒ）嫌気条件下での生育（培地１６）：生育
（ｓ）ＯＦテスト（培地１７）：−
（ｔ）グルコースからのガス産生（培地１８）：−
（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１９）：１０％で生育
（ｖ）糖からの酸生成（培地２０）：以下の糖類から酸生成が認められた。リボース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、サリシン、可溶性デンプン
【００１２】
培地１：ニュートリエントアガー（ディフコ）
培地２：ニュートリエントブロス（ディフコ）、硝酸カリウム０．１重量％
培地３：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、リン酸１水素カリウム０．５重量％、グルコース（別滅菌）０．５重量％
培地４：ＳＩＭ培地（日水製薬）、コバック試薬
培地５：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）
培地６：ニュートリエントアガー、可溶性デンプン１．０重量％
培地７：ニュートリエントアガー、ゼラチン１．０重量％
培地８：ニュートリエントアガー、カゼイン１．０重量％
培地９：Simmons培地（栄研化学）
培地１０：酵母エキス０．０５重量％、硫酸ナトリウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、グルコース（別滅菌）１．０重量％、硝酸ナトリウム０．２５重量％又は塩化アンモニウム０．１６重量％
培地１１：尿素培地（栄研化学）
培地１２：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１３：バクトリトマスミルク（ディフコ）
培地１４：ＳＣＤ培地（日本製薬）
培地１５：ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、ｐＨを調整
培地１６：アナエロビックアガー（ディフコ）
培地１７：ＯＦ基礎培地（ディフコ）
培地１８：ニュートリエントブロス、グルコース（別滅菌）１．０重量％
培地１９：ニュートリエントブロス、塩化ナトリウム２〜１０重量％
培地２０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、塩化カリウム０．０２重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、酵母エキス０．０２重量％、寒天１．５重量％、ブロモクレゾールパープル０．０００６重量％、糖類（別滅菌）１．０重量％
【００１３】
以上、ＫＳＭ−Ｐ５７４株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス リケニホルミスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス リケニホルミスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株（ＦＥＲＭ−Ｐ１７５６２）として寄託した。
【００１４】
ＫＳＭ−Ｐ５７４株等のポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。使用する炭素源、窒素源には特に制限は無く資化しうる炭素源、例えばペクチン、ペクチン酸、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコース、シュークロース、マルトース等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられる。その他リン酸塩、金属塩、有機無機微量栄養源を適宜添加することができる。培地のｐＨは、本発明の酵素生産に適したｐＨに炭酸ナトリウム等を用いて調整すれば良い。
【００１５】
かくして得られた培養液中からのポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例えば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウム（３０〜９０％飽和画分）、溶剤沈殿の例として冷アセトン（５０％以上）等の条件下において酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１６】
本発明のポリガラクツロナーゼの一例であるバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株由来のポリガラクツロナーゼは、以下のような性質を有する。
【００１７】
尚、ポリガラクツロナーゼ活性は次の測定法によった。
［標準酵素活性測定法］
試験管に０．２mLの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ６．８に調整）、０．５mLの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液（希釈は脱イオン水にて行った）を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmolのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００１８】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（２８、６７、９３％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ；ｌｏｔ１１５Ｈ３７７６、フルカ；ｌｏｔ５３９９８）を用いた場合、その反応速度は最大活性のそれぞれ９０％、８０％程度であった。エステル化度２８％のペクチン（シグマ社；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約２２％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対して約７％であったが、エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１２５Ｈ０１２３）に対しては、本条件下において分解活性は認められなかった。
次に基質として３０cmしつけ糸（金鈴印）１本（約２５mg）を用い、市販の衣料用洗剤溶液及び酵素（０．２Ｕ）を添加し、３０℃、１時間反応を行った。反応液（２mL）を遠心分離し、上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により定量した。その結果、上記反応条件下において約１０μｇのペクチン遊離が認められた。また、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で同様の反応を行った場合、約１６μｇのペクチンの遊離が認められた。以上のことは本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに作用していると考えられ、Ａタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが示唆された（坂井、阪本、繊維工学、４５、１９、１９９２）。
【００１９】
（２）基質の分解様式
５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２mM塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの本酵素を添加し、全量を０．２５mLとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート（ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ ６０：メルク）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレートに噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてモノガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のポリガラクツロナーゼと判断された。
【００２０】
（３）最適反応ｐＨ
マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ５．０〜８．５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１１）の各緩衝液（１００mM）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、本酵素はｐＨ７．０のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した（図１）。
【００２１】
（４）最適反応温度
１００mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、５℃〜８０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は７０℃付近に最適反応温度を示し、それ以上の温度では急激に失活した。また、塩化カルシウムを反応系に添加した場合において最適反応温度は変わらなかったが、塩化カルシウム無添加系に比べて４０〜６０℃の範囲で若干の活性化が認められた（図２）。
【００２２】
（５）安定ｐＨ範囲
マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ２〜８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１１．５）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２．５）の各緩衝液（５０mM）中に酵素を加え、３０℃、３０分間恒温した後、残存活性を測定した。その結果、マックルベイン氏緩衝液（ｐＨ６．０）中での残存活性を１００％とした場合、ｐＨ４〜８の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図３）。
【００２３】
（６）耐熱性
１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に酵素を添加し、５℃〜８０℃の各温度で３０分間恒温した後、残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において６０℃まで非常に安定であった。また、塩化カルシウムを添加しない場合、５０℃付近まで安定であった（図４）。
【００２４】
（７）分子量（ゲル濾過法）
１００mM塩化ナトリウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化したトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×６５cm）に本酵素を載せ約３６mL／ｈの流速で溶出を行った。標準タンパク質としてカタラーゼ（２３２０００）、アルドラーゼ（１５８０００）、牛血清アルブミン（６７０００）、卵白アルブミン（４３０００）を用い、それぞれの溶出液量と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約１４５０００と推定された。
【００２５】
（８）等電点
Ｐｈａｓｔ−ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア；ＩＥＦゲル、ｐＨ３．０〜９．０）を用いて本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸した後、ポリガラクツロン酸を含む寒天プレート［１．０％ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１．０％塩化ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．０％寒天］上に置いた。３７℃、１時間放置後、ゲルを取り去り、１．０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注いだ。約１０分後に活性に伴う溶解斑が生じた部分のタンパク質移動度と標準タンパク質（バイオラッド）の等電点と移動度から得られた検量線により本酵素の等電点は、ｐＨ７．１付近であると決定された。
【００２６】
（９）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響は、各化合物を所定濃度になるように反応系へ添加し、活性を測定することにより調べた。その結果、本酵素は調べた化合物のいずれにおいても阻害されることはなかった（表１）。
【００２７】
【表１】
（１０）界面活性剤の影響
各種界面活性剤を０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素活性を測定した。その結果、０．２％という高濃度の各界面活性剤の存在下においても本酵素は、対照に比べ９０％以上の活性を発現しうることが判った（表２）。
【００２９】
【表２】
（１１）金属塩の影響
各種金属塩を標準酵素活性測定条件に１mM添加し、酵素活性に与える影響を調べた。その結果、本酵素は塩化マンガン、塩化コバルト、塩化銅により、対照に比べ１３７〜１６５％と活性化された。一方、塩化アルミニウムにより約３５％と阻害を受けたが、その他の金属イオンにより著しい阻害を受けることはなかった（表３）。
【００３１】
【表３】
このように本発明のポリガラクツロナーゼは、最適反応ｐＨをｐＨ７付近、最適反応温度を７０℃付近に有し、キレート剤、界面活性剤に対し耐性であり、エキソ型の分解様式でありながら、Ａタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を示すことから、従来公知のポリガラクツロナーゼ、特にエキソポリガラクツロナーゼとは全く異なる新規な酵素である。
【００３３】
【実施例】
実施例１ ポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記の組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜５日間静置培養し、菌の生育後、冷蔵庫で冷却した。生育した菌の周辺にペクチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラツクロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株を得た。
【００３４】
【表４】
実施例２ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株によるポリガラクツロナーゼの生産
上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、１．５％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１．０％魚肉エキス、０．１％リン酸２水素カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６、別滅菌）であった。培養液中に生産されるポリガラクツロナーゼ活性は、ｐＨ７．０のトリス−塩酸緩衝液を用いた場合０．３５〜０．４Ｕ／mLであった。この条件下において併産されるペクチン酸リアーゼ活性は、全く検出されなかった。
【００３６】
実施例３ ポリガラクツロナーゼの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４株の培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分間、４℃）し上清液（２Ｌ）を得た。これを透析膜に入れポリエチレングリコール２００００（和光純薬）をまぶして内液の濃縮を行った。更に限外濾過用モジュール（ＡＩＰ１０１０：旭化成）により濃縮、脱塩を行った（１００mL）。得られた濃縮液は１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（３×１５cm：東ソー）に添着した。約５００mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、０から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（５００mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。非吸着画分には、ポリガラクツロナーゼ及び併産されるペクチン酸リアーゼの一部が溶出され、また０．１Ｍの塩化ナトリウム濃度付近には別のペクチン酸リアーゼが溶出された。そこで非吸着画分を集め（３００mL）、限外濾過（ＹＭ１０メンブレン：アミコン）により濃縮、脱塩を行った（５０mL）。これを１mMジオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（３×１５cm：東ソー）へ添着し、約２５０mLの同緩衝液にて洗浄溶出を行った。更に０から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（２５０mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、非吸着画分にポリガラクツロナーゼ活性が、吸着画分にペクチン酸リアーゼ活性がそれぞれ溶出された。そこで非吸着画分を集め（１００mL）、限外濾過（ＹＭ１０メンブレン）により濃縮を行った（５mL）。これを１００mM塩化ナトリウム、１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×７０cm：東ソー）へ載せ、約３６mL／ｈの流速で同緩衝液により溶出を行った。ポリガラクツロナーゼ活性は単一のピークとして溶出され、ペクチン酸リアーゼ活性は認められなかったため、この画分を集めた（１４mL、２０Ｕ、１２mgタンパク質）。
上記精製操作により得られたポリガラクツロナーゼ画分は、前述の酵素学的性質を示した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明のポリガラクツロナーゼは、ｐＨ７付近に最適反応ｐＨを有し、アルカリ性領域においても作用すること並びにキレート剤、各種界面活性剤に対し安定であり、またプロトペクチナーゼ活性を示すことから衣料用洗剤酵素、繊維処理用酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図４】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
Claims (3)
- 次の酵素学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６２）由来のポリガラクツロナーゼ。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約７０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９（３０℃、３０分間処理）
（５）耐熱性：約６０℃まで安定（１mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、３０分間処理）
（６）分子量：約１４５０００（ゲル濾過法）
（７）等電点：ｐＨ７．１付近（等電点電気泳動法）
（８）金属イオンの影響：キレート剤の添加によって阻害されないが、コバルト、マンガン及び銅の各イオンによって活性化される。 - 請求項１記載のポリガラクツロナーゼを生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ５７４（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６２）。
- 請求項２記載の微生物を培養し、培養物から請求項１記載のポリガラクツロナーゼを採取するポリガラクツロナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000073581A JP4382953B2 (ja) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | ポリガラクツロナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000073581A JP4382953B2 (ja) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | ポリガラクツロナーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001258552A JP2001258552A (ja) | 2001-09-25 |
| JP4382953B2 true JP4382953B2 (ja) | 2009-12-16 |
Family
ID=18591807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000073581A Expired - Fee Related JP4382953B2 (ja) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | ポリガラクツロナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4382953B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100966758B1 (ko) * | 2002-03-01 | 2010-06-30 | 라이온 가부시키가이샤 | 제균처리 방법, 제균세정제 조성물 및 세탁 방법 |
-
2000
- 2000-03-16 JP JP2000073581A patent/JP4382953B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001258552A (ja) | 2001-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2859393B2 (ja) | セルラーゼ及びその製造法 | |
| Esawy et al. | Characterization of extracellular dextranase from a novel halophilic Bacillus subtilis NRC-B233b a mutagenic honey isolate under solid state fermentation | |
| JP3917258B2 (ja) | 新規アルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法 | |
| Oh et al. | Isolation, purification, and enzymatic characterization of extracellular chitosanase from marine bacterium Bacillus subtilis CH2 | |
| JP4382953B2 (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
| JP4139537B2 (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
| JPH03108482A (ja) | α―アミラーゼ活性を有する新規なアルカリプルラナーゼＹ、これを産生する微生物及び新規なアルカリプルラナーゼＹの製造法 | |
| JP5685398B2 (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
| JP4382952B2 (ja) | エキソポリガラクツロナーゼ | |
| JP4382951B2 (ja) | アルカリエキソポリガラクツロナーゼ | |
| JP4139538B2 (ja) | アルカリエキソポリガラクツロナーゼ | |
| JP3544383B2 (ja) | アルカリに安定なサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 | |
| KR0127099B1 (ko) | 신균주 바실러스 속(Bacillus sp.) NS-70(KCTC 8555P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법 | |
| JPH0472397A (ja) | 自動食器洗浄機用洗浄剤組成物 | |
| JP2863607B2 (ja) | アミラーゼ及びその製造法 | |
| JP2731212B2 (ja) | 新規セルラーゼ及びその製造法 | |
| JP2863602B2 (ja) | アミラーゼ及びその製造法 | |
| JP2676453B2 (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
| JP3729910B2 (ja) | アルカリα−アミラーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリα−アミラーゼの製造法 | |
| JPH0472398A (ja) | 自動食器洗浄機用洗浄剤組成物 | |
| JPH0630578B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼｋ | |
| JP3820617B2 (ja) | ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素とそれを用いた低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンの製造法 | |
| JP2894292B2 (ja) | ガラクタナーゼｓ−２及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−２ | |
| JPH11318443A (ja) | アルカリペクチン酸リアーゼ | |
| JPH01228465A (ja) | 新規なβ−アガラーゼ及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060803 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060803 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090714 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090819 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090915 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090918 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121002 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121002 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131002 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |