JP5685398B2 - ポリガラクツロナーゼ - Google Patents
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Description
食品工業においては、一般的に作用pHの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが必要とされるが、衣料用洗浄剤、繊維処理等に使用される場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、界面活性剤、キレート剤等に対し安定であることが必要とされる。
一方、近年では中性付近に最適反応pHを示し、耐界面活性剤、耐キレート剤性能に優れ、中性からアルカリ性領域でも作用するポリガラクツロナーゼについても報告されている(特許文献6〜11)。しかしながら、これらのポリガラクツロナーゼはいずれもエキソ型であることから、メチルエステル化等の修飾を受けた基質に対する反応性は著しく低下する。
[1]下記の酵素学的性質を有するポリガラクツロナーゼ。
(1)作用:ポリガラクツロン酸に作用し、ポリガラクツロン酸のα−1,4結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
(2)最適反応pH:pH7付近(トリス−塩酸緩衝液)
(3)最適反応温度:約40〜50℃(トリス−塩酸緩衝液、pH7.0)
(4)分子量:約52000(ゲル濾過法)
[2]エピリソニモナス属細菌由来である[1]のポリガラクツロナーゼ。
[3]エピリソニモナス属細菌がエピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)である[2]のポリガラクツロナーゼ。
[4]更に、下記(5)〜(7)から選択される1以上の酵素学的性質を有する[1]〜[3]のポリガラクツロナーゼ。
(5)pH安定性:pH3.5〜7.0(30℃、30分間処理)
(6)耐熱性:約50℃まで安定(トリス−塩酸緩衝液、pH7.0、15分間処理)
(7)金属イオンの影響:キレート剤の添加によって阻害されないが、カルシウム、鉄、マグネシウム、ストロンチウム及びアルミニウムによって活性化される。
[5][1]のポリガラクツロナーゼを産生するエピリソニモナス属細菌。
[6]エピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)である[5]の細菌。
[7]エピリソニモナス属細菌を培養し、培養物からポリガラクツロナーゼを採取することを特徴とする[1]のポリガラクツロナーゼの製造法。
[8]エピリソニモナス属細菌がエピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)である[7]のポリガラクツロナーゼの製造法。
[9]ポリガラクツロン酸又はペクチンに、[1]〜[4]のポリガラクツロナーゼを作用させることを特徴とするモノ及びオリゴガラクツロン酸の製造法。
(1)作用:
ポリガラクツロン酸(ペクチン酸)に作用し、ポリガラクツロン酸のα−1,4結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
また、ペクチンに対しては、エステル化度30%のペクチンでは約160%、エステル化度60%のペクチンに対しては約60%の反応速度でこれを分解する。
(2)最適反応pH:
pH7.0のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、また、pH5.5〜8.0の広範囲で最大活性の50%以上の活性を示す(図1)。従って、最適反応pHは、6.0〜7.5、すなわちpH7付近(トリス−塩酸緩衝液)である。
(3)最適反応温度:
トリス−塩酸緩衝液(pH7.0)中で酵素反応を行った場合、約40〜50℃、すなわち40℃付近に最適反応温度を示す。また、25℃〜55℃の範囲で最大活性の50%以上の活性を示す。
また、塩化カルシウムを反応系に添加すると最適反応温度は変わらないが、40〜50℃での相対活性が増加する(図2)。
(4)分子量:
ゲル濾過法(塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(pH7.0)にて平衡化したTSK−GEL G2000SWXLを用い、1mL/minの流速で溶出)により測定した推定分子量は、50000〜54000、すなわち約52000である。
(5)pH安定性:
各緩衝液(pH2〜8.5)中、30℃、30分間恒温した後の残存活性は、マックルベイン氏緩衝液(pH6.5)中での残存活性を100%とした場合、pH3.5〜7.0の範囲で70%以上である(図3)。すなわち、pH安定性は、pH3.5〜7.0(30℃、30分間処理)である。
(6)耐熱性:
トリス−塩酸緩衝液(pH7.0)中、0℃〜80℃の各温度で15分間恒温した場合、約50℃まで安定である(図4)。
また、各温度において塩化カルシウムを添加しても酵素の安定性には影響を与えない。
(7)金属イオンの影響:
キレート剤(例えばEDTA)の添加によって阻害されず、カルシウム、鉄、マグネシウム、ストロンチウム及びアルミニウムによって活性化される(表1、表3)。
(8)界面活性剤の影響
陽イオン界面活性剤(0.2%(w/v))の存在下においても安定である(表2)。
例えば、ポリオキシエチレン(8)ラウリルエーテル0.2%含有液中で166%以上の活性を保持する。
さらに、本発明のポリガラクツロナーゼは中性からアルカリ領域おいて、不溶性天然ペクチンであるプロトペクチンに作用することから、不溶性ペクチンを基質としたペクチン分解物の製造、植物性繊維上のプロトペクチンに付着した汚れや、ケチャップ、ジャム等の不溶性ペクチン含量の高い食物の食べこぼしや染み汚れの除去に有効である。
本発明のポリガラクツロナーゼを生産する菌としては、エピリソニモナス属に属する細菌、例えばエピリソニモナス KSM−P810株を挙げることができる。当該エピリソニモナス KSM−P810株は次の菌学的性質を有する。
A 形態学的性質
(a)細胞の形、大きさ:桿菌(0.8〜0.9×1.5〜3.0μm)
(b)運動性:無し
(c)グラム染色:陰性
(d)肉汁寒天培地上での生育:黄色、全縁のコロニーを形成
B 生理学的性質
(a)硝酸塩の還元:−
(b)インドール生成:+
(c)デンプン加水分解:−
(d)ゼラチン加水分解:−
(e)エスクリン加水分解:+
(f)クエン酸の利用:−
(g)ウレアーゼ:−
(h)オキシダーゼ:+
(i)カタラーゼ:+
(j)生育温度範囲:4〜30℃
(k)嫌気条件下での生育:生育せず
(l)OFテスト:−
(m)グルコースからのガス産生:−
(n)資化性:グルコース、マルトースの資化は認められたが、L-アラビノース、D-マンノース、D-マンニトール、N-アセチル-D-グルコサミン、グルコン酸カリウム、n-カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸ナトリウムおよび酢酸フェニルの資化は認められなかった。
エピリソニモナス KSM−P810株由来のポリガラクツロナーゼの詳細な酵素学的性質を実施例4に記載した。
ここで、オリゴガラクツロン酸としては、ガラクツロン酸が2〜8個結合したものが挙げられる。
本発明のポリガラクツロナーゼと原料との酵素反応は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができるが、例えばペクチン又はポリガラクツロン酸を水又は緩衝液に溶解又は懸濁させ、これにポリガラクツロナーゼを作用させることや、ポリガラクツロナーゼを不溶性固定化担体に結合させて、これにペクチン又はポリガラクツロン酸を流下させること等により行うことができる。
尚、原料であるペクチン又はペクチン酸は、植物由来のものであれば種類は問わず、植物体からの抽出等により調製できる、或いは調製されたものを購入することもできる。
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを、下記組成の寒天平板培地に塗布した。30℃の培養器で3〜5日間静置培養した。菌の生育後、0.2%(w/v)ポリガラクツロン酸、0.1%リン酸1水素カリウム、1%塩化ナトリウム、50mMEDTA、50mMトリス−塩酸塩緩衝液(pH8.0)0.8%寒天からなる軟寒天を重層し、室温で一夜恒温した。重層した軟寒天上に1%セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注ぎ、室温で1時間放置後、生育した菌の周辺にペクチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてエピリソニモナス KSM−P810株を得た。当該菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへエピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)として寄託した。
上述のスクリーニングにより得られたエピリソニモナス KSM−P810株の培養は、500mL容坂口フラスコに50mLの培地を加え、30℃、2日間好気的に行った。培地組成は、0.5%(w/v)ペクチン、2.0%ポリペプトンS、0.5%酵母エキス、1.0%魚肉エキス、0.15%リン酸一水素二カリウム、0.02%硫酸マグネシウム7水塩、0.005%硫酸マンガン5水塩であった。培養液中に生産されるポリガラクツロナーゼ活性は、5mM EDTAを添加しペクチン酸リアーゼ活性を完全に失活させて測定を行った。この測定法により、培養液あたり0.1〜0.2U/Lの生産量を得た。
エピリソニモナス KSM−P810株の培養液を遠心分離(8000×g、30分間、4℃)し上清液(約3L)を得た。上清400mLずつに対して、氷上で超音波破砕(SEIKO I&E SONICS&MATERIALS,BIOMC7500 ULTRASONIC PROCESSOR,MODE:PULSED,%DUTY CYCLE:50,OUTPUT CONTROL:6,時間:15分×1回)を行った。破砕液を遠心分離(8000×g、30分間、4℃)で回収し、ポリエチレンイミン溶液を終濃度が0.04%となるように攪拌しながら添加し、再び遠心分離(8000×g、30分間、4℃)を行った。得られた上清に対し、フェニルメタンスルホニルフルオリド溶液を終濃度1mMとなるように、塩化カルシウム溶液を終濃度50mMとなるように添加・攪拌後、再び遠心分離(8000×g、30分間、4℃)を行った。得られた上清は限外濾過用モジュール(ACP1010:旭化成)により濃縮、脱塩を行った。得られた濃縮液(455mL)は1mMジチオスレイトールを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)にて平衡化しておいたSuperQトヨパール650Mカラム(5×7cm:東ソー)に供した。約300mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた。非吸着部分にポリガラクツロナーゼ活性が溶出された。得られた非吸着画分は限外濾過用モジュール(ACP1010:旭化成)により濃縮(72mL)を行った。そのうち20mLを用いて、P6−DG脱塩カラム(2.5cm×30cm:バイオラッド)を用いて5mMリン酸緩衝液(pH6.8)に置換を行い、同緩衝液にて平衡化したヒドロキシアパタイトCHT−IIカラム(1.5cm×13.5cm:バイオラッド)に添着させた。平衡化緩衝液にて洗浄した後、5から500mMリン酸緩衝液(pH6.8)を用い吸着タンパク質を濃度勾配法にて溶出させた。エンド型ポリガラクツロナーゼ活性は約100mMのリン酸緩衝液濃度付近に溶出され、その画分を集め、限外濾過により濃縮し、予め10mMトリス−塩酸緩衝液で平行化しておいたP10−DGカラム(バイオラッド)により緩衝液置換を行った。(4mL、37.1U、690μgタンパク質)。
実施例3の精製操作により得られたポリガラクツロナーゼ画分について、各種酵素学的性質を測定した。
なお、ポリガラクツロナーゼ活性の測定は、以下のように行った。
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に0.2mLの0.5Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)、0.2mLの1%(w/v)ポリガラクツロン酸(ICNバイオメディカル;lot14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH6.8に調整)、0.5mLの脱イオン水を添加し、40℃で5分間恒温した。これに0.1mLの適当に希釈した酵素液(希釈は脱イオン水により行った)を加え30分間反応させた後、1mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で5分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、4mLの脱イオン水を加え535nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素1単位(1U)は、上記反応条件下において1分間に1μmol のD−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン(30、60、90%)を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。エステル化度30%のペクチン(シグマ;lot118K0974)では約160%、エステル化度60%のペクチン(シグマ;lot069K0976)に対しては約60%の反応速度で分解したが、エステル化度90%のペクチン(シグマ;lot18K1650)に対しては、本条件下で分解活性は認められなかった。次に基質として15cmのしつけ糸(金鈴印)1本(約12mg)を基質に用い40℃で1時間の反応を行った後、上清を液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果、反応生成物としてモノ・ジ・トリガラクツロン酸が検出されたことから本酵素は、木綿繊維中に含まれるプロトペクチンに作用できるプロトペクチナーゼ活性を有すると考えられた。
100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)、0.2%ポリガラクツロン酸、5mM EDTAからなる反応液に0.05Uの酵素を添加し、全量を0.1mLとした。40℃、60分間反応させた液を液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果、反応生成物としてジ・トリガラクツロン酸及び、それ以上の溶出時間帯にもピークが検出され、本酵素はエンド型のポリガラクツロナーゼであった。
酢酸緩衝液(pH4.5〜5.5)、トリス−塩酸緩衝液(pH6.0〜8.0)、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0〜10.0)、MOPS緩衝液(pH6.0〜8.0)の各緩衝液(100mM)を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH7.0のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、また、pH5.5〜8.0の広範囲で最大活性の50%以上の活性を示した(図1)。
100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)中、20℃〜80℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた結果、本酵素は40℃付近に最適反応温度を示し、25℃〜55℃の範囲で最大活性の50%以上の活性を示した。また、1mMの塩化カルシウムを反応系に添加すると最適反応温度は変わらないが、40〜50℃での相対活性が増加した(図2)。
マックルベイン氏緩衝液(pH2〜8)、酢酸緩衝液(pH4〜5)、トリス−塩酸緩衝液(pH6.5〜8.5)の各緩衝液(50mM)中に本酵素を加え、30℃、30分間恒温した後、残存活性を測定した結果、本酵素はマックルベイン氏緩衝液(pH6.5)中での残存活性を100%とした場合、pH3.5〜7.0の範囲で70%以上の残存活性を示した(図3)。
50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)中に本酵素を添加し、0℃〜80℃の各温度で15分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において40℃まで非常に安定であり、60℃以上で急激に失活した(図4)。尚、各温度において1mMの塩化カルシウムを添加しても酵素の安定性には影響を与えなかった。
ゲル濾過法:300mM塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて平衡化したTSK−GEL G2000SWXL(7.8×30mm)に本酵素を載せ、1mL/minの流速で溶出を行った。標準タンパク質としてチログロブリン(670000)、γ−グロブリン(158000)、卵白アルブミン(44000)、ミオグロビン(17000)、ビタミンB12(1350)を用い、それぞれの溶出液量と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約52000と推定された。
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響は、各化合物を所定濃度になるよう反応系へ添加し、活性測定を行うことにより調べた結果、本酵素は、ジエチルピロカーボネート(1.0mM)で約44%、N−エチルマレイミド(1mM)で約20%阻害されたが、その他の修飾剤やキレート剤には耐性を示した(表1)。
各種界面活性剤を0.2%(w/v)になるように添加した反応系において、酵素の反応性を調べた結果、陰イオン界面活性剤の存在下では著しく活性が阻害されたが、陽イオン界面活性剤の存在下において、本酵素は、対象に比べ130〜170%以上の活性を発現した(表2)。
各種金属化合物を標準活性測定条件に1mM添加し、酵素活性に与える影響を調べた。その結果、本酵素は塩化カルシウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム、塩化アルミニウムにより、対照に比べて117〜153%と活性化された。一方、塩化ニッケルで約40%、塩化マンガンと塩化コバルトで約60%、塩化亜鉛で80%の阻害を受けた(表3)。
Claims (5)
- 下記の酵素学的性質を有するエピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)由来のポリガラクツロナーゼ。
(1)作用:ポリガラクツロン酸に作用し、ポリガラクツロン酸のα−1,4結合をエンド的に加水分解し、オリゴガラクツロン酸を生成する。
(2)最適反応pH:pH7付近(トリス−塩酸緩衝液)
(3)最適反応温度:40℃〜50℃(トリス−塩酸緩衝液、pH7.0)
(4)分子量:約52000(ゲル濾過法) - 更に、下記(5)〜(7)から選択される1以上の酵素学的性質を有する請求項1記載のポリガラクツロナーゼ。
(5)pH安定性:pH3.5〜7.0(30℃、30分間処理)
(6)耐熱性:約50℃まで安定(トリス−塩酸緩衝液、pH7.0、15分間処理)
(7)金属イオンの影響:キレート剤の添加によって阻害されないが、カルシウム、鉄、マグネシウム、ストロンチウム及びアルミニウムによって活性化される。 - 請求項1記載のポリガラクツロナーゼを産生する、エピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)であるエピリソニモナス属細菌。
- エピリソニモナス KSM−P810(Epilithonimonas sp. KSM−P810;FERM P-21933)であるエピリソニモナス属細菌を培養し、培養物からポリガラクツロナーゼを採取することを特徴とする請求項1記載のポリガラクツロナーゼの製造法。
- ポリガラクツロン酸又はペクチンに、請求項1又は2記載のポリガラクツロナーゼを作用させることを特徴とするモノ及びオリゴガラクツロン酸の製造法。
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